JoVE Logo
저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

여기에 대한 성장 분석을 설명 포도상 구균 사용 가능한 영양 철의 단독 소스로 헤모글로빈을 사용합니다. 이 분석은 헤모글로빈 - 파생 철 인수에 참여 세균 요소의 역할을 설정합니다.

초록

S. 구균이 중요한 신진 대사 기능과 원인 질환을 수행 할 철 필요로하는 병원성 세균입니다. 인간의 호스트 내부의 철의 가장 풍부한 저수지는 헤모글로빈의 cofactor이다 헴입니다. 헤모글로빈의 철을 취득하려면, S. 구균은 철 - 규제 표면 결정자 (Isd) 시스템 1로 알려진 정교한 시스템을 활용합니다. Isd 시스템 첫째 바인드 호스트 헤모글로빈의 구성 요소는 다음 추출하고 헴을 가져, 그리고 마지막으로 박테리아 세포질 2,3에 헴의 철을 해방. 이 경로는 체외 연구 4-9에서 수많은 통해 해부되었습니다. 또한, 감염 Isd 시스템의 후원금이 반복적으로 마우스 모델 8,10-14에서 입증되었습니다. 헤모글로빈 - 파생 철 수집에 Isd 시스템의 기여를 설립하고 성장은 점점 더 어려워 것으로 증명되었습니다. 단독 철 소스로 헤모글로빈을 사용하여 성장 assays는 B 복잡y는 성장 매체에 무료로 철을 오염 상업적으로 이용 가능한 헤모글로빈의 불안정, 그리고 철 chelators과 관련된 독성. 여기 우리는 이러한 한계를 극복하는 방법을 제시한다. 고품질의 헤모글로빈은 신선한 혈액 준비되어 있으며 액체 질소에 저장됩니다. 정화 헤모글로빈이로 보완되어 매체는 척추 호스트 내부의 병원균에 의해 발생 철 - 가난한 환경을 모방 철 (iron) - 고갈시킵니다. S.를 굶주리고하여 무료 철의 구균과 우리가 헤모글로빈을 묶는 헴를 추출, 세균 세포 봉투를 통해 헴에 합격하고 세포질에서 헴을 저하 할 수있는 능력에 전적으로 의존하는 방식으로 성장을 유도 헤모글로빈의 최소한 조작 양식을 보완. 이 분석은 S.에 hemoglobin-/heme-derived 철 획득의 메커니즘을 명료하게하다하고자하는 연구자에 유용합니다 구균 및 기타 세균 병원체.

프로토콜

1. 신선한 혈액에서 헤모글로빈의 정화

  1. 항응고제로 보충 신선한 인간의 피를 취득. 정화에 걸쳐 얼음이나 4에 혈액 ° C세요.
  2. 1500 X g에서 20 분 피를 원심 분리기. 적혈구은 (적혈구) 튜브의 하단에 있습니다. 조심스럽게 표면에 뜨는을 대기음 부드럽게 얼음처럼 차가운 0.9 % (w / V) NaCl 용액에서 펠렛을 resuspend. 원심 분리를 반복 3 회 씻는다.
  3. 얼음처럼 차가운 10 MM 트리스 - HCL (산도 8.0) 1 볼륨에 펠렛을 Resuspend. 이 삼투압에 의한 적혈구의 용해를 유도합니다. ~ 20 % 최종 볼륨에 톨루엔을 추가합니다.
  4. 밤새 회전 통닭에 4 ° C에서 알을 품다.
  5. 1 시간에 20,000 XG에서 lysate를 원심 분리기. 톨루엔 (상단에 떠있는)와 펠렛 훼손되지 않은 떠나 중간 hemolysate 분수를 수집합니다. 중앙 분수를 수집하는 긴 목 피펫을 사용합니다.
  6. 0.44 μm 주사기 필터를 통해 전달합니다. 솔루션은 미립자가 포함 된 경우물질과는 단계 1.5를 반복 필터를 통과 할 수 없습니다.
  7. 고성능 액체 크로마토 그래피와 헤모글로빈 (HB)를 정화 (HPLC) 음이온 교환 컬럼 (Varian, PL-SAX 1000 8 μm, 150mm × 4.6 mm). 이 모바일 상 MM 트리스 - HCL (산도 8.0) 및 모바일 상 B 10 MM 트리스 - HCL (산도 8.0) + 0.5 M NaCl이다 10. 용매 B의 0 % -100 %의 기울기는 2.0 ML / 분 유량에서 2 분 동안 실행됩니다. (: 410 nm의와 280 nm의 λ) 용출는 흡수를 기반으로 모니터링된다. 밝은 붉은 색과 눈에 잘 띄는 흡수 피크 (그림 1)을 특징으로 만 일부를 수집합니다.
  8. 에 대한 용출을 Dialyze 인산염 버퍼 다시 생리 (PBS) 밤 한 다음 몇 시간 동안. 0.22 μm의 주사기 필터를 통과하여 소독.
  9. HB 농도를 측정하기 위해 PBS에 알려진 농도의 표준 HB 솔루션을 준비합니다. (우리 시약과 표를 참조 표준 솔루션을 혼합하여 샘플에 HB의 농도를 결정에드) 또는 1:1의 비율로 2 배 Drabkin의 시약 (가루로 만든)과 샘플 솔루션입니다. 예를 들어, 96 - 웰 플레이트에 100 μl 배 Drabkin의 시약을 100 μl HB 솔루션을 섞는다. 540 나노 미터에서 15 분 및 측정 흡광도에 품다. 표준 곡선을 그리기 및 샘플에있는 HB 농도를 결정한다. 다섯 데 15 MG / ML 생산량은 전형적인 있습니다.
  10. 복제에 15 % SDS-PAGE에서 헤모글로빈을 정화 15-20 μg을 실행합니다. 젤 중 하나를 청바지, 헤모글로빈의 니트로 셀룰로스 막과 immunoblot (그림 2)에 다른 겔에서 단백질을 전송합니다.
  11. 고정 및 액체 질소에 헤모글로빈의 1 ML의 aliquots를 저장합니다.

2. 의 준비 철 고갈 성장 미디어

  1. 제조업체와 1% cassamino의 산 (CA) (w / V)에서 권장하는대로 나트륨 중탄산염을 추가 물에 RPMI 분말을 용해하여 로즈웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 국물을 준비합니다. 0.2 μm 필터 및 매장 refrig를 통과하여 소독erated.
  2. 7% (w / V) Chelex 100를 추가하고 저어 접시에 하루 아침에 혼합하여 금속 소모 RPMI (NRPMI)를 준비합니다. 0.2 μm 필터 및 매장 냉장를 통과하여 Chelex 100 제거합니다. 25 μM ZnCl 2, 25 μM MnCl 2, 100 MM CaCl 2, 1 ㎜ 무균 1000 X 솔루션으로 사전에 준비 MgCl 2 : 필수 비 철 금속과 미디어를 보완. 재사용 가능한 물품의 철 오염을 방지하기 위해이 단계에 대한 일회용 플라스틱 용기를 사용하십시오.

단독 철 소스로 혈색소를 사용하여 3. 포도상 구균 성장

  1. 연속 S. 냉동 가공에서 tryptic 간장 한천 (TSA)에 절연을위한 구균. 20-24 시간에 37 ° C에서 알을 품다.
  2. Resuspend ethylenediamine-N, 100 mm까지 무수 에탄올에 N'-비스 (2 - hydroxyphenylacetic 산) (EDDHA). EDDHA이 솔루션에 들어갈 것이 아니라 에탄올의 소독을합니다.
  3. 0.5 mm의 최종 농도에 RPMI에 EDDHA을 추가합니다. 허용EDDHA은 다음 단계로 진행하기 전에 최소 30 분 동안 분해합니다. 배치 - 투 - 배치 변화로 인해, 최종 EDDHA 농도는 박테리아 성장을 허용하는 0.25 mm까지 낮아해야 할 수 있습니다.
  4. S.의 한 식민지의 예방 RPMI 15 ML 나사 캡 원추형 튜브에 EDDHA를 포함하는 5 ML에 구균. 16-20 시간에 대한 분 (RPM) 당 180 회전에서 진동으로 37 ° C에서 알을 품다.
  5. 7500 XG에서 5 분의 밤 문화를 원심 분리기와 NRPMI이 0.5 밀리미터 EDDHA을 포함에 펠렛을 resuspend. ~ 3 OD 600 정상화.
  6. NRPMI는 ML HB 당 2.5 μg과 0.1-1.0 밀리미터 EDDHA을 포함하는 준비합니다. 배치 사이의 차이로 인해 NRPMI에서 무료 철을 킬레이트하는 데 필요한 EDDHA 농도가 다를 수 있습니다.
  7. 15 ML 나사 캡 원추형 튜브 1 ML NRPMI + EDDHA + HB로 단계 3.5에서 세균 현탁액의 하위 문화 10 μl.
  8. 180 rpm으로 또는 회전 드럼에 진동을 최대 48 시간까지에 대해 37 ° C에서 문화를 품다.
  9. 을 모든 6-12 시간은 96 - 웰 플레이트에 문화의 50 μl를 제거하고 PBS 150 μl로 혼합하여 OD 600 판독을.

결과

우리는 HPLC (프로토콜 단계 1.7)로 hemolysate 인간의 헤모글로빈을 정화하고 있습니다. 그림 1은 쇼 280과 410 나노 미터 파장에서 eluate의 흡광도를 기록. 비율 5 수집 된 및 다른 분수이 삭제되었습니다. eluate의 밀리리터 당 헤모글로빈의 5-15 밀리그램의 생산량은 일반적으로 취득하고 있습니다. 정화 헤모글로빈이 중복으로 SDS-PAGE에 의해 분석되었으며 젤은 어느 단백질에 물들 또는 니트?...

토론

철은 인생 15 모든 왕국에서 생물에 필요한 필수 영양소입니다. vertebrates에서, 철은이 요소로 인한 독성을 피하기 위해 분리되어 있습니다. 이 격리은 영양 면역 16로 알려진 과정에 미생물을 침해에서 철을 은폐합니다. 대응 병원균은 영양 면역을 회피 전략을 발전시켜 왔습니다. 하나의 메커니즘 헤모글로빈에 의존되는데,이 호스트 17에서 철의 가장 풍부한 원천입니다. ?...

공개

우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.

감사의 말

이 연구는 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서 미국 공중 보건 서비스 보조금 AI69233 및 AI073843에 의해 지원되었다. EPS는 전염병의 Pathogenesis에 버로우즈 웰컴 동지이다. KPH는 세포 및 분자 미생물학 교육 보조금 프로그램 5 T32 A107611-10로 운영되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
시약 / 재료의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
HPLC의 음이온 교환 컬럼 Varian PL1551-3802
Drabkin의 시약 시그마 D5941-6VL
헤모글로빈 표준 포인트 과학 H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 나트륨 양식 시그마 C7901
EDDHA LGC 표준 GmbH의 ANC 001
헤모글로빈 항체 산타 크루즈 (Santa Cruz) 생명 공학, Inc의 SC-21005
Tryptic 콩 한천 BD 236920

참고문헌

  1. Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
  2. Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535 (2012).
  3. Haley, K. P., Skaar, E. P. A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition. Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).
  4. Krishna Kumar, K., et al. Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein. IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).
  5. Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer. Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).
  6. Villareal, V. A., et al. Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus. Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).
  7. Muryoi, N., et al. Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).
  8. Reniere, M. L., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem. Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).
  9. Liu, M., et al. Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).
  10. Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).
  11. Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB. Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).
  12. Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).
  13. Kim, H. K., et al. IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge. Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).
  14. Cheng, A. G., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).
  15. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  16. Weinberg, E. D. Iron availability and infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).
  17. Drabkin, D. Metabolism of the Hemin Chromoproteins. Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).
  18. Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).
  19. Torres, V. J., et al. Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia. Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).
  20. Hammer, N. D., Skaar, E. P. Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition. Annu. Rev. Microbiol. , (2011).
  21. Hurd, A. F., et al. The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus. Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).
  22. Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry. Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).
  23. Williams, R. C., Tsay, K. Y. A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin. Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).
  24. Shen, T. J., et al. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).
  25. Manjula, B. N., Acharya, S. A. Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography. Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).
  26. Neilands, J. B. Microbial envelope proteins related to iron. Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).
  27. Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron. Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).
  28. Rogers, H. J. Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli. Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

72Micronutrients

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유