Лечение костно-хрящевых дефектов в коленного сустава кролика путем имплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в сгустки фибрина

Резюме

Экспериментальной методики для лечения костно-хрящевых дефектов в коленный сустав кролика описано. Имплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в костно-хрящевых дефектов обеспечивает перспективное развитие в области тканевой инженерии. Подготовка фибрин-клеточного сгустков В пробирке Предлагает стандартизованный метод имплантации.

Аннотация

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface ¹. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential ². In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established ^3-6.

Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface ^3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.

New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation ^9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone ¹¹.

The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering ^5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing ¹².

Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity ¹¹.

Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential ^13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.

In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results ^1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies ^19-21 and even first human trials ²².

The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

протокол

А. Получение Донор Кролика для выделения мезенхимальных стволовых клеток (хирургия номер)

1. Клетки выделяют из самцов новозеландских белых (NZW) кроликов в возрасте 4 месяцев и около 3 кг веса тела.
2. Вызвать анестезии пропофолом (10 мг / кг массы тела IV) и жертвовать пентобарбиталом натрия (100 мг / кг массы тела внутривенно).
3. Бритье меха от задних конечностей, спины и живота с электрической машинки и пропылесосить меха.
4. Лечить бритой место водой с 70% этанола.
5. Используйте тупой пинцет, острые ножницы (или скальпель) и костной фрезы для тканей и связок.
6. Сделайте надрез вдоль черепной поверхности ног и голеней.
7. Отражение кожи и подкожной клетчатки либо острые или тупые.
8. Отдельные мышцы и связки от бедренной костью. Держите сокращение как можно ближе к кости, как можно сделать чистую рассечение. Не отрывайте бедра от голени в это время.
9. Вырезать THRтельное тазобедренного сустава отделить головки бедренной кости из вертлужной впадины.
10. Поднимите большеберцовой-бедренного комплекса.
11. Используйте скальпель, лезвие, чтобы соскоблить остатки мягких тканей от костей или протереть кости стерильной ткани ткань. На данный момент, бедра и голени по-прежнему связаны.
12. Удалить надколенника резанием, а затем вырезать связок коленного сустава, чтобы, наконец, отдельные кости.
13. Спрей отделить кости с 70% этанола, пусть воздух сухой и поместить каждую кость в 50 мл центрифужные пробирки с сотовыми культуральной среде (DMEM + 1% пенициллина / стрептомицина (пенициллина / стрептомицина)), чтобы держать их влажными.
14. Теперь переключитесь в стерильной капот культуре клеток ламинарного потока.

