를 사용하여 비 비만 당뇨병 마우스의 위 비우는의 평가 [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octanoic 산성 호흡 시험

요약

비 침습적으로 위 비우는의 결정 [ ¹³ C]-octanoic 여성 NOD LtJ 마우스의 추적 gastroparesis에 대한 산 호흡 테스트.

초록

쥐 위 비우는 연구는 가장 일반적으로 사용되는 기술은 동물과 식사 ^1,2의 사후 복구를 죽이는해야하기 때문에 같은 동물의 위 비우는 변경 사항을 따르도록 없다는 의해 제한되었습니다. 이 방법은 나이와 질병의 진행과 위 비우는의 변화를 결정하기 위해 길이 방향의 연구를 방지 할 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 ^[13 C]-octanoic 인간 ³ 산 숨이 시험은 마우스 ^4-6와 쥐 ⁷ 사용하기 위해 수정 우리는 이미이 시험은 약물에 응답하고 동안 안정적이고 위 비우는 변화에 반응을 보여 주었다되었습니다 당뇨병 질환의 진행 ^8. 이 비디오 프리젠 테이션에서이 수정 테스트의 원칙과 실제 구현은 설명합니다. 이전 연구에서와 같이, NOD LtJ 마우스는 제 1 형 당뇨병 ⁹ 모델을 사용합니다. 이 마우스의 비율은 diabet의 합병증, gastroparesis의 증상을 개발에스 위 ^(10)의 기계적 방해하지 않고 지연 위의 비우는의 특징.

본 논문은 테스트 식사를 준비하고 4 시간 위 비우는 데이터와 어떻게 얻은 데이터를 분석하는 방법을 구하는 방법, 테스트를 위해 쥐를 훈련하는 방법을 보여줍니다. 본 연구에 사용 된 탄소 동위 원소 분석기는 동시에 12 쥐 최대의 공기 샘플의 자동 샘플링에 적합합니다. 이 기술은 당뇨병이나 다른 오랜 질병으로 생쥐의 큰 그룹의 위 비우는의 종 후속 수 있습니다.

서문

이 원고 쥐 위 비우는의 비 침습적 측정에 관련된 기술 및 방법론 고려 사항에 대해 설명합니다. 에 따라 프로토콜이 여기에 설명, 조사가 안정적으로 reproducibly 인한 질병의 발전에 비우는 위의 변화를 추적 할 ^수, 위 비우는의 약리 대리인의 영향을 연구하고 기본 질병 또는 결함 ^6,8의 치료 위 비우는의 반응을 따라 ^11,12. 이전 출판물에서 ¹³ C의 응용 프로그램은 octanoic 산성 숨이 테스트는 사람과 동물 ^3,8에서 위 비우는을 측정하는 유용한 방법을 표시했습니다.이 보고서는 상세 설명 6-8으로 신뢰할 수있는 데이터를 얻을하는 데 필요한 절차 당뇨병 쥐 위 비우는의 길이 방향 연구에 필요한 개월. 이전에 다음 ID로 출판 방법에 비해이 프로토콜에 따라의 장점은 탐정이 데이터 obtaine을 보장 할 수 아르d는 신뢰할 수 있고 재현 할 수 있습니다. 또한, 수집 및 가스 샘플을 분석 자동화 된 시스템이 여기에 설명 된 연구에서 동시에 추적 할 수있는 동물의 수를 증가합니다. 전반적으로,이 문서의 목표는 테스트에 마우스 habituation와 그 얻은 결과에 변화를 줄일를 유지 주요 요인을 파악하는 것입니다.

위 비우는의 생체 측정의 경우, 마우스는 하루 아침에 금식하고 지속적인 공기 흐름을 투명 플라스틱 시험 챔버에 투입. 마우스가 튜브에 길들여지면, 기본은 ₂ 수준 결정 ¹³ CO를 exhaled과 공기가 적절히 조정. 다음, 우리는 ¹³ C-라벨 octanoic 산을 섞어 계란 노른자로 구성된 테스트 식사를 관리 할 수 있습니다. 마우스가 금식과 훈련되기 때문에, 그들은 일반적으로 2 분 이내에 테스트 식사를 먹습니다. 관리 octanoic 산성은 위장에서 흡수되지 않습니다하지만 십이지장에 연결됩니다D는 주변 공기를 ¹³ CO _2의 농축의 결과로, 출시와 exhaled되어 ¹³ CO _2로 간에서 대사 질 것입니다. 공기 샘플은 결정 시간 간격으로 수집하고 탄소 동위 원소 분석기에 의해 분석됩니다. 이 모든 과정에서 속도 - 제한 단계는 위 비우는와 CO _2는 직접 레이블 식사 위 비우는과 일치하는 ¹³ 폐 배설입니다.

