Beurteilung der Magenentleerung in Non-adipösen diabetischen Mäusen mit a [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-Octansäure Atemtest

Zusammenfassung

Bestimmung der Magenentleerung mit einem nicht-invasiven [ ¹³ C]-Octansäure Atemtest zur Verfolgung Gastroparese bei weiblichen NOD LTJ Mäusen.

Zusammenfassung

Magenentleerung Studien an Mäusen haben durch die Unfähigkeit, Magenentleerung Veränderungen im gleichen Tier, da die am häufigsten verwendeten Techniken erfordern das Töten der Tiere und postmortale Erholung der Mahlzeit ^1,2 folgen beschränkt. Dieser Ansatz verhindert Längsschnittstudien Änderungen in Magenentleerung mit dem Alter und das Fortschreiten der Erkrankung zu bestimmen. Die allgemein verwendete ^[13 C]-octansäure Atemtest für Mensch ³ wurde für die Verwendung bei Mäusen und Ratten ^{4-6 7} modifiziert und wir zuvor gezeigt, dass dieser Test zuverlässig und den Veränderungen der Magenentleerung ist als Reaktion auf Arzneimittel und während diabetischer Krankheitsprogression ^8. In diesem Video-Präsentation das Prinzip und die praktische Umsetzung dieser modifizierten Test erläutert. Wie in der vorherigen Studie werden NOD LTJ Mäuse verwendet, ein Modell des Typ 1 Diabetes ^9. Ein Teil dieser Mäuse entwickeln die Symptome der Gastroparese, eine Komplikation der diabetes durch eine verzögerte Magenentleerung ohne mechanische Obstruktion des ^Magen-10 gekennzeichnet.

Dieses Papier zeigt, wie die Mäuse zum Testen zu trainieren, wie man den Test Mahlzeit zuzubereiten und erhalten 4 hr Magenentleerung Daten und wie die gewonnenen Daten zu analysieren. Der Kohlenstoff Isotopenanalysator in der vorliegenden Studie verwendet ist geeignet für die automatische Abtastung der Luftproben aus bis zu 12 Mäuse gleichzeitig. Diese Technik ermöglicht die Längs-Follow-up der Magenentleerung von größeren Gruppen von Mäusen mit Diabetes oder anderen langjährigen Krankheiten.

Einleitung

Dieses Manuskript beschreibt die technischen und methodischen Überlegungen in nicht-invasive Messung der Magenentleerung bei Mäusen beteiligt. Indem Sie das Protokoll hier beschrieben, Ermittler können zuverlässig und reproduzierbar zu folgen Veränderungen in Magenentleerung aufgrund der Entwicklung der Krankheit, untersuchen den Einfluss von pharmakologischen Wirkstoffen auf die Magenentleerung und folgen Sie die Reaktion der Magenentleerung auf die Behandlung der zugrunde liegenden Krankheiten oder Mängel ^{6,8, 11,12.} In früheren Veröffentlichungen, die Anwendung von ¹³ C Octansäure Atemtest wurde gezeigt, dass eine sinnvolle Methode zur Messung der Magenentleerung bei Menschen und Tieren ^3,8 sein. Dieses Papier beschreibt im Detail die erforderlichen Verfahren, um verlässliche Daten über die 6 bis 8 erhalten Monate, die für eine Langzeitstudie der Magenentleerung bei Mäusen mit Diabetes. Die Vorteile der nach diesem Protokoll, wenn zuvor publizierten Methoden verglichen werden, dass der Prüfer die Daten obtaine gewährleistet werden kannd werden zuverlässig und reproduzierbar. Zusätzlich beschrieben die automatisierte System zum Sammeln und Analysieren der Gasproben hier erhöht sich die Anzahl der Tiere, die gleichzeitig in einer Studie folgen. Insgesamt ist das Ziel dieser Arbeit, die wichtigsten Faktoren, die Gewöhnung der Mäuse auf dem Prüfstand, und dass die Variabilität in erhaltenen Ergebnisse zu erhalten identifizieren.

Für die in vivo Messung der Magenentleerung, werden die Mäuse über Nacht gefastet und legte in den transparenten Kunststoff-Testkammern mit konstanter Luftstrom. Nachdem die Mäuse an den Rohren zu bekommen gewöhnt, atmete Baseline ¹³ CO ₂ bestimmt werden können und der Luftstrom entsprechend angepasst. Als nächstes wir ein verabreichen Testmahlzeit bestehend aus Eigelb mit ¹³ C-markiertem Octansäure vermischt. Da die Mäuse gefastet und ausgebildet sind, sie in der Regel essen die Testmahlzeit innerhalb von 2 min. Die verabreichte Octansäure ist nicht im Magen absorbiert wird aber bis in den Zwölffingerdarm entnommen werden eind wird in der Leber in ¹³ CO _2, das freigesetzt wird und ausgeatmete verstoffwechselt zu werden, was zu einer Anreicherung von ¹³ CO ₂ in der Umgebungsluft. Luftproben werden in bestimmten Zeitabständen gesammelt und durch den Kohlenstoff Isotopenanalysator analysiert. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in diesem Prozess ist die Magenentleerung und die pulmonale Ausscheidung von ¹³ CO ₂ direkt entspricht Magenentleerung des markierten Mahlzeit.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Magenentleerung Apparat. Nach nächtlichem Fasten, werden die Mäuse in transparenten Kammern so dass sie sich zu bewegen und drehen frei platziert. Ein Einlassrohr ermöglicht frisch und konstante Luft Zustrom und einen Auslass führt zur Isotopenanalysator die ^{13 C-to-12} messenC-Verhältnis im ausgeatmeten Atem. Die Kammer weist auch eine zentrale Schnittstelle für Lieferung von Lebensmitteln mit ^[13 C]-octansäure.

Protokoll

Ein. Schulung und Gewöhnung der Mäuse

1. Vor der Analyse, legte alle Mäuse in den Testkammern für 2-4 h mit konstanten Luftstrom, um sie auf die Prüfbedingungen zu gewöhnen. Dies reduziert deutlich Stress, die andernfalls möglicherweise abweichende Erfassung verzögerte Magenentleerung. Behandeln Sie die Maus auf die gleiche Weise, als ob die Magenentleerung Experiment ausgeführt wurde. Bereiten Eigelb (siehe weiter unten) ohne Zugabe von Octansäure und füttern 0,2 g jeder Maus.
2. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Mäuse ausreichend geschult sind (in der Regel 2-3 Mal). Die Mäuse sind typischerweise leicht so lange Gewöhnung als die Umgebungsbedingungen gehalten werden dieselben.

Hinweis: Nicht gewöhnt Mäusen weiter zu bewegen für ca. 1 Stunde nach der Übertragung in die Kammer, und entleeren und urinieren häufig, während habituierten Mäusen schnell in ihre neue Umgebung und Ruhe leise zu begleichen.

Nichtte: Während des Experiments: Monitor auf Anzeichen des Verlustes der Gewöhnung wie überschüssige Wasserlassen, Stuhlgang, mangelndes Interesse an dem Essen das Ei. Ist dies der Fall zu betrachten erneut habituating in einer leeren Kammer 1-2 mal vor dem Erhalten Magenentleerung Daten. Konsistenz ist sehr wichtig, während Sie dieses Experiment. Dinge zu tun, genau die gleiche Weise jedes Mal ist der einzige Weg, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Dies beinhaltet geben Behandlung (zB Insulin) jeden Tag zur gleichen Zeit, nicht die Trennung der Mäuse aus ihrem Käfig-Kollegen, wenn es unbedingt erforderlich, das Fasten, die Mäuse und Starten der Magenentleerung Test zur gleichen Zeit, und die Handhabung der Maus auf die gleiche Weise.

2. Vorbereitung der Isotope enthaltenden Testmahlzeit

1. Beginnen Sie mit einem Gewicht von 5 g Eigelb in einem 50 ml Falcon-Röhrchen. Wiederholen Sie diese Schritte jedes experimentelle Tag eine frische Testmahlzeit vorzubereiten.
2. Fügen Sie 10 ul Octansäure mit einer konzentration von 2 ul / g zu der 50 ml-Falcon-Röhrchen mit dem Ei und mischen kräftig für 1 min mit einem Spatel in Falcon-Röhrchen.
3. Das Ei wird dann in ein Becherglas überführt und erhitzt über einem Bunsenbrenner bis es koaguliert und seine Konsistenz eignet, um kleine Kugeln machen. Dies dauert in der Regel etwa 30 Sekunden.

Hinweis: Die Kugeln aus Eigelb sollte 0,2 g pro Maus wiegen. Dies ist wichtig, um die kumulative Dosis konstant in allen Mäusen.

3. Beginn des Experiments

1. Einmal ausgebildet und bereit für die Magenentleerung, schnell die Mäuse über Nacht (12 h) auf einer Metalloberfläche "Mesh-unten" Fasten Zahnstange coprophagia verhindern. Stellen Sie sicher, sie haben freien Zugang zu Trinkwasser. Da diabetischen Mäusen im aktuellen Experiment verwendet werden, sollten sie nicht länger als 16 Stunden gefastet werden.
2. Beginnen Sie mit dem Einrichten der Magenentleerung Kammern. Verwenden Sie saubere Kammern und Abdeckungen, die schon an der Luft getrocknet wurden. Auch irgendeinemRohre die Kammern verbindenden dem Analysator oder dem CO _2-Luftzufuhr sollte feuchtigkeitsfreien; Wasser kann mit dem Signal von dem Analysator zu lesen interferieren
3. Verbinden der Kammern mit den Einlaßrohren, die einen konstanten Luftstrom bereitzustellen. Anschließend verbinden Sie die Auslassrohre von den Kammern zu der Maschine. Schließen Sie die Rohre und schalten Sie den Luftstrom.

