Золотистый стафилококк рост использования человеческого гемоглобина в качестве источника железа

Gleb Pishchany; Kathryn P. Haley; Eric P. Skaar

doi:10.3791/50072

АВТОРЫ

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Method Article

Золотистый стафилококк рост использования человеческого гемоглобина в качестве источника железа

DOI:

10.3791/50072

⸱

February 7th, 2013

Gleb Pishchany¹, Kathryn P. Haley¹, Eric P. Skaar¹

¹Department of Pathology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University Medical School

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Резюме

Здесь мы опишем тест для роста Золотистый стафилококк С помощью гемоглобина в качестве единственного источника доступных питательных железа. Этот анализ устанавливает роль бактериальных факторов, влияющих на гемоглобин полученных приобретения железа.

Аннотация

Золотистого стафилококка является патогенная бактерия, которая требует железо для выполнения жизненно важных функций обмена веществ и вызывают болезнь. Наиболее распространенными водохранилища железа внутрь человеческого организма является гема, который является кофактором гемоглобина. Для получения железа из гемоглобина, С. золотистого использует сложные системы, известной как железо-регулируемых поверхности определителя (Isd) системы ^1. Компоненты Isd системы в первую очередь связывают гемоглобин хоста, а затем извлечь и импортировать гема, и, наконец, освобождение железа из гема в бактериальной цитоплазме ^2,3. Этот путь был расчлененный через многочисленные лабораторные исследования ^4-9. Кроме того, вклад Isd системы инфекцию неоднократно продемонстрирована на мышах ^8,10-14. Создание вклад Isd система гемоглобина, полученных железа приобретения и рост оказался более сложным. Рост анализов с использованием гемоглобина в качестве единственного источника железа сложно бУ нестабильность коммерчески доступных гемоглобина, загрязняя свободного железа в питательной среде, и токсичность, связанная с железом энтеросорбенты. Здесь мы представляем метод, который преодолевает эти ограничения. Высокий гемоглобин качества получается из свежей крови и хранится в жидком азоте. Очищенная гемоглобина дополняется в железо-разрушающих среднего имитируя железа плохих условиях, с которыми сталкивается патогенов внутри позвоночного хозяина. К голодающим С. золотистого свободного железа и дополнения с минимально манипулировать формой гемоглобина Мы вызвать рост в манере, которая полностью зависит от способности связывать гемоглобин, извлечь гема, проходит через гема бактериальной клетки конверт и ухудшить гема в цитоплазме. Этот анализ будет полезен для исследователей, стремящихся выяснения механизмов hemoglobin-/heme-derived приобретения железа в S. стафилококка и, возможно, других бактериальных патогенов.

протокол

1. Очистка гемоглобина от Fresh Blood

Получить свежую человеческую кровь дополнить антикоагулянта. Держите кровь на льду или при температуре 4 ° С в течение очистки.
Центрифуга крови в течение 20 мин при 1500 х г. Красных кровяных клеток (эритроцитов) будет в нижней части трубы. Осторожно аспирации супернатант и осторожно ресуспендируют осадок в ледяной 0,9% (вес / объем) раствора NaCl. Повторите центрифугирования и промыть 3 раза.
Ресуспендируют гранул в 1 объеме ледяного 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0). Это приведет к лизису эритроцитов вследствие осмотического давления. Добавить толуола до ~ 20% конечного объема.
Инкубировать при температуре 4 ° С на вертеле в течение ночи.
Центрифуга лизата при 20000 х г в течение 1 часа. Сбор средней фракции гемолизата оставив толуол (плавающая сверху) и гранул нетронутым. Используйте длинную шею-пипетка для сбора средней фракции.
Пройдите через 0,44 мкм фильтр шприца. Если раствор содержит частицыматерия и не могут быть переданы через фильтр, повторите шаг 1,5.
Очищают гемоглобина (Hb) с высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) анионообменную колонку (Varian, PL-SAX 1000 в 8 мкм, 150 мм х 4,6 мм). В качестве подвижной фазы составляет 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0) и подвижной фазы B является 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0) + 0,5 М NaCl. 0% -100% градиентом растворителя B выполняется в течение 2 мин при 2,0 мл / мин, скорость потока. Элюирования контролируется на основе поглощения (λ: 410 нм и 280 нм). Собирайте только фракция характеризуется ярко-красный цвет и видный пик поглощения (рис. 1).
Диализировать элюирования против фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение ночи, а затем в течение нескольких часов снова. Стерилизовать при прохождении через фильтр 0,22 мкм шприц.
Для измерения концентрации гемоглобина, готовят стандартные растворы гемоглобина известных концентраций в PBS. Определить концентрацию гемоглобина в образце путем смешивания стандартного решения (см. таблицу с реагентами насред) или раствор образца с реагентом 2x Драбкин (в приготовленный из порошка) в соотношении 1:1. Например, смешать 100 мкл раствора гемоглобина с реагентом 100 мкл 2x Драбкин в 96-луночных планшетах. Инкубировать в течение 15 мин и измеряют оптическую плотность при 540 нм. Постройте стандартную кривую и определить концентрацию гемоглобина в образце. От пяти до пятнадцати мг / мл дает являются типичными.
Выполнить 15-20 мкг очищенного гемоглобина на 15% SDS-PAGE в двух экземплярах. Пятно одним из гелей, передает белки от другого геля на нитроцеллюлозные мембраны и иммуноблот для гемоглобина (рис. 2).
Замораживание и хранение 1 мл аликвоты гемоглобина в жидком азоте.

2. Подготовка железной разрушающих Медиа роста

Подготовка Roswell Park Memorial Institute (RPMI) бульона путем растворения порошка в RPMI воды, добавьте бикарбонат натрия в соответствии с рекомендациями производителя и 1% cassamino кислоты (CA) (вес / объем). Стерилизовать при прохождении через фильтр 0,2 мкм и магазин холодильниковускоренными.
Подготовка металла обедненный RPMI (NRPMI), добавив 7% (вес / объем) Chelex 100 и перемешивания в течение ночи на магнитной мешалки. Удалить Chelex 100, проходя через фильтр 0,2 мкм и хранить в холодильнике. Дополнение сред с существенным цветных металлов: 25 мкМ ZnCl _2, 25 мкМ MnCl _2, 100 мМ CaCl ₂ и 1 мМ MgCl _2, заранее подготовленных в виде стерильного 1000 х решение. Использование одноразовых пластиковых контейнеров для этого шага, чтобы избежать загрязнения железом из повторно используемых материалов.

3. Золотистый стафилококк рост использования Гемоглобин в качестве единственного источника Железная

Подряд S. золотистый для изоляции на триптического соевый агар (TSA) из замороженного запаса. Инкубировать при 37 ° С в течение 20-24 часов.
Ресуспендируют этилендиамин-N, N'-бис (2-гидроксифенилуксусной кислоты) (EDDHA) в безводном этаноле до 100 мМ. EDDHA не переходит в раствор, но стерилизуют этанолом.
Добавить EDDHA в RPMI до конечной концентрации 0,5 мМ. ПозволятьEDDHA распустить в течение по крайней мере 30 минут, прежде чем переходить к следующему шагу. Благодаря партии к партии изменения, конечная концентрация EDDHA возможно, должны быть снижены до 0,25 мм, чтобы рост бактерий.
Инокулировать одной колонии S. золотистый в 5 мл RPMI содержащие EDDHA в 15 мл завинчивающейся крышкой конических труб. Инкубировать при 37 ° C при встряхивании на 180 оборотов в минуту (RPM) в течение 16-20 часов.
Центрифуга ночь культур в течение 5 мин при 7500 мкг и ресуспендируют осадок в NRPMI, содержащего 0,5 мМ EDDHA. Нормализация OD ₆₀₀ до ~ 3.
Подготовка NRPMI, содержащего 2,5 мкг на мл Hb и 0,1-1,0 мм EDDHA. Из-за различий между партиями, концентрация EDDHA, необходимых для хелатные свободного железа в NRPMI могут отличаться.
Субкультура 10 мкл бактериальной суспензии с шагом 3,5 в 1 мл NRPMI + + EDDHA Hb в 15 мл завинчивающейся крышкой коническую трубку.
Инкубируют культуры при 37 ° С в течение 48 ч при встряхивании при 180 оборотах в минуту или по скользящему барабан.
каждые 6-12 часов принять OD ₆₀₀ показаний путем удаления 50 мкл культуры и смешивая его с 150 мкл PBS в 96-луночных планшетах.