フィブリン塊における同種間葉系幹細胞の注入によってウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療

要約

ウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療のための実験技術が記載されている。骨軟骨欠損に同種間葉系幹細胞の移植は、組織工学の分野で有望な開発を提供しています。フィブリン細胞塊の準備 in vitroで移植のための標準化された方法を提供しています。

要約

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface ¹. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential ². In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established ^3-6.

Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface ^3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.

New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation ^9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone ¹¹.

The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering ^5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing ¹².

Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity ¹¹.

Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential ^13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.

In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results ^1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies ^19-21 and even first human trials ²².

The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

プロトコル

間葉系幹細胞の単離のためのドナーウサギのA.準備（手術室）

1. 細胞はオス4ヶ月歳の時にニュージーランドホワイト（NZW）ウサギ、約3キロ体重から分離されています。
2. プロポフォールで麻酔（10 mg / kg体重体重IV）を誘導し、ペントバルビタールナトリウム（100 mg / kg体重体重IV）を生け贄に捧げる。
3. 電気クリッパー、真空毛皮で後肢、背中と腹から毛皮を剃る。
4. 70％エタノールで完全に剃毛した領域を消毒する。
5. 鈍鉗子、鋭いハサミ（またはメス）と組織や靭帯のための骨のカッターを使用してください。
6. 足とふくらはぎの頭蓋の表面に沿って切開を行います。
7. どちら鋭いまたは鈍的切開によって皮膚や皮下組織を反映しています。
8. 脛骨と大腿骨とは別の筋肉や靭帯。きれいな解剖を行うことが可能のような骨の近くにカットしてください。この時点で脛骨から大腿骨を分離しないでください。
9. THRをカットウワーッ寛骨臼から大腿骨頭を分離する股関節。
10. 脛骨 - 大腿骨複合体を昇格。
11. 骨から残りの軟部組織を掻きまたは滅菌布の組織と骨をこするように手術用メスの刃を使用します。この時点で、大腿骨および脛骨はまだ接続されている。
12. 切断することにより膝蓋骨を外し、その後最終的に独立した骨に膝関節の靭帯を切った。
13. スプレーは、空気が乾燥させ、70％エタノールで骨を分離し、それらの潤いを保つために、細胞培養培地（DMEM + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン））で50 ml遠心チューブに各ボーンを配置。
14. 今無菌細胞培養層流フードの下に切り替える。

骨と拡張からウサギMSCのフラッシュB.（細胞培養フッド）

1. チューブからの骨を収集し、滅菌ピンセットを使用して150ミリメートル皿にそれらを配置します。
2. 両方の骨を取り除き、新しい150ミリメートル皿に無菌のこぎり、移動部分で終わる。
3. メディとを10mlの注射器を埋めるUM（DMEM）、18ゲージの針を取り付け、骨髄の開口部に挿入します。
4. その後、皿に骨髄をフラッシュする媒体と骨髄腔をすすいでください。可能であればその後、もう一方の端からすすいでください。必要に応じて、両端から多くを見送った。骨が壊れるべき場合は、単に骨の内部をすすいでください。
5. シリンジに細胞培地懸濁液を吸引除去し、サスペンションは骨髄腔と骨髄血栓が表示されない、さらに骨を通して自由に浮遊するまで繰り返し骨髄をすすいでください。
6. 一度骨髄はすべて骨から収集された、18ゲージの針を通過することによって骨髄塊を乱す：針付属とシリンジを記入し、培地中に追い出す。
7. その後、50ミリリットルチューブに細胞フィルターを通してサスペンションをフィルタリング。セル損失を防止するために10mlの培地で培養皿の2倍を洗浄し、同様にこむ。
8. 室温で5分間、500×gでサスペンションを遠心分離。
9. 清と再懸セルペルを削除らを10mlの培地（DMEM + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）であった。
10. Biocoll分離ソリューションを使用して、末梢血単核細胞（PBMC）及び間葉系幹細胞（MSC）から独立した血液細胞。
11. を15mlチューブにBiocoll分離溶液5mlを記入し、慎重に室温で20分（ブレーキなし）のために800 xgで上部と遠心分離機に細胞懸濁液を5ミリリットルを追加します。
12. PBMCと間葉系幹細胞は、界面でのままBiocoll、底まで赤血球堆積物よりも高密度であること：可能な結果は、 図1を参照してください。
13. 慎重を15mlチューブにインターフェイスを削除し、5 mlのPBSで洗浄する。
14. ステップ22で説明したように、遠心5ミリリットルのPBSに再懸と2〜3倍を繰り返す。
15. その後、室温で10分（ブレーキ付）、350 xgで再び遠心。
16. を10mlの培地に再懸濁し、血球のセルを数える。
17. 150ミリメートルの皿で約5×10 ⁶の初期の播種密度でプレート細胞。
18. 2-3日後、再非接着細胞を移動します。あなたは、細胞の破片を除去するためにPBS最初ですすぎが必要になる場合があります。その後、新鮮な完全培地（DMEM + 10％ウシ胎児血清（FCS）+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）を追加する。
19. 3〜4日ごとに（ 図2）の細胞を養う。
20. 5-10日後、経過初めて細胞。

in vitroでフィブリン塊のC.の準備

1. 移植の日には、0.25％トリプシン-EDTAに3分露出でフラスコ/皿から接着細胞を解放。完全培地を追加することで、トリプシン処理を停止します。
2. 50ミリリットルファルコンチューブで細胞を配布し、PBSで2回、それらを洗ってください。
3. トリパンブルー染色により細胞の生存と数字を決定します。
4. 50,000細胞/マイクロ遠心チューブを追加し、室温で5分間、500×gで遠心分離によりペレットを収集します。必要に応じて、少なくとももう1つの塊のためにマスターミックスを準備します。
5. 17μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、TISSUのフィブリノゲン成分を25μlのを混ぜてこの17μlのMSCサスペンションとCOL-キット。
6. in vivoでのドリル穴（ 図3）に基づき、事前ドリル穴（3x3.6ミリ）で滅菌プレートを取る。
7. まず、一番上に42μlのフィブリノゲン - 細胞懸濁し、再び4μl​​のトロンビン溶液の即時加え、続いて一つの穴の中に4μlのトロンビン溶液（500 IU / ml）を接種。ピペットチップ内凝固を避けるために、サスペンションを混在させないでください。まず、分取フィブリノーゲン細胞懸濁液50μlの体積は、表面張力により溶融せずにプレドリル穴の縁に突出します。しかし、完全に凝固した後（60分後）血栓は縮小していると事前ドリル穴に収まります。
8. PBSでマイクロ遠心チューブに鈍鉗子と場所を使用して慎重に血栓を削除します。 2血栓/動物を準備します。
9. 手術室に血栓を取る。

フィブリン塊における同種間葉系幹細胞のD.の移植

1. プロポフォールの静脈注射（10 mg / kg体重）でウサギ（NZW、男性、3.5〜4.0キロの体重、5-6ヶ月）に麻酔を誘導する。
2. 電気クリッパー、真空毛皮でログオン操作する膝を剃る。前に指定されたすべての手順は、手術室の無菌環境の汚染を避けるために手術の準備室で行われる。
3. 挿管後、静脈内に1.5 mg / kg体重/分プロポフォール及び0.05 mg / kg体重/分フェンタニルで麻酔を維持します。カプノグラフィ、パルスオキシメトリと脈拍数を用いて麻酔を監視する。
4. 徹底的に剃っているd膝を消毒、滅菌ドレッシングで​​ウサギの残りの部分をカバーしています。
5. 膝蓋骨を触診し、膝蓋骨に内側の皮膚切開を行います。
6. 無菌条件下で内側parapatellar関節切開による膝関節を開きます。どんな小さな表在血管を切断しないようにしてください。
7. （ 図4）横方向に膝蓋骨を置換。
8. inspe後に任意の付随軟骨病変や関節の異常のために膝関節のctionは、ストップデバイスと無菌空気オペレーティングパワードリルと滑車溝に2つの骨軟骨欠損（ディープ3ミリメートル、8字型の図）（直径3.6ミリメートル）を作成（ 図5）。
9. 欠陥をきれいにし、滅菌生理食塩水でそれらを洗い流してください。
10. 移植の前に、欠陥にフィブリン糊の20μLを記入し、欠陥の底に均等に分配する。
11. その後血栓フィギュア8字型欠陥に圧入植え込む。
12. 凝固後、滑車溝内膝蓋骨を再配置し、数回曲げると膝を伸ばす。
13. もう一度横膝蓋骨を置換し、フィブリノーゲン細胞塊の場所に残っているかどうかを確認します。
14. 再び膝蓋骨を交換し、（両方吸収性縫合糸を持つ単一のボタン縫合（4-0 VICRYL）および連続皮膚縫合（4-0モノクリル）と層における創傷閉鎖で動作を終える材料）。
15. 最後に、水蒸気透過性ドレッシングスプレーで傷を封印。
16. 術後ケアのため、傷は7日間毎日チェックされます。ウサギは術後鎮痛カルプロフェン4 mg / kgを皮下毎24時間（4日間）とブプレノルフィン0.03 mg / kgを皮下毎12時間（2.5日間）のために受け取る。膝の安定化（ 例えばドレッシング）は必要ありません。

結果

記載の外科技術は、人工骨軟骨欠損部に同種間葉系幹細胞の単離及び移植の成功を可能にする。実験装置は、周囲の軟骨にインプラント統合の成功をもたらした。

欠陥が周囲の軟骨に比べて類似の生体力学的特性と類似した耐久性と修復組織で充填した。フィブリン血餅細胞が骨軟骨欠損（ 図3）と同じサイズを有していた事前ドリル穴を有する滅菌プレー?...

ディスカッション

近年では、複雑な関節骨軟骨欠損治療の可能性 - そのような骨軟骨炎の離断、骨壊死や外傷に起因するものなどを - 組織工学的アプローチでは、ますます魅力的になりました。前述した病的なエンティティでは、組織の損傷は軟骨下骨に延びており、別の本質的な癒しの容量¹によって特徴付けられる2組織が ​​含まれます。骨軟骨関節損傷^11,23の病原性プロセスの軟骨下骨?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Biochrom AG	F 0415
FCS	PAN Biotech GmbH	0401
Propofol	Fresenius Kabi
Penicillin/Streptomycin	Biochrom AG	A 2210	1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl
PBS Dulbecco (1X)	Biochrom AG	L1815
Ethanol (70%)	Merck KGaA	410230
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154
Biocoll Separation Sol.	Biochrom AG	L6115	Isotonic solution Density: 1,077 g/ml
Trypsin-EDTA 0.05%	Invitrogen GmbH	25300-054
Fentanyl	DeltaSelectGmBH	1819340
NaCl solution (0.9%)	BBraun	8333A193
Syringes (Injekt)	BBraun	4606108V
Needles (Sterican)	BBraun	4657519
Forceps (blunt/sharp)	Aesculap
Scissors	Aesculap
Scalpels	Feather Safety Razor Co	02.001.30.022
Pipettes research	Eppendorf
Bone Cutter	Aesculap
Tissue culture dishes 100 mm/150 mm	TPP AG	93100/93150	Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2
Tissue culture flasks 25/75 mm2	TPP AG	90025/90075	25 mm2, 75 mm2
Centrifuge Tubes (50 ml)	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
CO2 Incubator	Forma Scientific Inc.
Cell culture laminar flow hood Hera Safe	Heraeus Instruments
Sterile saw	Aesculap
Centrifuge Megafuge 2.0 R	Heraeus Instruments
Hemocytometer	Brand GmbH+Co KG	717810	Neubauer
Air operated power drill	Aesculap
TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno	Baxter	2546648
Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl)	Ethicon
Spray dressing (OpSite)	Smith&Nephew	66004978	Permeable for water vapor