Staphylococcus aureus usando hemoglobina humana como uma fonte de ferro

Gleb Pishchany; Kathryn P. Haley; Eric P. Skaar

doi:10.3791/50072

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Resumo
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Resumo

Descrevemos aqui um ensaio de crescimento de Staphylococcus aureus Usando hemoglobina como a única fonte de ferro nutrientes disponíveis. Este ensaio estabelece o papel dos fatores bacterianos envolvidos na hemoglobina derivada de aquisição de ferro.

Resumo

S. aureus é uma bactéria patogênica que requer ferro para realizar funções vitais metabólicas e causam doenças. O reservatório mais abundante de ferro no interior do hospedeiro humano é heme, que é o cofactor da hemoglobina. Para adquirir ferro da hemoglobina, S. aureus utiliza um elaborado sistema conhecido como o determinante superfície de ferro-regulado (DSI) do sistema ^1. Componentes da hemoglobina Isd sistema host primeiro ligar, em seguida, extrair e importar heme, e, finalmente, libertar ferro de heme no citoplasma bacteriano ^2,3. Este caminho tem sido dissecado através de numerosos estudos in vitro ^4-9. Além disso, a contribuição do sistema Isd a infecção tem sido repetidamente demonstrado em modelos de ratos ^8,10-14. Que institui a contribuição do sistema Isd à hemoglobina derivada de aquisição de ferro e de crescimento tem se mostrado mais desafiador. Ensaios de crescimento utilizando hemoglobina como fonte única de ferro é complicada by a instabilidade da hemoglobina disponível comercialmente, contaminando ferro livre no meio de crescimento, e a toxicidade associada com quelantes de ferro. Aqui apresentamos um método que supera estas limitações. Hemoglobina de alta qualidade é preparado a partir de sangue fresco e armazenado em azoto líquido. Hemoglobina purificada é complementada em ferro-esgotar meio imitando o ambiente pobre em ferro encontrado por agentes patogénicos no interior do hospedeiro vertebrado. Pela fome S. aureus de ferro livre e completando com uma forma minimamente manipuladas de hemoglobina que induzem o crescimento de uma maneira que é totalmente dependente da capacidade de se ligar a hemoglobina, extrair heme, heme passar através do envelope celular bacteriana e degradar heme no citoplasma. Este ensaio será útil para pesquisadores que procuram elucidar os mecanismos de aquisição de ferro em S. hemoglobin-/heme-derived aureus e, eventualmente, outros agentes patogénicos bacterianos.

Protocolo

1. Purificação da hemoglobina a partir de sangue fresco

Adquirir sangue humano fresco suplementado com um anticoagulante. Manter o sangue em gelo ou a 4 ° C durante a purificação.
Centrifugar o sangue durante 20 minutos a 1500 x g. As células vermelhas do sangue (RBC) irá ficar na parte inferior do tubo. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet cuidadosamente em solução gelada de NaCl a 0,9% (w / v). Voltar a centrifugar e lavar 3 vezes.
Ressuspender o sedimento em 1 volume de mM arrefecido com gelo 10 Tris-HCl (pH 8,0). Isto irá induzir a lise dos glóbulos vermelhos devido à pressão osmótica. Adicionar tolueno a ~ 20% do volume final.
Incubar a 4 ° C durante a noite em um espeto.
Centrifuga-se o lisado a 20.000 xg durante 1 hora. Recolher a fracção hemolisado meio deixam os tolueno (flutuante no topo) e pellet. Usar uma pipeta de gargalo longo de recolher a fracção do meio.
Passar através de filtro de seringa de 0,44 | im. Se a solução contiver partículasmatéria e não pode ser passada através do filtro, repetir o passo 1.5.
Purificar a hemoglobina (Hb) com uma cromatografia líquida de alta performance (HPLC) em coluna de permuta aniónica (Varian, PL-SAX 1000 por 8 um, 150 mm x 4,6 mm). A fase móvel A é 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) e a fase móvel B é 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M de NaCl. Um gradiente de 0% -100% de solvente B é administrado ao longo de 2 min a taxa de fluxo de 2,0 ml / min. A eluição é controlada com base na absorção (λ: 410 nm e 280 nm). Recolher apenas a fracção caracterizada por uma cor vermelho brilhante e um pico de absorção proeminente (Figura 1).
Dialisar a eluição contra salino tamponado com fosfato (PBS) durante a noite e, em seguida, por algumas horas, de novo. Esterilizar por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 um.
Para medir a concentração de Hb, preparar soluções-padrão de concentrações conhecidas de hemoglobina em PBS. Determinar a concentração de Hb no exemplo por mistura das soluções-padrão (ver a tabela com reagentes nosed) ou da solução de amostra com o reagente de Drabkin 2x (preparada a partir de pó), a uma proporção de 1:1. Por exemplo, misturar 100 ul de solução de Hb com o reagente de Drabkin 100 ul de 2x, em placas de 96 poços. Incubar durante 15 min e a absorvância medida a 540 nm. Desenhar uma curva padrão e determinar a concentração de Hb na amostra. Cinco a 15 mg / ml rendimentos são típicos.
Executar 15-20 ug purificado hemoglobina em 15% SDS-PAGE em duplicado. Stain um dos géis; transferir as proteínas a partir de um outro gel para uma membrana de nitrocelulose e imunotransf erência para a hemoglobina (Figura 2).
Congelar e armazenar alíquotas de 1 ml de hemoglobina em azoto líquido.