Hinweis: Tragen Sie eine sehr kleine Menge Vaseline am Ende der Deckeln so schließen sie einfach und sicher verschlossen. Diese Abdichtung ist erforderlich, um die Kohlensäure von den Mäusen hergestellt sammeln.

4. Experimentelle Verfahren

1. Starten Sie durch Wiegen jeder Maus. Das Körpergewicht ist ein Maß für ihre fortwährende gute Gesundheit. Dann legen Sie jede Maus in der entsprechenden Kammer. Es ist natürlich wichtig, haben die strömende Luft in die Kammern zu diesem Zeitpunkt.
2. Um die Messung zu starten, damit die Mäuse zu den Kammern, bevor anzupassen akklimatisierenING die Luft Ebenen.
3. Sobald die Mäuse ruhig erscheinen, kann das einige Minuten dauern, stellen Sie die Luftmenge für jede Maus Kammer. Dies kann für jede Maus. Typischerweise wird der Luftstrom am Beginn des Experiments angepasst werden, um sicherzustellen, dass ausgeatmete CO ₂ erreicht Nachweisgrenze, was Geräten verwendet wird, und dafür zu sorgen, dass das Niveau niedrig genug, um gesunde Luftzirkulation zu gewährleisten bleibt. Wir verwenden anfänglichen CO _2-Gehalt zwischen 1.000 und 1.500 Teile pro Million.
4. Wenn Schwierigkeiten mit Anpassungen, Leckagen zu überprüfen. Dann wiederholen Sie den Vorgang für jede der Kammern und achten Sie auf eine weitere Runde von Messungen zu sehen, ob Anpassungen vorgenommen, um die Luftströmung die CO _2-Ebene korrigiert wurden. Es ist wichtig, eine stabile Basislinie gerade vor dem Einspeisen der Mäuse zu erhalten. Wir verwenden eine Maschine mit einer Selbstkalibrierung Funktion. Ist dies nicht der Fall sollte die Kalibrierung überprüft.
5. Wenn dies erreicht ist, die Verwaltung der Ei Mahlzeitdie erste Maus und Aufzeichnung der Zeit jede Maus bekommt das Essen.
6. Wir führen das Verfahren für 4 h bis genügend Werte für die Montage des ¹³ CO _{2-Anreicherung} Kurve für jede Maus zu erhalten. Überprüfen Sie auf der Mäuse jede 30-60 min, um sicherzustellen, dass die CO _2-Gehalt noch für die Mäuse sicher.
7. Bereiten Sie neue Kisten mit Lebensmitteln vor dem Ende des Tests, so dass die Mäuse können anfangen zu essen unmittelbar nach der Test beendet ist.

Ergebnisse

Eine repräsentative Daten aus drei verschiedenen Mäusen zu setzen ist in Abbildung 2 dargestellt. Der Graph stellt die schwarze Datenpunkte von einer Maus mit normaler Magenentleerung. Es zeigt die Fraktion von ¹³ C, die in der ausgeatmeten Luft als Prozentsatz der verabreichten Dosis pro Stunde als Funktion der Zeit, ausgedrückt zurückgewonnen wird. Die blaue Kurve ist von einer Maus mit einer beschleunigten Magenentleerung mit einem T Halbwert von 40 min und der rote Kurve ist von einer...

Diskussion

Die hierin beschriebene Technik ermöglicht wiederholten und nicht-invasiven in-vivo-Messung von festen Magenentleerung bei Mäusen. Dieses System hat den Vorteil, dass die Tiere nicht in der Messkammer zurückgehalten, so dass sie sich zu bewegen und sich frei drehen können. Da dies eine ungewohnte Umgebung, die Mäuse müssen noch geschult werden und gewöhnt den Testkammern zu Auswirkungen von Stress auf die Magenentleerung zu verhindern. Im Allgemeinen nehmen wir die Magenentleerung Daten zuverlässig sind...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
NAMEN	UNTERNEHMEN	CAT NUMBER	KOMMENTARE
Eine Quelle ständiger Luftzufuhr, Durchfluss sowie Komposition	zentrale Luftversorgung in der Forschungsanlage
130 ml Probenahmekammer, der Lufteinlass und Luftauslass und Nahrungsmittel Verabreichung Öffnung Kunststoffrohre für Zuluft	In-Haus gebaut
Octansäure	Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA)	CLM-293-1
Um das Ei Mahlzeit zubereiten: kleines Becherglas 50 ml Plastikröhrchen Bunsenbrenner Ei Spachtel	Jeder Lieferant		Versuchen Sie,konsistent mit dem Ei Lieferanten da der Nährstoffgehalt und Schmackhaftigkeit der Eier und die Magenentleerung Einnahme der Mahlzeit beeinflussen können
Kohlendioxid Isotopenanalysator	Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA)