Staphylococcus aureus Wachstum mit menschlichen Hämoglobins als Eisenquelle

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Wachstum Assay für Staphylococcus aureus Mit Hämoglobin als die alleinige Quelle der verfügbaren Nährstoff Eisen. Dieser Test stellt die Rolle der bakteriellen Faktoren in Hämoglobin-derived Eisenaufnahme beteiligt.

Zusammenfassung

S. aureus ist ein Bakterium, das Eisen durchzuführen lebenswichtige Stoffwechselfunktionen und Krankheiten verursachen erfordert. Das häufigste Reservoir von Eisen im menschlichen Wirt Häm, das der Cofaktor von Hämoglobin ist. Eisen aus Hämoglobin erwerben, S. aureus nutzt ein ausgeklügeltes System, wie der Eisen-regulierten Oberfläche Determinante (Isd) System ¹ bekannt. Komponenten des Isd System zuerst bind Host Hämoglobin, dann extrahieren und importieren Häm, und schließlich befreien Eisen aus Häm in dem bakteriellen Zytoplasma ^2,3. Dieser Weg ist durch zahlreiche in-vitro-Studien ^4-9 wurden seziert. Ferner hat der Beitrag des Isd-System auf eine Infektion immer wieder in Mausmodellen ^8,10-14 demonstriert. Gründung der Beitrag des Isd System Hämoglobin-abgeleiteten Eisenaufnahme und das Wachstum hat sich als größere Herausforderung. Growth Assays mit Hämoglobin als einziger Eisenquelle kompliziert by die Instabilität von handelsüblichen Hämoglobin, kontaminierenden freiem Eisen im Nährmedium und Toxizität mit Eisenchelatoren verbunden. Hier präsentieren wir eine Methode, die diese Beschränkungen überwindet. Hochqualitative Hämoglobin wird aus frischem Blut hergestellt und in flüssigem Stickstoff gelagert. Gereinigtes Hämoglobin in ergänzt Eisen-Abbau Mediums imitiert die Eisen-armen Umgebung von Krankheitserregern in der Wirbeltier-Wirt gestoßen. Von hungernden S. aureus von freiem Eisen und Ergänzung mit einer minimal manipulierte Form von Hämoglobin zu induzieren wir Wachstum in einer Weise, die völlig abhängig von der Fähigkeit, Hämoglobin binden, zu extrahieren Häm, Häm passieren durch die bakterielle Zellwand und degradieren Häm im Zytoplasma ist. Dieser Test wird für Forscher, die die Mechanismen der hemoglobin-/heme-derived Eisenaufnahme in S. aufzuklären nützlich aureus und möglicherweise auch andere bakterielle Erreger.

Protokoll

Ein. Reinigung von Hämoglobin aus frischem Blut

1. Erwerben frisches menschliches Blut mit einem Antikoagulans ergänzt. Halten Sie Blut auf Eis oder bei 4 ° C während der Reinigung.
2. Zentrifuge Blut für 20 min bei 1.500 x g beträgt. Die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) wird am Boden der Röhre liegen. Vorsichtig den Überstand aspirieren und sanft das Pellet in eiskaltem 0,9% (w / v) NaCl-Lösung. Wiederholen Sie die Zentrifugation und 3 x waschen.
3. Das Pellet in 1 Volumen eiskaltem 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Dies induziert die Lyse der Erythrozyten durch osmotischen Druck. Fügen Toluol zu ~ 20% Endvolumen.
4. Inkubation bei 4 ° C auf einem Drehspieß Nacht.
5. Zentrifuge das Lysat bei 20.000 xg für 1 Stunde. Sammeln Sie die Mitte Hämolysat Bruchteil Verlassen des Toluol (floating on top) und Pellet unberührt. Verwenden Sie einen Langhals-Pipette auf die mittlere Fraktion zu sammeln.
6. Fahren Sie durch 0,44 um Spritzenfilter. Enthält die Lösung teilchenförmigenMaterie und nicht durch das Filter geleitet werden, Schritt 1.5.
7. Läutern Hämoglobin (Hb) mit einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) Anionenaustauschersäule (Varian, PL-SAX 1.000 Å 8 um, 150 mm × 4,6 mm). Die mobile Phase A ist 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und die mobile Phase B ist 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. A 0% -100% Gradienten von Lösungsmittel B ist über 2 min bei 2,0 ml / min Flussrate laufen. Die Elution wird basierend auf Absorption überwacht (λ: 410 nm und 280 nm). Sammeln nur den Bruch durch eine leuchtend rote Farbe und ein prominenter Absorptionspeak (Abbildung 1).
8. Dialysieren die Elution gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) über Nacht und dann für einige Stunden wieder. Sterilisieren, indem sie durch eine 0,22 um Spritzenfilter.
9. Um Hb-Konzentration zu messen, bereiten Standard-Hb-Lösungen bekannter Konzentrationen in PBS. Bestimmung der Konzentration von Hb in der Probe durch Mischen der Standard-Lösungen (siehe Tabelle mit den Reagenzien unsed) oder die Probenlösung mit 2x Drabkin-Reagenz (hergestellt aus Pulver) im Verhältnis 1:1. Beispielsweise mischen 100 ul Hb-Lösung mit 2x 100 ul Drabkin-Reagenz in 96-Well-Platten. Inkubieren für 15 min und Messung der Extinktion bei 540 nm. Plotten einer Standardkurve und bestimmen die Hb-Konzentration in der Probe. Fünf bis fünfzehn mg / ml Erträge sind typisch.
10. Führen 15-20 ug gereinigtes Hämoglobin auf einem 15% SDS-PAGE in zweifacher Ausfertigung. Flecken eines der Gele; übertragen die Proteine ​​aus einem anderen Gel auf eine Nitrocellulosemembran und Immunoblot für Hämoglobin (Abbildung 2).
11. Einfrieren und lagern 1 ml Aliquots von Hämoglobin in flüssigem Stickstoff.

2. Herstellung von Eisen-Abbau Growth Media

1. Planen Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Brühe durch Auflösen des Pulvers in RPMI Wasser, fügt Natriumhydrogencarbonat, wie vom Hersteller und 1% cassamino Säuren (CA) (w / v) empfohlen. Sterilisieren, indem sie durch einen 0,2 um Filter und Speicher refrigerated.
2. Planen Metall abgereicherten RPMI (NRPMI) durch Zugabe von 7% (w / v) Chelex 100 und Mischen über Nacht auf einer Rührplatte. Entfernen Chelex 100, indem sie durch einen 0,2 um Filter und gekühlt. Zuschlag Medien mit wesentlichen Nicht-Eisen-Metalle: 25 uM ZnCl _2, 25 uM MnCl _2, 100 mM CaCl ₂ und 1 mM MgCl ₂ im Voraus als sterile 1.000 x Lösung hergestellt. Verwenden Sie Einweg-Kunststoff-Behältern für diesen Schritt, um Eisen Kontamination von wieder verwendbaren Lieferengpässe zu vermeiden.

3. Staphylococcus aureus Wachstum mit Hämoglobin als einziger Eisenquelle

1. Streak S. aureus zur Isolierung von tryptischen Soja-Agar (TSA) aus einem gefrorenen Lager. Bei 37 ° C für 20-24 Stunden.
2. Resuspendieren Ethylendiamin-N, N'-Bis (2-hydroxyphenylessigsäure) (EDDHA) in wasserfreiem Ethanol zu 100 mM. EDDHA nicht in Lösung gehen, aber durch Ethanol sterilisiert.
3. Hinzufügen EDDHA zu RPMI bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM. ErlaubenEDDHA für mindestens 30 min, bevor zum nächsten Schritt aufzulösen. Aufgrund von Charge zu Charge Variation kann endgültigen EDDHA Konzentration müssen bis 0,25 mM abgesenkt werden, um das Bakterienwachstum zu ermöglichen.
4. Beimpfen einzelne Kolonien von S. aureus in 5 ml RPMI mit EDDHA in 15 ml mit Schraubverschluss konische Röhrchen. Bei 37 ° C unter Schütteln mit 180 Umdrehungen pro Minute (rpm) für 16-20 Stunden.
5. Zentrifugieren Sie die Übernacht-Kulturen für 5 min bei 7.500 xg und das Pellet in NRPMI mit 0,5 mM EDDHA. Normalisieren OD ₆₀₀ bis ~ 3.
6. Bereiten NRPMI mit 2,5 ug pro ml Hb und 0,1-1,0 mM EDDHA. Durch Variation zwischen den Losen kann die EDDHA Konzentration erforderlich, um freies Eisen in NRPMI Chelat variieren.
7. Subculture 10 ul der Bakteriensuspension von Schritt 3,5 in 1 ml NRPMI + EDDHA + Hb in einem 15 ml mit Schraubverschluss konischen Rohr.
8. Inkubieren der Kulturen bei 37 ° C für bis zu 48 Stunden unter Schütteln bei 180 UpM oder einer Rolltrommel.
9. Jeder 6-12 hr nehmen OD ₆₀₀ Lesungen, indem 50 ul der Kultur und Mischen mit 150 ul PBS in 96-Well-Platten.

Ergebnisse

Wir haben gereinigtes humanes Hämoglobin aus Hämolysat mit HPLC (Protocol Schritt 1,7). Abbildung 1 zeigt aufgezeichnete Absorption des Eluats bei 280 und 410 nm Wellenlänge. Fraktion 5 wurde gesammelt und anderen Fraktionen wurden verworfen. Ausbeuten von fünf bis fünfzehn Milligramm Hämoglobin pro Milliliter des Eluats werden typischerweise erworben. Gereinigtes Hämoglobin wurde durch SDS-PAGE analysiert und in doppelter Ausführung wurden die Gele entweder für Proteine ​​gefärbt oder auf...

Diskussion

Eisen ist ein wichtiger Nährstoff, die durch Organismen aus allen Reichen des Lebens ¹⁵ erforderlich. Bei Wirbeltieren wird Eisen sequestriert, um die Toxizität von diesem Element zu vermeiden. Diese Sequestrierung birgt auch Eisen aus eindringende Mikroben in einem Prozess als Nahrungsergänzungsmittel Immunität ¹⁶ bekannt. In Reaktion darauf haben die Erreger Strategien, Ernährung Immunität zu umgehen entwickelt. Ein solcher Mechanismus beruht auf Hämoglobin, das ist der häufigste Quelle v...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz / Material	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
HPLC Anionenaustauschersäule	Varian	PL1551-3802
Drabkin-Reagenz	Sigma	D5941-6VL
Hämoglobin-Standard	Pointe Scientific	H7506-STD
RPMI	HyClone	SH30011.02
Chelex 100 Natrium-Form	Sigma	C7901
EDDHA	LGC Standards GmbH	ANC 001
Hämoglobin ein Antikörper	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-21.005
CASO-Agar	BD	236920