[を使用した非肥満糖尿病マウスにおける胃排出能の評価<sup&gt; 13</sup&gt; C] - オクタン酸呼気テスト

要約

非侵襲による胃排出の決定[ ¹³女性のNOD LTJマウスで胃を追跡するためのC] - オクタン酸呼気検査。

要約

マウスにおける胃排出試験は、最も一般的に使用される技術は、動物との食事を^1,2の死後回復を殺す必要とするので、同じ動物における胃排出変化に追従することができないことによって制限されています。このアプローチでは、年齢や疾患の進行と胃排出能の変化を判断するのは長期的な研究を防ぎます。人間³に一般的に使用される^[13 C] -オクタン酸呼気試験は、マウス^4-6およびラット⁷で使用するために変更され、我々は以前に、このテストは薬剤への応答との間に胃排出能の変化に対する信頼性と応答性であることを示したされています糖尿病疾患の進行^8。このビデオプレゼンテーションでは、この変更されたテストの原理と実用的な実装について説明する。以前の研究と同様に、NOD LTJマウスは、1型糖尿病⁹のモデルを使用されています。これらのマウスの割合はdiabetの合併症、胃不全麻痺の症状を起こすES胃¹⁰の機械的閉塞せずに遅延胃排出が特徴。

本論文では、試験食を準備し、4時間胃排出データと方法で得られたデータを分析する方法を取得する方法、テストのためにマウスを訓練する方法を示しています。本研究で用いた炭素同位体分析器は、同時に12匹までから空気サンプルの自動サンプリングに適しています。この技術は、糖尿病やその他の長期にわたる疾患をもつマウスの大きいグループから胃排出の長手方向のフォローアップができます。

概要

本稿では、マウスにおける胃排出能の非侵襲的測定にかかわる技術的および方法論的な考慮事項について説明します。ここに記載されたプロトコールに従うことによって、研究者は確実にかつ再現性胃排出に関する薬理学的薬剤の影響を研究し、基礎疾患や欠陥^6,8の治療への胃内容排出の応答に従って、疾患の発症に起因する空胃の変化を追うことができ^{、 11,12。}以前の出版物では^、13 Cオクタン酸呼気検査の適用は、ヒトおよび動物^3,8で胃排出を測定するのに便利な方法であることが示された。本稿では詳細に説明し、6から8を介して信頼性のあるデータを得るために必要な手続き糖尿病マウスにおける胃排出能の縦断的研究のために必要な数ヶ月。以前に公開されている方法と比較した場合、このプロトコルに従うことの利点は、治験責任医師がデータobtaineを保証することができるということですdは、信頼性と再現性になります。また、ここで記載されたガスのサンプルを収集し、分析するための自​​動化されたシステムは、研究で同時に追跡することができる動物の数が増加します。全体的に、この論文の目的は、テストに対するマウスの馴化を維持し、それが得られた結果のばらつきを軽減する重要な要因を特定することです。

胃排出能の in vivoでの測定では、マウスを一晩絶食させると一定のエアフローを透明なプラスチックの試験室に入れた。マウスをチューブに慣らさ取得した後、ベースラインは^、13 CO ₂濃度が決定され、気流がそれに応じて調整され吐き出さ。次に、我々は^、13 C標識オクタン酸と混合卵黄から成る試験食を投与する。マウスを絶食と訓練されているので、それらは一般的には2分以内に試験食を食べます。投与オクタン酸は胃で吸収されませんが、十二指腸で取り上げられることになるdは解放され、周囲の空気中の¹³ CO ₂の濃縮で、その結果、吐き出され^、13 CO _2、に肝臓で代謝されてしまいます。大気試料は決められた時間間隔で収集され、炭素同位体分析器によって分析される。このプロセス全体の律速段階は、胃排出能であり^、13 CO ₂の肺の排泄は、直接標識食事の胃排出能に対応しています。

図1胃排出装置の模式図。一晩絶食後、マウスを移動すると、それらを自由に回転できるように透明なチャンバー内に配置されます。入口管は、新鮮で一定の空気の流入を可能にし、コンセントは¹³の^C-to-12を測定するために同位体分析装置につながる呼気中のC比。チャンバは^[13 C] -オクタン酸を含む食品の配達のための中央のポートを持っています。

プロトコル

1。マウスのトレーニングと馴化

1. 分析に先立ち、試験条件にそれらを慣らすために、一定のエアフローと2から4時間の試験室ですべてのマウスを置く。これが顕著にそうでなければ胃排出遅延の異常検出が発生する可能性があり、ストレスレベルを低減します。マウスの胃排出実験が実行されていたかのように同じように扱う。オクタン酸を追加することなく、卵黄を（後述）を準備し、各マウスに0.2グラムを養う。
2. マウスは、十分に訓練されているまで（通常は2〜3倍）、このプロセスを繰り返します。環境条件が同じに保たれているようにしたマウスは、通常、簡単に限り、慣らされています。

注：非慣れたマウスは慣れたマウスは素早く静かに彼らの新しい環境と休息に定住しながら、チャンバーへの転送後、約1時間の周りに移動して、排便すると頻繁に排尿し続けています。

