טיפול במומי Osteochondral במפרק הברך של הארנב על ידי השתלה של תאי גזע mesenchymal אלוגנאית בקרישי הפיברין

Summary

טכניקה ניסויית לטיפול בפגמי osteochondral במפרק הברך של הארנב מתוארת. ההשתלה של תאי גזע מזנכימיים אלוגניות לפגמי osteochondral מספקת פיתוח מבטיח בתחום הנדסת רקמות. הכנת הפיברין-תא קרישים במבחנה מציע שיטה סטנדרטית להשתלה.

Abstract

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface ¹. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential ². In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established ^3-6.

Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface ^3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.

New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation ^9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone ¹¹.

The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering ^5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing ¹².

Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity ¹¹.

Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential ^13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.

In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results ^1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies ^19-21 and even first human trials ²².

The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

Protocol

הכנת א ארנב תורם לבידוד של תאי גזע mesenchymal (חדר ניתוח)

1. תאים מבודדים מזכר לבן (NZW) ארנבי ניו זילנד בגיל 4 חודשים וכ 3 ק"ג משקל גוף.
2. לגרום הרדמה פרופופול על ידי (10 מ"ג / ק"ג משקל הגוף ד) ותקריב עם נתרן pentobarbital (משקל גוף מ"ג / ק"ג 100 ד).
3. לגלח את הפרווה מגפיים אחוריות, גב ובטן עם גוזז חשמלי ולשאוב את הפרווה.
4. לחטא את האזור המגולח ביסודיות עם אתנול 70%.
5. השתמש במלקחיים בוטים, מספריים חדים (או סכין מנתחים) וחותכים לרקמת עצם ורצועות.
6. עושה חתך לאורך משטח הגולגולת של הרגל והעגל.
7. משקף עור ורקמה התת עורית או על ידי נתיחה חדה או קהה.
8. שרירים ורצועות נפרדים מעצם השוק וירך. שמור על קיצוצים כקרובים לעצם ככל האפשר כדי להפוך את חיתוך נקי. אל תפריד בין עצם ירך מעצם השוק בשלב זה.
9. חותכים through מפרק הירך להפריד את ראש עצם הירך ממרחשת.
10. לרומם מורכב השוקה-הירך.
11. השתמש בלהב סכין המנתחים כדי לגרד את כל רקמות רכות שנותרו מהעצמות או לשפשף את העצמות עם רקמות בד סטריליים. בשלב זה, עצם הירך ועצם השוק עדיין מחוברות.
12. הסר את פיקת הברך על ידי חיתוך, ואז לחתוך רצועות מפרק הברך לעצמות נפרדות סוף סוף.
13. ספריי הופרדו עצמות עם 70% אתנול, לתת אוויר יבש ולמקם כל עצם לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל עם תרבית תאים בינוניות (DMEM + 1% פניצילין סטרפטומיצין / (עט / סטרפטוקוקוס)) כדי לשמור עליהם לח.
14. לעבור עכשיו מתחת למכסת מנוע מינרית סטרילי תרבית תאי זרימה.

ב 'פלאשינג של MSC ארנב מעצמות והרחבה (הוד תרבות תאים)

1. לאסוף עצמות מצינורות ולמקם אותם לתוך 150 מנות מ"מ באמצעות מלקחיים סטריליים.
2. להסיר גם עצם מסתיים עם מסור סטרילי וחתיכות לעבור למנות חדשות 150 מ"מ.
3. ממלאי מזרק 10 מ"ל עם Mediאום (DMEM), לצרף מחט מד 18 ולהכניס לתוך הפתח של מח העצם.
4. לאחר מכן, יש לשטוף את חלל מח עם מדיום כדי לשטוף את מח העצם לתוך הצלחת. לאחר מכן, יש לשטוף מהקצה השני, אם אפשר. במידת צורך, ראה את יותר מהקצוות. אם צריכה לשבור עצמות, פשוט לשטוף את החלק הפנימי של העצם.
5. לשאוב השעיה מדיום סלולרי לתוך המזרק ולשטוף את מח העצם שוב ושוב עד שההשעיה היא צף חופשי דרך חלל מח העצם ולא עצם נוסף מח קרישים יופיעו.
6. ברגע שמוח עצם שנאסף מכל העצמות, לשבש את גושי מח על ידי עובר דרך מחט מד 18: למלא מזרק עם המחט מחוברת ולאלץ החוצה לתוך מדיום.
7. לאחר מכן, לסנן את ההשעיה דרך פילטר תא לתוך צינור 50 מ"ל. על מנת למנוע אובדן תא, לשטוף 2x צלחת התרבות עם מדיום 10 מ"ל ולסנן גם כן.
8. צנטריפוגה השעיה על XG 500 במשך 5 דקות ב RT.
9. הסר supernatant ו resuspend התא פלet במדיום 10 מ"ל (עט% + 1 / סטרפטוקוקוס DMEM).
10. תאי דם נפרדים מתאי דם היקפיים (mononuclear PBMC) ותאי גזע mesenchymal (MSC) באמצעות פתרון הפרדת Biocoll.
11. מלא 5 מ"ל של Biocoll הפרדת פתרון לתוך שפופרת 15 מ"ל ולהוסיף 5 מ"ל של השעיה תא בזהירות על גבי וצנטריפוגות ב XG 800 עבור 20 דקות ב RT (ללא בלמים).
12. תוצאות אפשריות ראו איור 1: צפוף יותר מאשר להיות Biocoll, דם משקע תאים אדום בתחתית ואילו תאי גזע PBMC וmesenchymal להישאר בממשק.
13. בזהירות להסיר את הממשק לתוך צינור 15 מ"ל ולשטוף עם 5 מ"ל PBS.
14. צנטריפוגה כמתואר בשלב 22, resuspend ב 5 מ"ל PBS ולחזור על 2-3x.
15. ואז, שוב בצנטריפוגה XG 350 עבור 10 דקות ב RT (עם בלמים).
16. Resuspend במדיום 10 מ"ל ולספור תאים בhemocytometer.
17. פלייט תאים בצפיפות זריעה ראשונית של כ 5 x 10 ⁶ מנות ב -150 מ"מ.
18. לאחר 2-3 ימים, מחדשלהעביר תאים שאינם חסיד. ייתכן שתצטרך לשטוף עם PBS הראשון על מנת להסיר תא פסולת. הוסף בינונית מלא טרי (DMEM + עגל עוברי 10% בסרום (FCS) + 1% עט / סטרפטוקוקוס) לאחר מכן.
19. להאכיל את תאים כל 3-4 ימים (איור 2).
20. לאחר 5-10 ימים, מעבר התאים בפעם הראשונה.

הכנת ג קרישי הפיברין במבחנה

1. ביום של השתלה, לשחרר תאים חסיד מצלוחיות / מנות על ידי חשיפת 3 דקות-0.25% טריפסין-EDTA. תפסיק trypsinization ידי הוספה בינונית מלאה.
2. הפץ תאים בצינור פלקון 50 מ"ל ולשטוף אותם פעמיים עם PBS.
3. לקבוע כדאיות תא ומספרים על ידי צביעת trypan הכחולה.
4. הוסף 50,000 תאים / צינור microcentrifuge ולאסוף כדורים על ידי צנטריפוגה בXG 500 במשך 5 דקות ב RT. הכן mastermix לקריש אחד לפחות יותר במידת צורך.
5. Resuspend התא גלולה ב 17 PBS μl ולערבב 25 μl של הרכיב של פיברינוגן TissuCOL-קיט עם ההשעיה MSC μl זה 17.
6. קח צלחת סטרילית עם חורים שנקדחו מראש (3x3.6 מ"מ) בהתאם לחורי מקדח in vivo (איור 3).
7. ראשית, לחסן 4 פתרון תרומבין μl (500 IU / מ"ל) לתוך חור אחד, ואחריו תוספת מיידית של 42 שוב 4 פתרון תרומבין μl על גבי תאי פיברינוגן השעיה וμl. אין לערבב את ההשעיה, כדי למנוע קרישה בקצה פיפטה. ראשית, נפח μl 50 של פיברינוגן-תא ההשעיה pipetted יבלוט שפה של החורים שנקדחו מראש ללא מסה בשל מתח הפנים. עם זאת, לאחר קרישה מלאה (לאחר 60 דקות) הקריש הוא מתכווץ ונכנס לתוך החור שנקדח מראש.
8. הסר את הקריש באמצעות מלקחיים בזהירות ומקום קהים לתוך צינור microcentrifuge עם PBS. להכין 2 קרישים / בעלי חיים.
9. קח את קרישים לחדר הניתוח.

ההשרשה ד תאי גזע mesenchymal אלוגנאית בקרישי הפיברין

1. לגרום הרדמה לארנב (NZW, זכר, 3.5-4.0 ק"ג משקל גוף, ישן 5-6 חודשים) על ידי הזרקה של IV פרופופול (10 משקל גוף מ"ג / ק"ג).
2. לגלח את הברך להיות מופעלת על עם גוזז חשמלי וואקום הפרווה. כל ההליכים בשם לפני שמבוצעים בחדר ניתוח בהכנה, כדי למנוע זיהום של סביבת סטרילית של חדר הניתוח.
3. לאחר אינטובציה, לשמור על הרדמה עם 1.5 מ"ג / ק"ג / דקה propofol ו0.05 מ"ג / ק"ג / פנטניל דקות לוריד. לפקח הרדמה באמצעות capnography, oximetry דופק ודופק.
4. לחטא את הברך מגולח ביסודיות ולכסות את שאר ארנב עם רוטב סטרילי.
5. למשש את פיקת הברך ולבצע חתך בעור המדיאלי לפיקת הברך.
6. פתח את מפרק הברך על ידי arthrotomy parapatellar המדיאלי בתנאים סטריליים. נסו להימנע מחיתוך כל כלי דם שטחיים קטנים.
7. לעקור את פיקת הברך רוחבית (איור 4).
8. לאחר inspection של מפרק הברך לכל נגעי סחוס נלווים או סטיות משותפות, ליצור שני פגמי osteochondral (3 מ"מ עמוק, דמות בצורת שמונה) בחריץ trochlear עם מקדחת הפעלה אוויר סטרילי (3.6 מ"מ קוטר) עם עצירה-מכשיר (איור 5).
9. נקה את הפגמים ולשטוף אותם עם תמיסת מלח סטרילית.
10. לפני ההשתלה, למלא 20 μl של דבק הפיברין לפגמים ולהפיץ אותם באופן שווה על החלק התחתון של הפגם.
11. ואז להשתיל את קרישי עיתונות מצויד לתוך הפגם בצורת שמונה הדמות.
12. לאחר קרישה, מיקום מחדש של הפיקה בתוך חריץ trochlear ולכופף ולמתוח את הברך כמה פעמים.
13. לעקור את פיקת הברך רוחבית שוב ולבדוק אם פיברינוגן לתא, לקרישים עדיין נמצאים במקום.
14. החלף את פיקת הברך שוב ולסיים את המבצע עם סגירת פצע בשכבות עם תפרי כפתור אחת (Vicryl 4-0) ותפר עורית רציף (Monocryl 4-0) (שניהם עם תפר נספגחומר).
15. לבסוף, לאטום את הפצע עם תרסיס הלבשה חדירה לאדי מים.
16. לטיפול שלאחר ניתוח, הפצע הוא בדק ביום למשך 7 ימים. הארנבונים מקבלים לשיכוך כאבים שלאחר ניתוח Carprofen 4 מ"ג / ק"ג SC כל 24 שעות (במשך 4 ימים) וBuprenorphin 0.03 מ"ג / ק"ג SC כל 12 שעות (עבור 2.5 ימים). ייצוב של הברך (רוטב למשל) הוא לא הכרחי.

תוצאות

הטכניקה כירורגית תאר מאפשרת בידוד מוצלח והשתלה של תאי גזע מזנכימיים אלוגניות לפגם osteochondral מלאכותי. ההתקנה הניסיונית הביאה לשילוב מוצלח של השתל לתוך הסחוס שמסביב.

הפגם היה מלא על ידי רקמת תיקון עם מאפיינים דומים biomechanical ועמידות ד?...

Discussion

בשנים האחרונות, את האפשרות של טיפול במומים מורכבים מפרק osteochondral - כגון אלה הנובעים מdissecans osteochondritis, נמק וטראומה - עם הנדסת רקמות גישות הפכה ליותר ויותר אטרקטיבי. בגופים פתולוגיים שהוזכרו קודם לכן, נזק לרקמות משתרעת על עצם subchondral וכוללת שתי רקמות המתאפיינות ביכולות ריפו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Biochrom AG	F 0415
FCS	PAN Biotech GmbH	0401
Propofol	Fresenius Kabi
Penicillin/Streptomycin	Biochrom AG	A 2210	1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl
PBS Dulbecco (1X)	Biochrom AG	L1815
Ethanol (70%)	Merck KGaA	410230
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154
Biocoll Separation Sol.	Biochrom AG	L6115	Isotonic solution Density: 1,077 g/ml
Trypsin-EDTA 0.05%	Invitrogen GmbH	25300-054
Fentanyl	DeltaSelectGmBH	1819340
NaCl solution (0.9%)	BBraun	8333A193
Syringes (Injekt)	BBraun	4606108V
Needles (Sterican)	BBraun	4657519
Forceps (blunt/sharp)	Aesculap
Scissors	Aesculap
Scalpels	Feather Safety Razor Co	02.001.30.022
Pipettes research	Eppendorf
Bone Cutter	Aesculap
Tissue culture dishes 100 mm/150 mm	TPP AG	93100/93150	Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2
Tissue culture flasks 25/75 mm2	TPP AG	90025/90075	25 mm2, 75 mm2
Centrifuge Tubes (50 ml)	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
CO2 Incubator	Forma Scientific Inc.
Cell culture laminar flow hood Hera Safe	Heraeus Instruments
Sterile saw	Aesculap
Centrifuge Megafuge 2.0 R	Heraeus Instruments
Hemocytometer	Brand GmbH+Co KG	717810	Neubauer
Air operated power drill	Aesculap
TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno	Baxter	2546648
Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl)	Ethicon
Spray dressing (OpSite)	Smith&Nephew	66004978	Permeable for water vapor