Il trattamento dei difetti osteocondrali del ginocchio congiunta del Coniglio con impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in coaguli di fibrina

Riepilogo

Una tecnica sperimentale per il trattamento dei difetti osteocondrali nel ginocchio del coniglio è descritto. L'impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in difetti osteocondrali fornisce una promettente sviluppo nel campo dell'ingegneria dei tessuti. La preparazione di fibrina-cell-coaguli In vitro Offre un metodo standardizzato per l'impianto.

Abstract

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface ¹. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential ². In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established ^3-6.

Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface ^3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.

New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation ^9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone ¹¹.

The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering ^5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing ¹².

Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity ¹¹.

Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential ^13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.

In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results ^1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies ^19-21 and even first human trials ²².

The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

Protocollo

A. Preparazione di un coniglio dei donatori per l'isolamento di cellule staminali mesenchimali (Chirurgia Camera)

1. Le cellule sono isolate dal maschio Nuova Zelanda bianchi (NZW) conigli all'età di 4 mesi e di circa 3 kg di peso corporeo.
2. Indurre l'anestesia con propofol (10 mg / kg di peso corporeo iv) e il sacrificio con sodio pentobarbital (100 mg / kg di peso corporeo iv).
3. Shave pelliccia da arti posteriori, schiena e pancia con un tagliatore elettrico e aspirare la pelliccia.
4. Disinfettare accuratamente la zona rasata con il 70% di etanolo.
5. Utilizzare pinze smussato, forbici affilate (o bisturi) e frese per il tessuto osseo e legamenti.
6. Fare un'incisione lungo la superficie craniale della gamba e del polpaccio.
7. Riflettere cute e del tessuto sottocutaneo da una dissezione tagliente o contundente.
8. Distinti muscoli e legamenti di tibia e del femore. Mantenere tagli come vicino all'osso possibile per fare una dissezione pulito. Non separare femore dalla tibia in questo momento.
9. Tagliare through l'anca per separare la testa del femore dalla dell'acetabolo.
10. Elevare il complesso tibio-femorale.
11. Utilizzare il bisturi per togliere qualsiasi tessuto molle restante dalle ossa o strofinare le ossa con i tessuti panno sterile. A questo punto, femore e tibia sono ancora connessi.
12. Rimuovere rotula da taglio, quindi tagliare ginocchio legamenti articolari alle ossa distinte infine.
13. Spray ossa separato con il 70% di etanolo, lasciare asciugare e mettere ogni osso in un tubo da centrifuga da 50 ml con mezzo di coltura cellulare (DMEM + 1% di penicillina / streptomicina (Pen / Strep)) per mantenerli umidi.
14. Ora passare sotto una cultura cappa a flusso laminare sterile cella.

B. Flushing del Coniglio MSC da Ossa e di espansione (Cell Culture Hood)

1. Raccogliere le ossa da tubi e metterli in 150 millimetri piatti utilizzando pinze sterili.
2. Rimuovere entrambi osso finisce con una sega sterile e pezzi trasferirsi a New mm piatti 150.
3. Riempire una siringa da 10 ml con medium (DMEM), collegare un ago di calibro 18 e inserire nell'apertura del midollo osseo.
4. Poi, sciacquare cavità midollare con il mezzo per svuotare il midollo osseo nel piatto. Successivamente sciacquare dall'altra estremità, se possibile. Se necessario, segare più dalle estremità. Se osso dovesse rompere, basta lavare l'interno dell'osso.
5. Aspirare sospensione medie cella nella siringa e sciacquare il midollo osseo ripetutamente fino sospensione è libera fluttuante attraverso il midollo osseo cavità e nessuna ulteriore midollo osseo coaguli compaiono.
6. Una volta che il midollo osseo è stato raccolto da tutte le ossa, disturbare i ciuffi di midollo passando attraverso un ago di calibro 18: Riempire una siringa con ago e forza fuori in mezzo.
7. Successivamente, filtrare la sospensione attraverso un filtro cella in un tubo da 50 ml. Al fine di prevenire la perdita di cellule, lavare coltura piatto 2x con 10 ml di mezzo e filtrare pure.
8. Centrifugare sospensione a 500 xg per 5 min a RT.
9. Rimuovere il surnatante e risospendere cella pellet in 10 ml di terreno (DMEM + 1% Pen / Strep).
10. Globuli separati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e cellule staminali mesenchimali (MSC) usando una soluzione Biocoll separazione.
11. Riempire 5 ml di Biocoll Separare soluzione in una provetta da 15 ml e aggiungere cautamente 5 ml di sospensione cellulare in cima e centrifugare a 800 xg per 20 min a TA (senza freno).
12. Possibili risultati vedi Figura 1: Essendo più denso rispetto Biocoll, globuli rossi sedimenti sul fondo, mentre le cellule staminali mesenchimali PBMC e rimangono all'interfaccia.
13. Rimuovere con attenzione l'interfaccia in un tubo da 15 ml e lavare con 5 ml di PBS.
14. Centrifugare come descritto al punto 22, risospendere in 5 ml di PBS e ripetere 2-3x.
15. Poi, centrifugare nuovamente a 350 xg per 10 min a TA (con freno).
16. Risospendere in 10 ml di mezzo e contare le cellule in un emocitometro.
17. Cellule piastra ad una densità di semina iniziale di circa 5 x 10 ⁶ a 150 millimetri piatti.
18. Dopo 2-3 giorni, rispostare cellule non aderenti. Potrebbe essere necessario lavare con PBS prima al fine di rimuovere i detriti cellulari. Aggiungere mezzo fresco completo (DMEM + 10% di siero fetale di vitello (FCS) + 1% Pen / Strep) dopo.
19. Nutrire le cellule ogni 3-4 giorni (Figura 2).
20. Dopo 5-10 giorni, passaggio alle cellule per la prima volta.

C. Preparazione di coaguli di fibrina in vitro

1. Al giorno di impianto, rilasciate da cellule aderenti beute / stoviglie da 3 min-esposizione al 0,25% tripsina-EDTA. Arrestare tripsinizzazione aggiungendo mezzo completo.
2. Distribuire le cellule in una provetta da 50 falco e lavare due volte con PBS.
3. Determinare la vitalità cellulare e numeri blu tripano colorazione.
4. Aggiungi 50.000 cellule / provetta e raccogliere pellet per centrifugazione a 500 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Preparare una mastermix per almeno un altro coagulo come necessario.
5. Risospendere il pellet di cellule in 17 ml di PBS e mescolare 25 ml di componente di fibrinogeno di TISSUCOL-Kit con questo 17 microlitri di sospensione MSC.
6. Prendete un piatto sterile con fori predisposti (3x3.6 mm), in conformità ai fori in vivo (Figura 3).
7. Prima, inoculare 4 microlitri soluzione di trombina (500 UI / ml) in un foro, seguita da aggiunta di 42 microlitri immediato fibrinogeno-cell-sospensione e nuovo 4 microlitri soluzione di trombina in cima. Non mescolare la sospensione per evitare la coagulazione nella punta della pipetta. Prima, il volume di 50 microlitri della pipettato fibrinogeno-cell-sospensione sporgerà il bordo dei fori pre-forati senza fondere a causa della tensione superficiale. Tuttavia, dopo la completa coagulazione (dopo 60 min) il coagulo si contrae e si inserisce nel pre-foro.
8. Rimuovere il coagulo con cura utilizzando una pinza smussato e posto in una provetta con PBS. Preparare 2 coaguli / animali.
9. Prendete i coaguli in sala operatoria.

D. L'impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in coaguli di fibrina

1. Indurre l'anestesia di coniglio (NZW, maschio, 3,5-4,0 kg di peso corporeo, 5-6 mesi di età) per iniezione endovenosa di propofol (10 mg / kg di peso corporeo).
2. Shave il ginocchio da operare con un tagliatore elettrico e vuoto la pelliccia. Tutte le procedure denominate prima vengono eseguite in una camera di preparazione intervento chirurgico per evitare la contaminazione dell'ambiente sterile della sala operatoria.
3. Dopo l'intubazione, mantenere l'anestesia con 1.5 mg / kg / min propofol e 0,05 mg / kg / min fentanil per via endovenosa. Monitorare l'anestesia utilizzando capnography, pulsossimetria e la frequenza cardiaca.
4. Disinfettare il ginocchio rasato accuratamente e coprire il resto del coniglio con una medicazione sterile.
5. Palpare la rotula ed eseguire una incisione cutanea mediale della rotula.
6. Aprire l'articolazione del ginocchio da una artrotomia mediale parapatellare in condizioni sterili. Cercate di evitare di tagliare i piccoli vasi sanguigni superficiali.
7. Spostare la rotula lateralmente (figura 4).
8. Dopo INSPEction dell'articolazione del ginocchio per le lesioni cartilaginee concomitanti o anomalie comuni, creare due difetti osteocondrali (di profondità 3 mm figura a forma di otto) nel solco trocleare con aria sterile trapano elettrico di funzionamento (3,6 millimetri di diametro) con un dispositivo di arresto (Figura 5).
9. Pulire i difetti e sciacquare con soluzione salina sterile.
10. Prima dell'impianto, riempire 20 pl di colla di fibrina nei difetti e distribuirli uniformemente sul fondo del difetto.
11. Poi impiantare i coaguli inserito a pressione nella figura difetto a forma di otto.
12. Dopo la coagulazione, riposizionare la rotula nel solco trocleare e piegare e distendere il ginocchio un paio di volte.
13. Spostare lateralmente, ancora una volta la rotula e verificare se il fibrinogeno-cellulari-coaguli sono ancora al loro posto.
14. Sostituire nuovamente la rotula e terminare l'operazione con chiusura della ferita a strati con bottone singolo suture (4-0 Vicryl) e una sutura cutanea continuo (4-0 Monocryl) (entrambe con sutura riassorbibilemateriale).
15. Infine, sigillare la ferita con uno spray medicazione permeabile al vapore acqueo.
16. Per assistenza post-operatoria, la ferita viene controllato giorno per 7 giorni. I conigli ricevono per la post-operatoria analgesia Carprofen 4 mg / kg sc ogni 24 ore (per 4 giorni) e Buprenorphin 0,03 mg / kg sc ogni 12 ore (per 2,5 giorni). Una stabilizzazione del ginocchio (es. medicazione) non è necessaria.

Risultati

La tecnica chirurgica descritta permette un isolamento di successo e impianto di cellule staminali mesenchimali allogeniche in un difetto osteocondrale artificiale. Il setup sperimentale ha comportato una integrazione dell'impianto nella cartilagine circostante.

Il difetto è stato riempito da riparazione dei tessuti con proprietà biomeccaniche simili e durata simile rispetto alla cartilagine circostante. La fibrina-cell-coagulo è stato preparato in vitro su un piatto sterile ...

Discussione

Negli ultimi anni, la possibilità di trattare complesse articolari difetti osteocondrali - come ad esempio quelli derivanti da osteocondrite dissecante, osteonecrosi e traumi - con approcci di ingegneria dei tessuti è diventato sempre più attraente. Nelle entità patologiche precedentemente menzionati, danno tissutale estende all'osso subcondrale e coinvolge due tessuti caratterizzati da differenti capacità curative intrinseche ^1. Vi è un interesse crescente per il ruolo di osso subcondrale per i pro...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Biochrom AG	F 0415
FCS	PAN Biotech GmbH	0401
Propofol	Fresenius Kabi
Penicillin/Streptomycin	Biochrom AG	A 2210	1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl
PBS Dulbecco (1X)	Biochrom AG	L1815
Ethanol (70%)	Merck KGaA	410230
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154
Biocoll Separation Sol.	Biochrom AG	L6115	Isotonic solution Density: 1,077 g/ml
Trypsin-EDTA 0.05%	Invitrogen GmbH	25300-054
Fentanyl	DeltaSelectGmBH	1819340
NaCl solution (0.9%)	BBraun	8333A193
Syringes (Injekt)	BBraun	4606108V
Needles (Sterican)	BBraun	4657519
Forceps (blunt/sharp)	Aesculap
Scissors	Aesculap
Scalpels	Feather Safety Razor Co	02.001.30.022
Pipettes research	Eppendorf
Bone Cutter	Aesculap
Tissue culture dishes 100 mm/150 mm	TPP AG	93100/93150	Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2
Tissue culture flasks 25/75 mm2	TPP AG	90025/90075	25 mm2, 75 mm2
Centrifuge Tubes (50 ml)	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
CO2 Incubator	Forma Scientific Inc.
Cell culture laminar flow hood Hera Safe	Heraeus Instruments
Sterile saw	Aesculap
Centrifuge Megafuge 2.0 R	Heraeus Instruments
Hemocytometer	Brand GmbH+Co KG	717810	Neubauer
Air operated power drill	Aesculap
TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno	Baxter	2546648
Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl)	Ethicon
Spray dressing (OpSite)	Smith&Nephew	66004978	Permeable for water vapor