그림 1. 위 비우는 장치의 도식. 밤새 금식 한 후, 마우스는 그들이 자유롭게 이동하고 회전 할 수 있도록 투명한 방에 배치됩니다. 입구 관은 신선하고 지속적으로 공기 유입을 허용하고 콘센트는 ^{13 C-에-12을} 측정 할 수있는 동위 원소 분석기로 연결의 C 비율은 숨을 exhaled. 챔버는 ^[13 C]-octanoic 산을 포함하는 음식을 제공을위한 중앙 포트가 있습니다.

프로토콜

1. 마우스의 교육 및 Habituation

1. 이전 분석에, 테스트 조건으로들이다하기 위해 지속적인 공기 흐름과 2-4 시간의 테스트 챔버에있는 모든 쥐를 넣어. 이 현저하게 다른 지연 위 비우는의 비정상 탐지가 발생할 수 있습니다 스트레스 수준을 줄일 수 있습니다. 마우스에게 위 비우는 실험이 실행 된 경우와 같은 방법으로 취급합니다. octanoic 산을 추가하지 않고 계란 노른자를 (자세한 참조) 준비하고 각 마우스에 0.2 g을 먹이.
2. 마우스가 충분히 (일반적으로 2 ~ 3 배) 훈련 때까지이 과정을 반복합니다. 환경 조건이 동일한 보관으로 마우스는 일반적으로 쉽게 오랫동안 길들여 수 있습니다.

참고 : 길들여 마우스를 신속하게 조용히 자신의 새로운 환경과 휴식에 정착하면서 비 길들여 마우스는 챔버로 전송 한 후 약 1 시간 주위를 이동하고 깨끗하게하고 자주 소변을 계속합니다.

아니테 : 실험이 진행되는 동안 : 같은 과도한 배뇨, 깨끗하게 함, 계란을 먹는에 대한 관심의 부족과 같은 habituation의 손실의 징후에 대한 모니터링 동물. 이 경우 사건은 다시 1-2 시간 전에 위 비우는 데이터를 얻어 내려면 빈 챔버에 habituating 생각합니다. 이 실험을하는 동안 일관성은 매우 중요합니다. 사물을 정확하게 같은 방법으로 이렇게하면 때마다 신뢰할 수 있고 재현 할 결과를 얻을 수있는 유일한 방법입니다. 이 자신의 새장 - 친구에서 마우스를 분리하지, 같은 시간에 매일 (예 : 인슐린)하지 않는 한 절대적으로 필요한, 쥐를 금식과 동시에 위 비우는 테스트를 시작하고, 쥐를 취급 동일한 방법으로 치료를 제공 포함되어 있습니다.

2. 테스트 식사를 포함 동위 원소의 작성

1. 50 ML 팔콘 튜브에 계란 노른자의 5g을 무게로 시작합니다. 새로운 테스트 식사를 준비하기 위해 각 실험 일이 단계를 반복합니다.
2. concentr과 octanoic 산의 10 μl를 추가합니다계란을 포함하는 50 ML 팔콘 튜브 2 μl / g의 ation와 매 튜브에 주걱 1 분 동안 힘차게 섞는다.
3. 이 coagulates과 일관성 작은 ​​공을하기에 적합한 때까지 계란 그런 다음 유리 비커로 옮겨와 분젠 버너를 통해 가열합니다. 이것은 일반적으로 약 30 초 정도 소요됩니다.

참고 : 계란 노른자의 공 마우스 당 0.2 g을 무게해야합니다. 이 모든 쥐의 누적 투여 량을 일정하게 유지하는 것이 중요합니다.

3. 실험 시작

1. coprophagia을 방지하기 위해 금속 "그물 아래로"금식 랙에 (12 시간) 빠른 쥐가 하룻밤 위 비우는 위해 일단 훈련 준비. 사람들이 식수를 무료로 이용하실 수 있습니다 있는지 확인하십시오. 당뇨병 생쥐가 현재 실험에 사용되므로, 그들은 더 이상 16 시간에 금식하지 않아야합니다.
2. 위 비우는 챔버를 설정하여 시작합니다. 공기 건조되었습니다 깨끗한 방 및 커버를 사용하십시오. 또한, 다른분석기 또는 CO ₂ 공기 공급에 챔버를 연결하는 튜브는 수분 무료로해야합니다, 물 분석기에서 읽을 신호를 방해 할 수
3. 일정한 공기 흐름을 제공하는 입구 튜브에 챔버를 연결합니다. 그런 다음 컴퓨터에 챔버에서 배출 튜브를 연결합니다. 튜브를 닫고 공기 흐름을 설정합니다.

참고 : 쉽게 닫고 안전하게 밀봉되도록 커버 뚜껑의 끝 부분에 바셀린의 매우 작은 금액을 적용합니다. 이 시일은 마우스에 의해 발생하는 모든 이산화탄소를 수집 할 필요가 있습니다.

4. 실험 절차

1. 각 마우스의 무게에 의해 시작합니다. 체중은 지속적인 건강을 측정하기위한 한 방법입니다. 그런 다음 적절한 챔버의 각 마우스를 놓습니다. 그것은 공기가이 시간에 방에 흐르는 것 물론 중요합니다.
2. 측정을 시작하려면 쥐가 조정되기 전에 방으로 순응 할 수 있도록공기 수준을 들죠.
3. 쥐가 침착 표시되면, 즉, 몇 분 정도 소요될 각 마우스 챔버의 공기 흐름 속도를 조정할 수 있습니다. 이 각각의 마우스에 대한 다를 수 있습니다. 일반적으로 공기 흐름이 CO _2가 사용되는 어떤 장비로 감지 수준에 도달 exhaled이 있는지 확인하고, 레벨이 건강한 공기 회전율을 보장 할 수있을만큼 낮은 유지 있는지 확인하기 위해 실험 시작시 조정됩니다. 우리는 백만 당 1,000 1,500 부품 사이에 최초의 CO ₂ 수준을 사용합니다.
4. 조정에 문제가있는 경우, 공기 누출을 확인합니다. 그런 다음 챔버 각각의 과정을 반복하여 공기 흐름에 대한 변경 조정이 CO ₂ 수준을 수정 한 경우 표시 측정의 또 다른 라운드 감상하세요. 이 쥐를 먹이하기 전에 읽어 안정된 기준을 얻기 위해 중요합니다. 우리는 자체 보정 기능이있는 기계를 사용합니다. 이 아닌 경우 경우 보정이 선택해야합니다.
5. 이것이 달성되면, 계란 식사를 관리첫 번째 마우스와 기록 시간에 각 마우스는 음식을받습​​니다.
6. 우리는 각각의 마우스에 대한 ¹³ CO ₂ 농축 곡선에 맞는 충분한 값을 얻기 위해 4 시간의 절차를 실행합니다. 마우스의 CO ₂ 수준 생쥐에 여전히 안전 있는지 확인하기 위해 최선을 30-60 분을 확인합니다.
7. 쥐가 테스트가 끝난 후 즉시 식사를 시작 할 수 있도록 시험이 끝나기 전에 음식을 포함하는 새로운 상자를 준비합니다.

결과

세 가지 마우스에서 설정 한 대표 데이터는 그림 2에 표시됩니다. 검은 색 그래프는 정상 위의 비우는와 마우스에서 데이터 포인트를 나타냅니다. 그것은 시간의 함수로 표현 시간당 관리 복용량의 백분율로 exhaled 공중에 복구 ¹³ C의 비율을 보여줍니다. 파란색 곡선은 168 분의 T 반 값 지연 위의 비우는와 마우스부터 40 분 그리고 붉은 곡선의 T 반 값으로 비우는 가속화 위와 ?...

토론

설명 기술은 여기 쥐 고체 위의 비우는의 생체 측정의 반복과 비 침습적 할 수 있습니다. 이 시스템은 사람들이 자유롭게 이동하고 회전 할 수 있도록 동물이 측정 챔버에 묶여하지 않는 장점이 있습니다. 이 익숙하지 않은 환경 때문에, 마우스는 여전히 훈련 위 비우는에 스트레스의 영향을 방지하기 위해 테스트 챔버에게 길들여해야합니다. 일반적으로 연속 위 비우는 테스트 사이의 내?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
NAME	회사	CAT 번호	의견
일정한 공기 공급 장치, 흐름의 소스뿐만 아니라 구성	연구 시설 중앙 공기 공급
공기 입구, 공기 출구, 식품 관리 운영하고 130 ML 샘플링 챔버 공기 공급을위한 플라스틱 튜브	사내 구축
Octanoic 산	캠브리지 동위 원소 실험실 (앤도버, MA)	CLM-293-1
계란 요리를 준비하려면 : 작은 비커 50 ML 플라스틱 관 분젠 버너 달걀 주걱	모든 공급 업체		시도계란의 영양 내용과 palatability는 식사 섭취와 위 비우는 영향을 미칠 수 있기 때문에 계란 공급 업체와 일치
이산화탄소 동위 원소 분석기	로스 Gatos 연구 주식회사 (Mountain View, CA)를