Demir Kaynağı Olarak İnsan Hemoglobin kullanarak Staphylococcus aureus Büyüme

Özet

Burada bir büyüme tahlil tarif Staphylococcus aureus Mevcut besin demir tek kaynak olarak hemoglobin kullanarak. Bu testte elde edilen hemoglobin demir elde etme ile ilgili bakteri faktörlerin rolü kurar.

Özet

S. aureus hayati metabolik fonksiyonları ve hastalık yapan yürütmek için demir gerektiren bir patojen bakteridir. Insan konak içindeki demirin en bol rezervuar hemoglobin kofaktörüdür heme vardır. Hemoglobin demir elde etmek için, S. aureus demir-regüle yüzey belirleyicisi (Isd) sistemi ¹ olarak bilinen karmaşık bir sistem kullanır. Isd sistem ilk bind konak hemoglobin Bileşenleri, daha sonra ayıklamak ve heme ithalat ve nihayet bakteriyel sitoplazma ^2,3 heme demir kurtarmak. Bu yol vitro çalışmalar ^4-9 sayısız aracılığıyla diseke edilmiştir. Ayrıca, enfeksiyon için Isd sistemin katkısı art arda ^8,10-14 fare modellerinde ortaya konmuştur. Hemoglobin kaynaklı demir edinimi Isd sistemin katkısı kurulması ve büyüme daha zorlu olduğu kanıtlanmıştır. Bir tek demir kaynağı olarak hemoglobin kullanarak Büyüme deneyleri b karmaşıktıry büyüme ortamında serbest demir kirletici ticari olarak temin hemoglobin kararsızlık, ve demir şelatlar ile ilişkili toksisite. İşte biz bu sınırlamalarının üstesinden bir yöntem sunuyoruz. Yüksek kaliteli hemoglobin taze kandan hazırlanmıştır ve sıvı azot içinde saklanır. Arıtılmış hemoglobin içine ilave edilir, orta omurgalı konukçu içerisindeki patojenlerin karşılaştığı demir-fakir ortamda taklit demir tüketmek. S. açlıktan tarafından serbest demir aureus ve biz, hemoglobin bağlamak heme ayıklamak, bakteri hücre zarfı ile heme geçmek ve sitoplazmada heme aşağılamak yeteneğini tamamen bağımlı bir şekilde büyümesine neden hemoglobin minimal manipüle formu ile ilave. Bu tahlil S. hemoglobin-/heme-derived demir iktisap mekanizmaları aydınlatmak isteyen araştırmacılar için yararlı olacaktır aureus ve muhtemelen diğer bakteriyel patojenler.

Protokol

1. Taze Kan gelen Hemoglobin saflaştırılması

1. Bir antikoagülan ile desteklenmiş taze insan kanı edinin. Saflaştırma boyunca buz üzerinde veya 4 de kan ° C tutun.
2. 1,500 x g'de 20 dakika boyunca kan santrifüjleyin. Kırmızı kan hücrelerinin (eritrositler), tüpün altında olacaktır. Dikkatlice süpernatan aspire ve yavaşça buz gibi soğuk% 0.9 (ağırlık / hacim) NaCl solüsyonu içinde pelet tekrar süspansiyon. Santrifüj tekrarlayın ve 3 kez yıkayın.
3. Buz gibi soğuk 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ve 1 hacim içinde pellet yeniden süspanse edin. Bu ozmotik basınç nedeniyle eritrositlerde parçalanma neden olacaktır. ~% 20 son hacim toluen ekleyin.
4. Gecede bir et lokantası 4 ° C'de inkübe edin.
5. 1 saat boyunca 20.000 xg'de lizat santrifüjleyin. Toluen (üstünde yüzen) ve pelet dokunulmazken ortasında hemolizat fraksiyonu toplayın. Orta kısmı toplamak için bir uzun saplı pipet kullanın.
6. 0.44 mikron şırınga filtresi Pass through. Çözelti partikül içeriyorsamadde ve adım 1.5 tekrarlayın, filtreden geçtikten edilemez.
7. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile hemoglobin (Hb) Purify (HPLC) anyon değişim kolonuna (Varian, PL-SAX 1.000 Å 8 mikron, 150 mm × 4,6 mm). A, mobil faz mM Tris-HCl (pH 8.0) ve mobil faz B, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 0.5 M NaCl, 10. Çözücü B A% 0 -100% eğim 2.0 ml / dk akış oranında 2 dakika boyunca çalışır. (: 410 ve 280 nm λ) elüsyon emilimi esas izlenir. Parlak kırmızı renkli ve önemli bir emme zirve (Şekil 1) ile karakterize sadece fraksiyonu toplayın.
8. Karşı elüsyon Dialyze fosfat-tamponlu tekrar salin (PBS) bir karışımı, ve daha sonra birkaç saat karıştırıldı. 0.22 um bir şırınga filtresinden geçirerek sterilize edilir.
9. Hb konsantrasyonu ölçmek için, PBS içinde konsantrasyonu bilinen standart Hb çözümler hazırlamak. (Tr reaktifleri ile tabloya bakınız standart çözeltilerin karışımı ile örnek olarak Hb konsantrasyonunun tespit edilmesied) veya bir 1:1 oranında 2x Drabkin reaktifi (tozundan hazırlanan) ile numune çözeltisi. Örneğin, 96 oyuklu plakalar 100 ul 2x Drabkin reaktifi ile 100 ul Hb çözelti ilave edilir. 540 nm'de 15 dk ve önlem absorbans inkübe. Bir standart eğrisi çizilir ve örnek olarak Hb konsantrasyonu belirlenir. Beş ila on beş mg / ml verimleri tipiktir.
10. Çoğaltmak% 15 SDS-PAGE üzerine hemoglobin saflaştırılmış 15-20 mikrogram çalıştırın. Jellerin bir Leke; hemoglobin için bir nitroselüloz zar ve immunoblot (Şekil 2) üzerine başka bir jel proteinleri aktarın.
11. Freeze ve sıvı azot içinde hemoglobin 1 ml alikotları saklayın.

2. Hazırlanması Demir deplete Büyüme Medya

1. Üreticiler ve% 1 cassamino asit (CA) (w / v) tarafından tavsiye edildiği gibi sodyum bikarbonat eklemek, su içinde eritilerek toz RPMI Roswell Park Memorial Institute (RPMI) et suyu hazırlayın. 0.2 um bir filtreden ve mağaza refrig geçirilerek sterilizeçalıştırılamaz.
2. % 7 (ağırlık / hacim) Chelex-100 ekleme ve bir karıştırma plakası üzerinde gece boyunca karıştırma ile metal-azalmış RPMI (NRPMI) hazırlayın. 0.2 um bir filtreden ve buzdolabında depo üzerinden geçerek Chelex-100 çıkarın. 25 uM ZnCl _2, 25 uM MnCl _2, 100 _mM CaCl2 ve 1 mM steril 1.000 x çözüm olarak önceden hazırlanmış _MgCl2: esansiyel demir dışı metaller ile medya tamamlayın. Yeniden kullanılabilir malzemeler demir kontaminasyonu önlemek için bu adımı için tek kullanımlık plastik kaplar kullanın.

Bir Sole Demir Kaynağı Olarak Hemoglobin kullanarak 3. Staphylococcus aureus Büyüme

1. Streak S. Donmuş bir stoktan triptik soya agar (TSA) üzerinde yalıtım aureus. 20-24 saat süre ile 37 ° C'de inkübe edin.
2. Yeniden süspanse etilendiamin-N, 100 mM e kadar susuz etanol içinde N'-bis (2-hidroksifenilasetik asit) (EDDHA). EDDHA çözüm içine gitmez ama etanol ile steril edilmiştir.
3. 0.5 mM nihai konsantrasyon RPMI için EDDHA ekleyin. Izin vermekEDDHA sonraki adıma geçmeden önce, en az 30 dakika eritin. Partiden partiye varyasyon nedeniyle, nihai konsantrasyon EDDHA bakteri oluşumuna izin vermek için 0.25 mM e indirilmesi gerekir.
4. S. tek koloniler inoküle RPMI 15 ml'lik vida kapaklı konik bir tüp içinde EDDHA ihtiva eden 5 ml içine aureus. 16-20 saat boyunca dakika (rpm) başına 180 devir az sallama ile 37 ° C'de inkübe edin.
5. 7.500 x g'de 5 dakika boyunca gecede kültürleri santrifüjleyin ve NRPMI 0.5 mM EDDHA içeren yılında pelet tekrar süspansiyon haline getirin. ~ 3 OD ₆₀₀ Normalize.
6. NRPMI ml Hb başına 2.5 mikrogram ve 0.1-1.0 mM EDDHA içeren hazırlayın. Gruplar arası varyasyon nedeniyle, NRPMI serbest demir şelatların döküntülerini büyütmek için gerekli olan konsantrasyon EDDHA değişebilir.
7. 15 ml vidalı kapaklı konik tüp içinde 1 ml NRPMI + EDDHA + Hb içine adım 3,5 bakteriyel süspansiyonun Altkültür 10 ul.
8. 180 rpm'de veya haddeleme davul sallayarak ile 48 saat için 37 ° C'de kültür inkübe edin.
9. Her 6-12 saat 96-kuyucuğu içinde kültür 50 ul kaldırma ve PBS 150 ul ile karıştırılarak OD ₆₀₀ okuma alabilir.

Sonuçlar

Biz HPLC (Protokol adım 1.7) ile hemolizat insan hemoglobin Temizlendikleri. Şekil 1 gösterir 280 ve 410 nm dalga boylarında eluat absorbans kaydedildi. Fraksiyon 5 toplandı ve diğer fraksiyonlar atıldı. Eluat mililitrede hemoglobin beş ile on beş miligram Verimleri genellikle elde edilir. Saflaştırılmış hemoglobin kopya halinde SDS-PAGE ile analiz edildi ve jeller ya da proteinler için boyandı ya da nitroselüloz üzerine transfer edildi ve (Protokol adım 1.10, Şekil 2)

Tartışmalar

Demir yaşamın ¹⁵ tüm krallıklardan organizmalar tarafından gerekli olan temel bir besindir. Omurgalılar, demir bu öğe tarafından kaynaklanan zehirlenme önlemek için tecrit edilir. Bu haciz de beslenme bağışıklık ¹⁶ olarak bilinen bir süreçte mikroplar istila demir gizler. Buna karşılık, patojenler beslenme bağışıklık engelleyecek stratejiler geliştirmişlerdir. Böyle bir mekanizma hemoglobin dayanır, hangi ana ¹⁷ içindeki demirin en bol kaynağıdır. Hemogl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / Malzeme Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
HPLC anyon değişim kolonuna	Varian	PL1551-3802
Drabkin reaktifi	Sigma	D5941-6VL
Hemoglobin standart	Pointe Scientific	H7506-STD
RPMI	HyClone	SH30011.02
Chelex 100 sodyum formu	Sigma	C7901
EDDHA	LGC Standartları GmbH	ANC 001
Hemoglobin bir antikor	Santa Cruz Biotechnology, Inc	SC-21005
Triptik Soy Agar	BD	236920