2. Preparação de Ferro-empobrecem meios de crescimento

Prepare Roswell Park Memorial Institute (RPMI) caldo por dissolução do pó de RPMI em água, adicionar bicarbonato de sódio, tal como recomendado pelo fabricante, e 1% de ácidos cassamino (CA) (w / v). Esterilizar por passagem através de um filtro de 0,2 um e refrig lojarado.
Prepare-metal empobrecido RPMI (NRPMI) pela adição de 7% (w / v) Chelex 100 e misturando durante a noite numa placa de agitação. Remover Chelex 100, passando através de um filtro de 0,2 um e armazenamento refrigerado. Suplemento meios essenciais com metais não-ferrosos: 25 fiM _de ZnCl2, 25 mM _de MnCl2, 100 mM _de CaCl2 e 1 _mM de MgCl2 preparado antecipadamente como uma solução estéril x 1000. Use recipientes de plástico descartáveis para esta etapa para evitar a contaminação de ferro a partir de re-utilizáveis suprimentos.

3. Crescimento Staphylococcus aureus utilizando hemoglobina como uma fonte de ferro Sole

Streak S. aureus para isolamento em agar de soja tríptica (TSA) a partir de um estoque congelado. Incubar a 37 ° C durante 20-24 hr.
Ressuspender o ácido etilenodiamino-N, N'-bis (ácido 2-hidroxifenilacético) (EDDHA) em etanol anidro a 100 mM. EDDHA não entra em solução, mas é esterilizada por etanol.
Adicionar EDDHA de RPMI a uma concentração final de 0,5 mM. PermitirEDDHA para dissolver, pelo menos, 30 minutos antes de prosseguir para o passo seguinte. Devido ao lote-a-lote de variação, a concentração final de EDDHA pode precisar de ser reduzidos para 0,25 mM para permitir o crescimento bacteriano.
Inocular colónias isoladas de S. aureus em 5 ml de meio RPMI contendo EDDHA em 15 ml com tampa de rosca tubos cónicos. Incubar a 37 ° C com agitação a 180 rotações por minuto (rpm) durante 16-20 horas.
Centrifugar as culturas durante a noite para 5 min a 7500 xg e ressuspender o sedimento em NRPMI contendo 0,5 mM de EDDHA. Normalizar a OD ₆₀₀ ~ 3.
Prepare NRPMI contendo 2,5 ug por ml de Hb e 0,1-1,0 mM EDDHA. Devido a variação entre os lotes, a concentração necessária EDDHA de quelação de ferro livre no NRPMI pode variar.
Ul subcultura 10 de suspensão bacteriana a partir do passo 3,5 em 1 ml NRPMI + + EDDHA Hb num tubo de 15 ml com tampa de rosca cónica.
Incubar as culturas a 37 ° C durante até 48 horas com agitação a 180 rpm ou num tambor giratório.
Cada hr 6-12 tomar leituras de DO _600, removendo 50 ul da cultura e da sua mistura com 150 ul de PBS, em placas de 96 poços.