צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות ההמוגלובין אנושי כמקור ברזל

Summary

כאן אנו מתארים assay צמיחה סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות ההמוגלובין כמקור היחידי של ברזל תזונתי זמין. בדיקה זו קובעת את התפקיד של גורמי חיידקים המעורבים ברכישת ברזל המוגלובין נגזר.

Abstract

ס aureus הוא חיידק הפתוגני שדורש ברזל כדי למלא תפקידים מטבוליים חיוניים ובגורמים למחלות. המאגר העשיר ביותר של ברזל בתוך המארח האנושי הוא heme, שהוא cofactor של המוגלובין. לרכישת ברזל מהמוגלובין, ס סטפילוקוקוס מנצל מערכת מורכבת ידועה כגורם המשטח ברזל המוסדר (ISD) ¹ המערכת. מרכיבי ההמוגלובין ISD המערכת הראשון לאגד המארח, ואז לחלץ ולייבא heme, ולבסוף לשחרר ברזל ממקור צמחי בציטופלסמה החיידקים ^2,3. מסלול זה כבר נתח באמצעות מספר רב של מחקרים במבחנת ^4-9. יתר על כן, תרומתה של מערכת ISD לזיהום הודגמה שוב ושוב במודלי עכבר ^8,10-14. הקמת התרומה של מערכת ISD לרכישת ברזל המוגלובין-נגזר וצמיחה הוכיחה להיות יותר מאתגר. מבחני צמיחה באמצעות ההמוגלובין כמקור ברזל בלעדי מסובכים בy חוסר היציבות של המוגלובין הזמין מסחרי, מזהם ברזל חופשי במדיום הגידול, והרעילות הקשורה chelators ברזל. כאן אנו מציגים שיטה המתגברת על מגבלות אלה. המוגלובין באיכות הגבוהה מוכן מדם טרי ומאוחסן בחנקן נוזלי. המוגלובין מטוהר הוא בתוספת ברזל לימוצה בינוני מחקה את סביבת ברזל העניים נתקלה ידי פתוגנים בתוך מארח החוליות. על דרך רעבה ס סטפילוקוקוס של ברזל חופשי ולהשלים עם צורת מניפולציות מינימאליות של המוגלובין נזרז את הצמיחה באופן שתלוי לחלוטין ביכולת לקשור המוגלובין, לחלץ heme, יעבור heme דרך מעטפת תא החיידק ולבזות heme בציטופלסמה. assay זה יהיה שימושי לחוקרים המבקשים להבהיר את המנגנונים של רכישת הברזל hemoglobin-/heme-derived בס סטפילוקוקוס ואולי חיידקים פתוגנים אחר.

Protocol

1. טיהור של המוגלובין מדם טרי

1. לרכוש דם אדם טרי בתוספת נוגדי קרישה. לשמור על דם על קרח או ב 4 ° C בכל הטיהור.
2. צנטריפוגה דם במשך 20 דקות ב1500 x גרם. תאי הדם האדומים (RBCs) יהיו בתחתית של התחתית. בזהירות לשאוב supernatant והעדינות resuspend גלול ב 0.9% (w / v) פתרון NaCl קר כקרח. חזור צנטריפוגה ולשטוף 3 פעמים.
3. Resuspend הגלולה בנפח 1 מתוך קרים כקרח 10 מ"מ טריס-HCl (pH 8.0). זה יניע תמוגה של RBCs עקב לחץ האוסמוטי. הוסף ל~ טולואן נפח סופי של 20%.
4. לדגור על 4 מעלות צלזיוס בצלייה למשך לילה.
5. צנטריפוגה lysate ב20000 XG לשעה 1. לאסוף את שבר hemolysate האמצע עוזב טולואן (צף על גבי) וגלולה ללא פגע. השתמש פיפטה-צוואר ארוך כדי לאסוף את שבר האמצע.
6. עובר דרך מסנן מזרק 0.44 מיקרומטר. אם הפתרון מכיל חלקיקיםעניין ולא יכול להיות מועבר דרך המסנן, חזור על שלב 1.5.
7. לטהר המוגלובין (HB) עם כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהי עמודה (HPLC) אניון חליפין (ריאן, 1000 8 מיקרומטר PL-סקסופון, 150 מ"מ × 4.6 מ"מ). השלב הנייד הוא 10 mM טריס-HCl (pH 8.0) ושלב ב 'נייד הם 10 mM טריס-HCl (pH 8.0) + 0.5 M NaCl. 0% -100% שיפוע של B ממס נדרס 2 דקות בשיעור 2.0 מ"ל / דקת זרימה. Elution מנוטר על בסיס קליטה (λ: 410 ננומטר ו 280 ננומטר). לאסוף רק השבריר מתאפיין בצבע אדום בהיר ושיא ספיגה בולט (איור 1).
8. דיאליזת elution נגד פוספט נאגר מלוח (PBS) למשך הלילה ולאחר מכן לכמה שעות שוב. לעקר על ידי עובר דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.22.
9. כדי למדוד את ריכוז המוגלובין, להכין פתרוני המוגלובין סטנדרטיים של ריכוזים ידועים בPBS. לקבוע את הריכוז של המוגלובין במדגם על ידי ערבוב את הפתרונים הסטנדרטיים (ראה טבלה עם ריאגנטיםed) או פתרון לדוגמא עם ריאגנט של 2x דרבקין (שהוכן מאבקה) ביחס 1:1. לדוגמה, לערבב פתרון Hb 100 μl עם מגיב 100 μl 2x של דרבקין בצלחות 96-כן. דגירה במשך 15 דקות וספיגה במידה 540 ננומטר. להתוות עקומת סטנדרט ולקבוע את ריכוז המוגלובין במדגם. חמש עד 15 תשואות מ"ג / מ"ל ​​הן טיפוסיות.
10. הפעל מיקרוגרם 15-20 המטוהרים המוגלובין על 15% SDS-PAGE בשני עותקים. כתם אחד מהג'לי; להעביר את החלבונים מג'ל אחר על גבי קרום ניטרוצלולוזה וimmunoblot למוגלובין (איור 2).
11. להקפיא ולאחסן 1 aliquots מ"ל של המוגלובין בחנקן נוזלי.

2. הכנת הברזל פוגע תקשורת צמיחה

1. הכן Roswell Park Memorial מכון (RPMI) מרק על ידי המסת אבקת RPMI במים, מוסיף סודה לשתייה כפי שהומלץ על ידי היצרן וחומצות cassamino% 1 (CA) (W / V). לעקר על ידי עובר דרך מסנן 0.2 מיקרומטר והחנות refrigמקורר.
2. הכן מתכת מדולדלת RPMI (NRPMI) על ידי הוספת 7% (w / v) Chelex 100 וערבוב במשך הלילה על צלחת ומערבבים. הסר Chelex 100 על ידי עובר דרך מסנן וחנות בקירור 0.2 מיקרומטר. תוספת תקשורת עם מתכות שאינן ברזל חיוניים: 25 מיקרומטר ZnCl _2, 25 מיקרומטר MnCl _2, 100 מ"מימ CaCl ₂ ו1 המ"מ MgCl ₂ הוכן מראש כפתרון x סטרילי 1000. השתמש בכלי פלסטיק חד פעמים לצעד זה כדי למנוע זיהום מאספקת ברזל מחדש שמישה.

3. צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות המוגלובין כמקור ברזל Sole

1. הרצף ס סטפילוקוקוס לבידוד באגר סויה tryptic (TSA) ממניות קפוא. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 20-24 שעות.
2. Resuspend ethylenediamine-N, ניצבת בין bis (חומצה 2-hydroxyphenylacetic) (EDDHA) באתנול נטול מים עד 100 מ"מ. EDDHA אינו נכנס פתרון אבל מעוקרת על ידי אתנול.
3. הוסף לEDDHA RPMI לריכוז סופי של 0.5 מ"מ. להתירEDDHA לפזר לפחות 30 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא. עקב וריאציה תצווה לתצווה, ריכוז EDDHA סופי ייתכן שיהיה הצורך הוריד ל0.25 מ"מ כדי לאפשר התפתחות חיידקים.
4. לחסן מושבות בודדות של ס סטפילוקוקוס לתוך 5 מ"ל של RPMI מכיל EDDHA ב15 צינורות חרוטי פקק מ"ל. לדגור על 37 ° C עם הרעד ב180 סיבובים לדקה (סל"ד) ל16-20 שעות.
5. צנטריפוגה תרבויות הלילה עבור 5 דקות ב7500 XG וresuspend בגלולה המכילה NRPMI EDDHA 0.5 מ"מ. לנרמל OD ₆₀₀ ל ~ 3.
6. הכן NRPMI המכיל 2.5 מיקרוגרם למ"ל והמוגלובין EDDHA 0.1-1.0 מ"מ. בשל שונות בין הקבוצות, ריכוז EDDHA נדרש Chelate ברזל חופשי בNRPMI עשוי להשתנות.
7. 10 μl תת השעיה של חיידקים מצעד 3.5 לתוך 1 מ"ל NRPMI + + EDDHA המוגלובין בצינור 15 מיליליטר פקק חרוטים.
8. דגירת התרבויות על 37 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות עם הרעד ב180 סל"ד או בתוף מתגלגל.
9. כל 6-12 שעות תיקח ₆₀₀ קריאות OD על ידי הסרת 50 μl של התרבות ולערבב אותו עם 150 μl של PBS בצלחות 96-כן.

תוצאות

יש לנו מטוהר ההמוגלובין אנושי מhemolysate עם HPLC (צעד הפרוטוקול 1.7). איור 1 הקלטות ספיגת eluate ב 280 ואורכי גל 410 ננומטר. חלק 5 נאסף ומקטעים אחרים שנזרקו. תשואות של 5-15 מיליגרם של המוגלובין למ"ל של eluate נרכשות בדרך כלל. המוגלובין מטוהר נותח על ידי SDS-PAGE במשוכפל וג'לים היה...

Discussion

ברזל הוא חומר מזין חיוני הנדרש על ידי אורגניזמים מכל הממלכות של ¹⁵ חיים. בבעלי חוליות, ברזל מבודד את להימנע מרעילות הנגרמת על ידי רכיב זה. תפיסה זו גם מסתירה ברזל מפלישת חיידקים בתהליך המכונה חסינות תזונתית ^16. בתגובה, פתוגנים התפתחו אסטרטגיות עוקפות חסינות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב / חומרים	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
טור חילופי אניון HPLC	ריאן	PL1551-3802
המגיב של דרבקין	סיגמא	D5941-6VL
סטנדרטי המוגלובין	פואנטה מדעית	H7506-STD
RPMI	HyClone	SH30011.02
צורת נתרן Chelex 100	סיגמא	C7901
EDDHA	LGC התקנים GmbH	ANC 001
המוגלובין נוגדן	סנט קרוז ביוטכנולוגיה, Inc	SC-21005
אגר סויה Tryptic	BD	236920