B. Промывка Кролик MSC от костей и расширение (капот культуре клеток)

1. Собирать кости из пробирки и поместите их в 150 мм блюда с использованием стерильного пинцета.
2. Снимите обе кости заканчивается стерильным пилы и перемещать фигуры новым 150-мм чашек.
3. Заполните шприц 10 мл с MediUM (DMEM), прикрепите иглу 18 калибра и вставьте в отверстие в костном мозге.
4. Затем промыть полость кости со средним и промойте костного мозга в блюдо. После промывки с другого конца, если это возможно. При необходимости провожали более от концов. Если кость должна нарушать, просто промыть внутри кости.
5. Аспирируйте суспензии клеток среды в шприц и промыть костного мозга, пока суспензия не является свободно плавающим через полость костного мозга, и никаких дальнейших костного мозга появляются сгустки.
6. После костного мозга была собрана из всех костей, костного мозга нарушить сгустки, проходя через иглу 18 калибра: заполнить шприц с иглой и вытеснить в среде.
7. После этого суспензию фильтруют через ячейку фильтра в 50 мл трубки. Для того чтобы предотвратить потерю клеток, мыть 2x культуральной чашке с 10 мл среды и фильтруют, а также.
8. Центрифуга суспензии при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
9. Удалить супернатант и ресуспендируют клетки ПеллET в 10 мл среды (DMEM + 1% пенициллина / стрептомицина).
10. Отдельные клетки крови из мононуклеарных клеток периферической крови (МПК) и мезенхимальных стволовых клеток (МСК), используя Biocoll Разделение решения.
11. Заполнить 5 мл Biocoll разделения раствора в 15 мл пробирку и осторожно добавляют 5 мл клеточной подвески на верхней и центрифугируют при 800 х г в течение 20 мин при комнатной температуре (без тормоза).
12. Возможные результаты см. Рисунок 1: быть более плотной, чем Biocoll, красные клетки крови осадком на дно, а МПК и мезенхимальные стволовые клетки остаются на поверхности раздела.
13. Осторожно снимите интерфейс в 15 мл трубки и промыть 5 мл PBS.
14. Центрифуга как описано в пункте 22, ресуспендируют в 5 мл PBS и повторить 2-3х.
15. Затем снова центрифугируют при 350 х г в течение 10 мин при комнатной температуре (с тормозом).
16. Ресуспендируют в 10 мл среды и подсчет клеток в гемоцитометра.
17. Пластина клеток при исходной плотности посева примерно 5 × 10 ⁶ в 150-мм чашек.
18. Через 2-3 дня, повторнодвигаться неприлипшие клетки. Возможно, вам придется промыть PBS первых, с тем, чтобы удалить остатки клеток. Добавить свежий полной среде (DMEM + 10% фетальной сыворотки теленка (FCS) + 1% пенициллина / стрептомицина) впоследствии.
19. Кормить клетки каждые 3-4 дня (рис. 2).
20. Через 5-10 дней, проход клетки в первый раз.

С. Подготовка сгустков фибрина в пробирке

1. В день имплантации освободить адгезивных клеток из колбы / посуда по 3 мин экспозиции до 0,25% трипсин-ЭДТА. Остановить трипсинизация, добавив полную среду.
2. Распределить клеток в 50 мл трубки сокола и мыть их в два раза с PBS.
3. Определение жизнеспособности клеток и номера окрашиванием трипановым синим.
4. Добавить 50000 клеток / микроцентрифужных трубки и собирать гранулы центрифугированием при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Подготовить Mastermix, по крайней мере, еще один сгусток по мере необходимости.
5. Ресуспендируют осадок клеток в 17 мкл PBS и смешивают 25 мкл раствора фибриногена компонент ТканьCOL-Kit с этим 17 мкл суспензии MSC.
6. Возьмите стерильную чашку с предварительно просверленными отверстиями (3x3.6 мм) в соответствии с отверстиями в естественных условиях (рис. 3).
7. Во-первых, прививку 4 мкл раствора тромбина (500 МЕ / мл) в одно отверстие, с последующим немедленным добавлением 42 мкл фибриноген-клеточного подвески и снова 4 мкл раствора тромбина на вершине. Не смешивайте подвески, чтобы избежать свертывания на кончике пипетки. Во-первых, в объеме 50 мкл из пипетки фибриноген-клеточно-суспензионных будет выступать ободу предварительно просверленные отверстия без плавления благодаря поверхностному натяжению. Тем не менее, после полного свертывания (через 60 мин) сгусток сжимается и вписывается в предварительно просверленные отверстия.
8. Удалить тромб тщательно при помощи тупого пинцета и место в микроцентрифужную трубу с PBS. Подготовьте 2 сгустков / животного.
9. Возьмите сгустков в комнату хирургии.

D. имплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в сгустки фибрина

1. Вызвать анестезии кролика (NZW, мужчина, 3,5-4,0 кг массы тела, 5-6 месяцев) внутривенной инъекции пропофола (10 мг / кг массы тела).
2. Бритье колена, которыми оперирует с электрической машинки и вакуумные меха. Все процедуры перед именем выполняются в комнате подготовки операции, чтобы избежать загрязнения стерильных условиях операционной комнаты.
3. После интубации поддержания анестезии с 1,5 мг / кг / мин пропофола и 0,05 мг / кг / мин фентанила внутривенно. Монитор анестезии с помощью капнографических, пульсоксиметрии и частоту пульса.
4. Лечить бритой колена тщательно и покрыть остальную часть кролика с стерильную повязку.
5. Пропальпируйте коленной чашечки и выполняют разрез кожи медиальной коленной чашечки.
6. Открытый коленного сустава при медиальных парапателлярный артротомия в стерильных условиях. Старайтесь избегать любых резки небольших поверхностных кровеносных сосудов.
7. Смещение коленной чашечки сбоку (рис. 4).
8. После Inspeие коленного сустава для любых сопутствующих повреждений хряща или совместных аномалий, создать два костно-хрящевых дефектов (глубиной 3 мм, восьмерка-образная) в блоковый паз с стерильной операционной дрель-воздушных сил (3,6 мм в диаметре) со стоп-устройством (рис. 5).
9. Очистите дефектов и промыть их стерильным физиологическим раствором.
10. До имплантации заполнить 20 мкл фибринового клея в дефектах и ​​распределить их равномерно на дне дефекта.
11. Затем имплантат сгустков запрессован в восьмерку формы дефекта.
12. После свертывания, переместите коленной чашечки в блоковый канавкой и сгибать и растягивать колена несколько раз.
13. Смещение коленной чашечки сбоку еще раз и убедитесь, что фибриноген-клеточных сгустков-прежнему на месте.
14. Заменить коленная чашечка снова и завершить операцию с закрытием раны в слоях с одной кнопкой швов (4-0 Vicryl) и непрерывным швом кожные (4-0 Monocryl) (оба с рассасывающиеся нитиматериала).
15. Наконец, запечатать рану с распылителем туалетный пропускает водяной пар.
16. Для послеоперационного ухода, рана проверяется ежедневно в течение 7 дней. Кролики получают для послеоперационного обезболивания Carprofen 4 мг / кг подкожно каждые 24 часов (за 4 дня) и Buprenorphin 0,03 мг / кг подкожно каждые 12 ч (в течение 2,5 дней). Стабилизации колена (например, соус) не является необходимым.

Результаты

Описанная хирургическая техника позволяет успешно изоляции и имплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в искусственную костно-хрящевого дефекта. Экспериментальная установка привела к успешной интеграции имплантата в окружающие хряща.

Дефект был запол?...

Обсуждение

В последние годы, возможность лечения суставного комплекса костно-хрящевых дефектов - например, в результате остеохондроз рассекающий, некроз и травмы - с подходами тканевая инженерия становится все более и более привлекательным. В упомянутой выше патологических лиц, повреждение ткан...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Biochrom AG	F 0415
FCS	PAN Biotech GmbH	0401
Propofol	Fresenius Kabi
Penicillin/Streptomycin	Biochrom AG	A 2210	1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl
PBS Dulbecco (1X)	Biochrom AG	L1815
Ethanol (70%)	Merck KGaA	410230
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154
Biocoll Separation Sol.	Biochrom AG	L6115	Isotonic solution Density: 1,077 g/ml
Trypsin-EDTA 0.05%	Invitrogen GmbH	25300-054
Fentanyl	DeltaSelectGmBH	1819340
NaCl solution (0.9%)	BBraun	8333A193
Syringes (Injekt)	BBraun	4606108V
Needles (Sterican)	BBraun	4657519
Forceps (blunt/sharp)	Aesculap
Scissors	Aesculap
Scalpels	Feather Safety Razor Co	02.001.30.022
Pipettes research	Eppendorf
Bone Cutter	Aesculap
Tissue culture dishes 100 mm/150 mm	TPP AG	93100/93150	Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2
Tissue culture flasks 25/75 mm2	TPP AG	90025/90075	25 mm2, 75 mm2
Centrifuge Tubes (50 ml)	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
CO2 Incubator	Forma Scientific Inc.
Cell culture laminar flow hood Hera Safe	Heraeus Instruments
Sterile saw	Aesculap
Centrifuge Megafuge 2.0 R	Heraeus Instruments
Hemocytometer	Brand GmbH+Co KG	717810	Neubauer
Air operated power drill	Aesculap
TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno	Baxter	2546648
Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl)	Ethicon
Spray dressing (OpSite)	Smith&Nephew	66004978	Permeable for water vapor