Staphylococcus aureus Crecimiento con hemoglobina humana como una fuente de hierro

Resumen

Aquí se describe un ensayo de crecimiento para Staphylococcus aureus Usando hemoglobina como la única fuente de hierro nutrientes disponibles. Este ensayo establece el papel de los factores bacterianos implicados en la hemoglobina derivada de la adquisición de hierro.

Resumen

S. aureus es una bacteria patógena que requiere de hierro para llevar a cabo las funciones metabólicas vitales y causan enfermedades. El depósito más abundante de hierro en el interior del huésped humano es heme, que es el cofactor de la hemoglobina. Para adquirir el hierro de la hemoglobina, S. aureus utiliza un complejo sistema conocido como el determinante superficie regulada por hierro (Isd) del sistema ^1. Los componentes del sistema Isd primero hemoglobina anfitrión bind, a continuación, extraer e importar hemo, y, finalmente, liberar el hierro del grupo hemo en el citoplasma bacteriano ^2,3. Esta vía ha sido diseccionado a través de numerosos estudios in vitro ^4-9. Además, la contribución del sistema de Isd a la infección se ha demostrado repetidamente en modelos de ratón ^8,10-14. El establecimiento de la contribución del sistema de Isd a la hemoglobina derivada de la adquisición de hierro y crecimiento ha demostrado ser más difícil. Ensayos de crecimiento usando hemoglobina como única fuente de hierro son complicadas by la inestabilidad de la hemoglobina disponible comercialmente, contaminando hierro libre en el medio de crecimiento, y la toxicidad asociada con quelantes de hierro. Aquí presentamos un método que supera estas limitaciones. Hemoglobina de alta calidad se preparó a partir de sangre fresca y se almacena en nitrógeno líquido. Hemoglobina purificada se completa en hierro-agotan medio que imitan el entorno pobre en hierro encontrada por patógenos dentro del huésped vertebrado. Al privar S. aureus de hierro libre y se completa con una forma mínimamente manipulados de hemoglobina que inducir el crecimiento de una manera que es totalmente dependiente de la capacidad de unirse a la hemoglobina, extraer hemo, heme pasar a través de la envoltura celular bacteriana y degradar hemo en el citoplasma. Este ensayo será útil para los investigadores que buscan para dilucidar los mecanismos de adquisición de hierro hemoglobin-/heme-derived en S. aureus y posiblemente otros patógenos bacterianos.

Protocolo

1. La purificación de la hemoglobina de la sangre fresca

1. Adquirir sangre humana fresca suplementada con un anticoagulante. Mantener la sangre en hielo oa 4 ° C durante toda la purificación.
2. Centrifugar la sangre durante 20 min a 1.500 x g. Los glóbulos rojos (GR) será en la parte inferior del tubo. Aspirar con cuidado el sobrenadante y resuspender el sedimento suavemente en helado 0,9% (w / v) de solución de NaCl. Repetir la centrifugación y lavar 3 veces.
3. Resuspender el precipitado en 1 volumen de helado de 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Esto induce la lisis de los glóbulos rojos debido a la presión osmótica. Añadir tolueno a ~ 20% del volumen final.
4. Incubar a 4 ° C durante la noche en un asador.
5. Se centrifuga el lisado a 20.000 xg durante 1 hr. Recoger la fracción hemolizado medio dejando intacto el tolueno (flotante en la parte superior) y pellet. Utilizar una pipeta de cuello largo para recoger la fracción intermedia.
6. Pasar a través de filtro de jeringa de 0,44 m. Si la solución contiene partículasla materia y no se puede pasar a través del filtro, repita el paso 1,5.
7. Purificar la hemoglobina (Hb) con una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en columna de intercambio aniónico (Varian, PL-SAX 1.000 Å 8 micras, 150 mm x 4,6 mm). La fase móvil A es 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) y la fase móvil B es 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. Un 0% -100% de gradiente de disolvente B se ejecuta más de 2 min a una velocidad de flujo de 2,0 ml / min. La elución se controla sobre la base de la absorción (λ: 410 nm y 280). Recoger sólo la fracción caracteriza por un color rojo brillante y un pico de absorción prominente (Figura 1).
8. Dializar la elución contra salina tamponada con fosfato (PBS) durante la noche y luego durante unas pocas horas más. Esterilizar mediante el paso a través de un filtro de 0,22 micras jeringa.
9. Para medir la concentración de Hb, preparar las soluciones estándar de concentraciones conocidas de Hb en PBS. Determinar la concentración de Hb en la muestra mediante la mezcla de las soluciones patrón (véase la tabla con reactivos nosotrosed) o la solución de la muestra con el reactivo de Drabkin 2x (preparado a partir de polvo) en una relación 1:1. Por ejemplo, mezclar 100 l solución de Hb con 100 l de reactivo de Drabkin 2x en placas de 96 pocillos. Incubar durante 15 min y la absorbancia medida a 540 nm. Trazar una curva estándar y determinar la concentración de Hb en la muestra. Cinco a quince mg / ml rendimientos son típicos.
10. Ejecutar 15-20 g hemoglobina purificada en un 15% SDS-PAGE por duplicado. Mancha de uno de los geles; transferir las proteínas a partir de otro gel a una membrana de nitrocelulosa y de inmunotransferencia para la hemoglobina (Figura 2).
11. Congelar y almacenar alícuotas de 1 ml de hemoglobina en nitrógeno líquido.

2. Preparación de hierro agotan Medios de Crecimiento

1. Preparar Roswell Park Memorial Institute (RPMI) caldo disolviendo el polvo RPMI en agua, añadir bicarbonato de sodio según lo recomendado por el fabricante y el 1% de ácidos cassamino (CA) (w / v). Esterilizar mediante el paso a través de un filtro de 0,2 micras y refrigerador tiendaerated.
2. Preparar metálica empobrecida en RPMI (NRPMI) mediante la adición de 7% (w / v) Chelex 100 y mezcla durante la noche en una placa de agitación. Eliminar Chelex 100 pasando a través de un filtro de 0,2 micras y almacén refrigerado. Suplemento medios imprescindibles de metales no ferrosos: 25 mM ZnCl _2, 25 mM MnCl _2, 100 mM CaCl ₂ y 1 mM MgCl _2, preparado de antemano como una solución estéril x 1.000. Use recipientes desechables de plástico para este paso para evitar la contaminación de hierro de re-utilizables suministros.

3. Staphylococcus aureus Crecimiento utilizando hemoglobina como una única fuente de hierro

1. Streak S. para el aislamiento de S. aureus en agar tripticasa soja (TSA) de un stock congelado. Incubar a 37 ° C durante 20-24 h.
2. Resuspender etilendiamina-N, N'-bis (2-hidroxifenilacético) (EDDHA) en etanol anhidro a 100 mM. EDDHA no entra en solución, pero se esteriliza por etanol.
3. Añadir EDDHA de RPMI a una concentración final de 0,5 mM. PermitirEDDHA para disolver durante al menos 30 min antes de proceder al siguiente paso. Debido a la variación de lote a lote, la concentración final EDDHA puede ser necesario disminuir a 0,25 mm para permitir el crecimiento bacteriano.
4. Inocular colonias individuales de S. aureus en 5 ml de RPMI que contiene EDDHA en 15 ml con tapón de rosca tubos cónicos. Incubar a 37 ° C con agitación a 180 revoluciones por minuto (rpm) durante 16-20 h.
5. Centrifugar los cultivos de una noche durante 5 min a 7.500 xg y resuspender el precipitado en NRPMI que contiene 0,5 mM EDDHA. Normalizar OD ₆₀₀ a ~ 3.
6. Preparar NRPMI que contiene 2,5 g por ml Hb y EDDHA 0.1-1.0 mM. Debido a la variación entre los lotes, la concentración de EDDHA requerido para quelar el hierro libre en NRPMI puede variar.
7. Subculture 10 l de suspensión bacteriana de la etapa 1 en 3,5 ml NRPMI + EDDHA + Hb en un 15 ml con tapón de rosca tubo cónico.
8. Incubar los cultivos a 37 ° C durante un máximo de 48 horas con agitación a 180 rpm o en un tambor de enrollamiento.
9. Cada hora 12.06 tomar lecturas de OD ₆₀₀ mediante la eliminación de 50 l de la cultura y la mezcla con 150 ml de PBS en placas de 96 pocillos.

Resultados

Hemos purificado hemoglobina humana de hemolizado con HPLC (Protocolo de paso 1,7). Figura 1 muestra registró la absorbancia del eluato a 280 y 410 nm longitud de onda. La fracción 5 se recogió y otras fracciones fueron descartados. Los rendimientos de cinco a quince miligramos de hemoglobina por mililitro de eluato se adquieren. Hemoglobina purificada se analizó por SDS-PAGE por duplicado y los geles se tiñeron para las proteínas o se trasladaron a nitrocelulosa y se inmunotransfirieron (Protocol...

Discusión

El hierro es un nutriente esencial requerido por los organismos de todos los reinos de la vida ^15. En los vertebrados, el hierro es retenido para evitar la toxicidad causada por este elemento. Este secuestro también oculta de hierro de los microbios invasores en un proceso conocido como inmunidad nutricional ^16. En respuesta, los patógenos han desarrollado estrategias que evitan la inmunidad nutricional. Uno de estos mecanismos depende de la hemoglobina, que es la fuente más abundante de hierro ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo / material	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
HPLC columna de intercambio de aniones	Varian	PL1551-3802
Reactivo de Drabkin	Sigma	D5941-6VL
La hemoglobina normal	Pointe Scientific	H7506-STD
RPMI	HyClone	SH30011.02
Chelex 100 sodio forma	Sigma	C7901
EDDHA	LGC Standards GmbH	ANC 001
Hemoglobina un anticuerpo	Santa Cruz Biotechnology, Inc	SC-21005
Agar de soja tríptico	BD	236920