ノーTE：実験中：そのような過剰な排尿、排便、卵を食べることへの関心の欠如など、慣れの損失の兆候がモニター動物。このような場合は再度前胃排出データを取得するには空室に1-2回habituatingを検討してください。この実験をしている間に一貫性が極めて重要である。物事を正確に同じ方法を行うと、毎回は、信頼性と再現性のある結果を得るための唯一の方法です。これは彼らのケージメイトからマウスを分離しない、毎日同じ時刻に（ 例えば、インスリン）絶対に必要でない場合、マウスを絶食すると同時に、胃排出試験を開始し、マウスを扱うのと同じ方法で治療を与えることが含まれています。

2。試験食を含む同位体の調製

1. 50mlファルコンチューブに卵黄の5グラムを量り始めてください。新鮮な試験食を準備するために、各実験当日、これらの手順を繰り返します。
2. concentrとオクタン酸10μlを追加ファルコンチューブにスパチュラで1分間激しく卵とミックスを含む50mlファルコンチューブに2μlの/ gのation。
3. 卵をガラスビーカーに移し、それが凝固し、その一貫性は小さいボールを作るのに適しているまで、ブンゼンバーナーで加熱されています。これは、典型的には約30秒かかります。

注：卵黄のボールはマウス1匹当たり0.2グラムの重量を量るべきである。これは、すべてのマウスでは累積投与量を一定に保つことが重要です。

3。実験の開始

1. 食糞を防止するために、金属の "メッシュ底"断食ラック上（12時間）速いマウスは一晩、一回訓練を受けたと胃排出の準備が整いました。彼らは飲料水への無料アクセスを提供していることを確認してください。糖尿病マウスは、現在の実験で使用されているので、それらは以上16時間絶食させてはいけません。
2. 胃が空室を設定することで起動します。空気乾燥してきたクリーンチャンバーとカバーを使用しています。また、任意のアナライザまたはCO ₂空気供給源にチャンバーを接続するチューブが水分を含まなければなりません。水が分析装置により読み出された信号に干渉する可能性が
3. 一定の空気の流れを提供するインレットチューブにチャンバーを接続します。その後マシンにチャンバーから出口管を接続してください。チューブを閉じて空気の流れをオンにします。

注：彼らは簡単に閉じ、しっかりと密封されるようにカバーの蓋の端にワセリンの非常に少量を適用します。このタイトなシールは、マウスによって生成されたすべての二酸化炭素を回収することが必要である。

4。実験手順

1. 各マウスの重量を量ることから始めます。体重はその継続的健康の指標です。次に、適切なチャンバー内に各マウスを置きます。それは空気が、この時点でチャンバーに流入していることはもちろん重要です。
2. 測定を開始するには、マウスが調整前室に順応させて空気レベルをING。
3. マウスは数分かかることがあり、落ち着いて見えると、各マウス室用空気流量を調整します。これは、それぞれのマウスとは異なる場合があります。典型的には、空気の流れがCO _2が使用されているどのような機器で検出可能なレベルに達すると、レベルは健康的な空気の離職率を確保するのに十分に低いままであることを確認するために呼気ことを確認するために、実験開始時に調整されます。我々は、万人あたり1,000〜1,500部品との間の最初のCO ₂レベルを使用します。
4. 調整が困難な場合は、エア漏れをチェックします。その後、チャンバのそれぞれの処理を繰り返しますし、通気を行った調整は、CO ₂レベルを修正したかどうかを確認するために測定の別のラウンドを監視します。それは、マウスを供給する前に読んで着実にベースラインを得ることが重要である。我々は、自己校正機能を備えたマシンを使用しています。これがない場合はケース·キャリブレーションをチェックする必要があります。
5. これが達成されると、卵の食事の管理最初にマウスと記録時間に各マウスは食べ物を受け取ります。
6. 我々は、各マウスの¹³ CO _2の濃縮曲線をフィッティングのために十分な値を得るために、4時間の手順を実行します。マウスでCO ₂濃度は、マウスにはまだ安全であることを確認するために、すべての30〜60分を確認してください。
7. テストが終わった後のマウスはすぐに食べ始めることができるように、テストの終了前に食品を含む新しい箱を用意します。

結果

三つの異なるマウスから設定の代表的なデータを図2に示します。黒いグラフは通常の胃排出能を持つマウスからのデータポイントを表します。それは、時間の関数として表される時間当たり投与量の割合として表される呼気に回収される¹³ Cの割合を示しています。青い曲線は、40分のT半値で加速胃排出能を持つマウスからのものであり、赤い曲線は、168分のT半値で空に...

ディスカッション

記載された技術は、本明細書で、マウスにおける固体胃排出能の in vivo測定で繰り返して、非侵襲することができます。このシステムでは、動物は、それらを移動して自由に回転できるように、測定室に拘束されないという利点があります。これは不慣れな環境であるため、マウスはまだ訓練され、胃内容排出へのストレスの影響を防ぐために試験室に慣れなければならない。?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NAME	会社	CATのNUMBER	コメント
一定の空気供給、流れの源ならびに組成	研究施設の中心的な空気供給
エアインレット、エアアウトレット、食品管理の開口部を有し、130ミリリットルのサンプリング室 空気供給用のプラスチックチューブ	社内に構築
オクタン酸	ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ（アンドーバー、マサチューセッツ州）	CLM-293から1
卵の食事を準備するには： 小さなビーカー 50mlのプラスチックチューブ ブンゼンバーナー 卵 へら	すべてのサプライヤ		してみてください卵の栄養成分とおいしさは、食事の摂取と胃排出能に影響を与えることができるので、卵サプライヤーとの整合性
二酸化炭素同位体分析器	ロスガトスリサーチ社（カリフォルニア州マウンテンビュー）