Evaluación del vaciamiento gástrico en ratones diabéticos no obesos mediante un [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octanoico prueba del aliento ácido

Resumen

Determinación del vaciamiento gástrico con un no-invasivo [ ¹³ C]-octanoico prueba de aliento de fuego para la gastroparesia seguimiento en mujeres ratones NOD LTJ.

Resumen

Estudios de vaciamiento gástrico en ratones han sido limitada por la incapacidad de seguir cambios de vaciado gástrico en el mismo animal ya que las técnicas más comúnmente usadas requieren la matanza de los animales y de recuperación post mortem del ^1,2 comida. Este método evita que los estudios longitudinales para determinar los cambios en el vaciado gástrico con la edad y la progresión de la enfermedad. El uso común ^[13 C]-octanoico prueba de aliento ácido ³ para los seres humanos ha sido modificado para su uso en ratones y ratas ^4-6 y ⁷ que anteriormente mostró que esta prueba es fiable y sensible a los cambios en el vaciado gástrico en respuesta a los fármacos y durante progresión de la enfermedad diabética ^8. En este vídeo de presentación del principio y la aplicación práctica de esta prueba modificada se explica. Al igual que en el anterior estudio, los ratones NOD LTJ se utilizan, un modelo de diabetes tipo 1 ^9. Una parte de estos ratones desarrollan los síntomas de la gastroparesia, una complicación de la diabetes caracterizado por un vaciado gástrico retardado sin obstrucción mecánica del estómago ^10.

En este trabajo se muestra cómo entrenar a los ratones para probar, cómo preparar la comida de prueba y obtener 4 hr gástricas datos vaciado y cómo analizar los datos obtenidos. El analizador de isótopo de carbono usado en el presente estudio es adecuado para el muestreo automático de las muestras de aire de hasta 12 ratones al mismo tiempo. Esta técnica permite el seguimiento longitudinal de vaciamiento gástrico de los grupos más grandes de ratones con diabetes u otras enfermedades de larga duración.

Introducción

Este manuscrito describe los aspectos técnicos y metodológicos relacionados con la medición no invasiva del vaciamiento gástrico en ratones. Siguiendo el protocolo descrito aquí, los investigadores pueden fiable y reproducible seguir los cambios en el vaciado gástrico debido al desarrollo de la enfermedad, estudiar el impacto de los agentes farmacológicos en el vaciado gástrico y seguir la respuesta de vaciamiento gástrico para el tratamiento de las enfermedades subyacentes o defectos ^{6,8, 11,12.} En las publicaciones anteriores, la aplicación de pruebas de aliento ¹³ C ácido octanoico ha demostrado ser una forma útil de medir el vaciado gástrico en humanos y animales ^3,8. Este trabajo describe en detalle, los procedimientos necesarios para obtener datos fiables sobre la 8 6 a meses necesarios para un estudio longitudinal de vaciamiento gástrico en ratones con diabetes. Las ventajas de seguir este protocolo, en comparación con los métodos publicados anteriormente son que el investigador puede estar seguro de la obtaine datosd será fiable y reproducible. Además, el sistema automatizado de recogida y análisis de las muestras de gas se describe aquí aumenta el número de animales que puede ser seguido de forma simultánea en un estudio. En general, el objetivo de este trabajo es identificar los factores clave que mantienen la habituación de los ratones a la prueba y que reducir la variabilidad en los resultados obtenidos.

Para la medición in vivo de vaciado gástrico, los ratones se mantienen en ayunas durante la noche y puesto en las cámaras de ensayo de plástico transparente con flujo de aire constante. Después de que los ratones se habituaron a los tubos, de referencia exhalado ¹³ niveles de CO ₂ se determinan y se ajusta en consecuencia el flujo de aire. A continuación, se administrará una comida de prueba que consiste en la yema de huevo mezclada con ¹³ C-etiquetados octanoico. Debido a que los ratones se mantienen en ayunas y entrenados, por lo general, comer la comida de prueba dentro de 2 min. El administrarse ácido octanoico no se absorbe en el estómago pero se recogió en el duodeno und conseguirá metaboliza en el hígado en ¹³ CO _2, que se libera y exhalado, lo que resulta en un enriquecimiento de ¹³ CO ₂ en el aire circundante. Las muestras de aire se recogen a intervalos de tiempo determinados y son analizados por el analizador de isótopo de carbono. La tasa de limitación de paso en este proceso es el vaciado gástrico y la excreción pulmonar de ¹³ CO ₂ se corresponde directamente con el vaciado gástrico de la comida etiquetada.

Figura 1. Esquema de aparato de vaciado gástrico. Después de una noche de ayuno, los ratones se colocaron en cámaras transparentes que les permitan moverse y girar libremente. Un tubo de entrada permite afluencia de aire fresco y una salida constante y conduce al analizador de isótopos para medir el ^{C-13 a-12}Relación C en el aire exhalado. La cámara también tiene un orificio central para el suministro de alimentos que contienen ^[13 C]-ácido octanoico.

Protocolo

1. La formación y habituación de los Ratones

1. Antes del análisis, poner todos los ratones en las cámaras de ensayo para 2-4 horas con flujo de aire constante a fin de habituar a las condiciones de prueba. Esto reduce considerablemente los niveles de estrés que podrían causar detección aberrante del vaciamiento gástrico retardado. Tratar los ratones de la misma manera como si el experimento vaciado gástrico se ejecuta. Preparar yema de huevo (véase más adelante) sin añadir el ácido octanoico y alimentar a 0,2 g para cada ratón.
2. Repita este proceso hasta que los ratones están suficientemente formados (típicamente de 2-3 veces). Los ratones normalmente se habitúan fácilmente siempre que las condiciones ambientales se mantienen iguales.

Nota: no habituados ratones continúan moviéndose alrededor por alrededor de 1 hora después de la transferencia a la cámara, y defecar y orinar con frecuencia, mientras que los ratones habituados rápidamente establecerse en su nuevo entorno y descanse relajado.

Note: Durante el experimento: los animales vigilar los signos de pérdida de la habituación como exceso de orina, la defecación, la falta de interés en comer el huevo. Si este es el caso de la posibilidad de volver habituar en una cámara vacía 1-2 veces antes de obtener los datos de vaciado gástrico. La consistencia es muy importante al hacer este experimento. Hacer las cosas exactamente de la misma manera cada vez que es la única manera de obtener resultados confiables y reproducibles. Esto incluye dar tratamiento (por ejemplo, insulina) cada día, al mismo tiempo, no separación de los ratones de su jaula compañeros de menos que sea absolutamente necesario, en ayunas a los ratones y de iniciar la prueba de vaciado gástrico al mismo tiempo, y el manejo de los ratones de la misma manera.

2. Preparación de la prueba de isótopos que contienen harina de

1. Comenzar con el pesado de 5 g de yema de huevo en un tubo Falcon de 50 ml. Repita estos pasos cada día experimental para preparar una comida de prueba nueva.
2. Añadir 10 l de ácido octanoico con un concentración de 2 l / g al tubo Falcon de 50 ml que contiene el huevo y mezclar vigorosamente durante 1 min con una espátula en el tubo Falcon.
3. El huevo se transfiere entonces a un vaso de precipitados de vidrio y se calentó con un mechero Bunsen hasta que se coagula y su consistencia es adecuado para hacer bolas pequeñas. Esto tarda típicamente entre aproximadamente 30 sec.

Nota: Las bolas de la yema de huevo debe pesar 0,2 g por ratón. Esto es importante para mantener la dosis acumulativa constante en todos los ratones.

3. A partir del experimento

1. Una vez capacitados y listos para el vaciado gástrico, rápido a los ratones durante la noche (12 horas) en un metal "malla de fondo" rack ayuno para evitar la coprofagia. Asegúrese de que tengan libre acceso al agua potable. Dado que los ratones diabéticos se utilizan en el experimento actual, que no deben estar en ayunas durante más de 16 h.
2. Comience por la creación de las cámaras de vaciado gástrico. Utilizar cámaras limpias y las cubiertas que han sido secados al aire. También, cualquiertubos de conexión de las cámaras para el analizador o el CO ₂ de suministro de aire debe ser libre de humedad, el agua puede interferir con la señal leída por el analizador
3. Conectar las cámaras a los tubos de entrada que proporcionan un flujo de aire constante. A continuación, conecte los tubos de salida de las cámaras a la máquina. Cerrar los tubos y conecte la corriente de aire.

Nota: Aplicar una cantidad muy pequeña de vaselina en el extremo de las tapas de cubierta para que cerrar fácilmente y se sellan con seguridad. Este sello hermético es necesario recoger todo el dióxido de carbono producido por los ratones.

4. Procedimientos Experimentales

1. Comience pesando cada ratón. El peso corporal es una medida de su buena salud continua. Luego coloca cada ratón en la cámara apropiada. Por supuesto, es importante contar con el aire que fluye a las cámaras en este momento.
2. Para iniciar la medición, permite a los ratones para aclimatarse a las cámaras antes de ajustarING los niveles de aire.
3. Una vez que los ratones parecer tranquilo, que puede tardar unos minutos, ajustar el caudal de aire en cada cámara del ratón. Esto puede ser diferente para cada ratón. Típicamente, el flujo de aire se ajusta al comienzo del experimento para asegurarse de que el CO exhalado ₂ alcanza niveles detectables por cualquier equipo que se está utilizando, y para asegurarse de que el nivel se mantiene lo suficientemente bajo como para asegurar rotación aire saludable. Utilizamos iniciales niveles de CO ₂ entre 1.000 y 1.500 partes por millón.
4. Si tiene problemas con los ajustes, compruebe si hay fugas de aire. A continuación, repita el proceso para cada una de las cámaras y ver para otra ronda de mediciones para ver si los ajustes realizados para el flujo de aire se ha corregido el nivel de CO _2. Es importante para obtener una línea base estable de lectura antes de alimentar a los ratones. Nosotros usamos una máquina con una función de calibración automática. Si este no es el caso de calibración debe ser comprobado.
5. Cuando esto se logra, administrar la comida huevoal primer ratón y el registro del tiempo que cada ratón recibe el alimento.
6. Llevamos a cabo el procedimiento durante 4 horas para obtener los valores suficientes para ajustar la curva de ¹³ CO ₂ enriquecimiento para cada ratón. Compruebe en los ratones cada 30-60 minutos para asegurarse de que los niveles de CO ₂ siguen siendo seguros para los ratones.
7. Preparar nuevas cajas que contienen los alimentos antes del final de la prueba de modo que los ratones pueden comenzar a comer inmediatamente después de la prueba ha terminado.

Resultados

A los datos representativos, creados a partir de tres diferentes ratones se muestra en la Figura 2. El gráfico negro representa los puntos de datos de un ratón con el vaciamiento gástrico normal. Se muestra la fracción de C ¹³ que se recupera en el aire exhalado expresada como un porcentaje de la dosis administrada por hora expresada como una función del tiempo. La curva azul es de un ratón con un vaciado gástrico acelerado con un valor medio T de 40 min y la curva roja es de un ratón...

Discusión

La técnica descrita en este documento permite repetida y no invasiva de medición in vivo de vaciado gástrico sólido en ratones. Este sistema tiene la ventaja de que los animales no se restringen en la cámara de medición, lo que les permite moverse y girar libremente. Como se trata de un entorno desconocido, los ratones todavía necesitan ser entrenados y acostumbrados a las cámaras de prueba para prevenir los efectos del estrés sobre el vaciado gástrico. En general, se supone que los datos de vaciado g...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOMBRE	EMPRESA	N º de	COMENTARIOS
Una fuente de constante de suministro de aire, el flujo y la composición	central de suministro de aire en la instalación de investigación
130 ml cámara de muestreo que tiene aire de entrada, de salida de aire, y la apertura de la administración de alimentos Tubos de plástico para el suministro de aire	Dentro de la casa construida
Ácido octanoico	Cambridge isótopo laboratorios (Andover, MA)	CLM-293-1
Para preparar la comida huevo: pequeño vaso de precipitados 50 ml tubo de plástico Mechero Bunsen huevo espátula	Cualquier proveedor		Trata deser coherente con el proveedor de huevo ya que el contenido nutricional y la palatabilidad de los huevos puede afectar el vaciado gástrico y la ingestión de la comida
El dióxido de carbono isótopo analizador	Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA)