Évaluation de la vidange gastrique chez des souris diabétiques non obèses aide d&#39;un [<sup&gt; 13</sup&gt; C]-octanoïque test respiratoire à l&#39;acide

Résumé

Détermination de la vidange gastrique avec un non-invasive [ ¹³ C]-octanoïque test respiratoire à l'acide pour la gastroparésie suivi dans des souris femelles NOD LTJ.

Résumé

Gastriques études vidange chez la souris ont été limités par l'incapacité à suivre les changements de vidange gastrique chez le même animal, depuis les techniques les plus couramment utilisées nécessitent l'abattage des animaux et la récupération post-mortem de ^l'1,2 repas. Cette approche empêche études longitudinales afin de déterminer les modifications de la vidange gastrique avec l'âge et la progression de la maladie. L'couramment utilisés ^[13 C]-octanoïque test respiratoire à l'acide pour l'homme ³ a été modifié pour une utilisation chez les souris et les rats ^{06.04 7} et nous avons précédemment montré que ce test est fiable et sensible aux variations de la vidange gastrique en réponse à la drogue et au cours de progression de la maladie diabétique ^8. Dans cette vidéo de présentation du principe et de la mise en œuvre pratique de ce test modifié est expliqué. Comme dans l'étude précédente, les souris NOD LTJ sont utilisés, un modèle de diabète de type 1 ^9. Une partie de ces souris développent les symptômes de la gastroparésie, une complication de diabetes caractérisé par la vidange gastrique retardée, sans obstruction mécanique de l'estomac ^10.

Cet article montre comment former les souris pour le test, la façon de préparer le repas test et obtenir 4 h gastriques données vidange et comment analyser les données obtenues. L'analyseur d'isotopes du carbone utilisé dans la présente étude est approprié pour le prélèvement automatique des échantillons d'air à partir de 12 souris en même temps. Cette technique permet au suivi longitudinal de la vidange gastrique des grands groupes de souris atteintes de diabète ou d'autres maladies de longue date.

Introduction

Ce manuscrit décrit les considérations techniques et méthodologiques liées à la mesure non invasive de la vidange gastrique chez la souris. En suivant le protocole décrit ici, les enquêteurs de façon fiable et reproductible suivre l'évolution de la vidange gastrique due au développement de la maladie, d'étudier l'impact des agents pharmacologiques sur la vidange gastrique et le suivi de la réponse de la vidange gastrique pour le traitement de maladies sous-jacentes ou les défauts ^{6,8, 11,12.} Dans les publications antérieures, l'application de ¹³ C tests d'haleine acide octanoïque a été montré pour être un moyen utile de mesurer la vidange gastrique chez les humains et les animaux ^3,8. Ce document décrit en détail les procédures nécessaires pour obtenir des données fiables sur la 8 6 à mois nécessaires pour une étude longitudinale de la vidange gastrique chez des souris atteintes de diabète. Les avantages de suivre ce protocole par rapport aux méthodes déjà publiées sont que l'enquêteur ne peut être assuré le obtaine donnéesd sera fiable et reproductible. En outre, le système automatisé de collecte et d'analyse des échantillons de gaz décrit ici augmente le nombre d'animaux qui peuvent être suivis simultanément dans une étude. Dans l'ensemble, l'objectif de cet article est d'identifier les facteurs clés qui maintiennent l'habituation des souris à l'épreuve et que réduire la variabilité des résultats obtenus.

Pour la mesure in vivo de la vidange gastrique, les souris sont mises à jeun pendant la nuit et placés dans les chambres d'essai en plastique transparent avec débit d'air constant. Après les souris se habitué aux tubes, base ¹³ CO exhalé ₂ niveaux sont déterminés et le débit ajusté en conséquence. Ensuite, on administre un repas d'épreuve composé de jaune d'oeuf mélangé à ¹³ C marqué par l'acide octanoïque. Parce que les souris sont mises à jeun et formés, ils mangent généralement le repas test à moins de 2 min. L'administration d'acide octanoïque n'est pas absorbé dans l'estomac, mais sera repris dans le duodénum und obtiendrez métabolisé dans le foie en ¹³ CO _2, qui est libéré et expiré, résultant en un enrichissement de ¹³ CO ₂ dans l'air ambiant. Des échantillons d'air sont prélevés à des intervalles de temps déterminés et analysés par l'analyseur isotopique du carbone. L'étape limitante dans tout ce processus est la vidange gastrique et l'excrétion pulmonaire de ¹³ CO ₂ correspond directement avec la vidange gastrique du repas étiquetés.

Figure 1. Schéma du dispositif de vidage gastrique. Après une nuit de jeûne, les souris sont placées dans des chambres transparentes leur permettant de se déplacer et de tourner librement. Un tube d'entrée d'air permet afflux fraîche et constante et une sortie mène à l'analyseur isotopique pour mesurer la ^{13 C-à-12}Rapport C dans l'air expiré. La chambre dispose également d'un orifice central pour la livraison de denrées alimentaires contenant ^[13 C]-octanoïque.

Protocole

1. La formation et l'habituation des souris

1. Avant l'analyse, mettre toutes les souris dans les enceintes d'essai pour 2-4 heures avec débit d'air constant afin de les habituer aux conditions d'essai. Cela réduit considérablement le niveau de stress qui pourraient causer de détection aberrante de la vidange gastrique. Traiter les souris de la même manière que si l'expérience de la vidange gastrique était en marche. Préparer le jaune d'œuf (voir plus loin) sans ajouter de l'acide octanoïque et nourrir 0,2 g à chaque souris.
2. Répétez ce processus jusqu'à ce que les souris sont suffisamment formés (en général 2-3 fois). Les souris sont généralement s'habituent facilement aussi longtemps que les conditions environnementales sont restés les mêmes.

Remarque: non habitués souris continuent à se déplacer pendant environ 1 heure après le transfert à la chambre, et de déféquer et d'uriner fréquemment, tandis que les souris habitués rapidement s'installer dans leur nouvel environnement et se reposer tranquillement.

Aucunte: Pendant l'expérience: animaux Surveiller les signes de perte d'accoutumance comme une miction excessive, la défécation, le manque d'intérêt à manger l'œuf. Si c'est le cas, pensez à réutiliser habituer dans une chambre vide 1-2 fois avant d'obtenir des données gastriques vidange. La cohérence est très importante lors de cette expérience. Faire les choses exactement de la même façon à chaque fois que c'est la seule façon d'obtenir des résultats fiables et reproductibles. Cela inclut accorder un traitement (par exemple l'insuline) tous les jours dans le même temps, ne pas séparer les souris de leurs compagnons de cage sauf si c'est absolument nécessaire, le jeûne, les souris et de lancer le test de la vidange gastrique, en même temps, et la manipulation des souris de la même manière.

2. Préparation du repas test contenant des isotopes

1. Commencez par peser 5 g de jaune d'oeuf dans un tube Falcon de 50 ml. Répétez ces étapes chaque jour expérimental pour préparer un repas d'épreuve frais.
2. Ajouter 10 ul d'acide octanoïque avec un concentrtion de 2 pl / g dans le tube Falcon de 50 ml contenant de l'œuf et mélanger vigoureusement pendant 1 min avec une spatule dans le tube falcon.
3. L'œuf est ensuite transféré dans un bécher en verre et chauffé au-dessus d'un bec Bunsen jusqu'à ce qu'il se coagule et sa consistance est apte à faire des petites boules. Cela prend habituellement environ 30 secondes.

Remarque: Les boules de jaune d'œuf doit peser 0,2 g par souris. Il est important de garder la dose cumulée constante chez toutes les souris.

3. Démarrage de l'expérience

1. Une fois formés et prêts pour la vidange gastrique, rapide chez les souris pendant la nuit (12 h) sur un métal "mesh-bas" rack jeûne pour empêcher la coprophagie. Assurez-vous qu'ils aient libre accès à l'eau potable. Depuis souris diabétiques sont utilisés dans l'expérience actuelle, ils ne devraient pas être à jeun depuis plus de 16 heures.
2. Commencez par la mise en place des chambres de vidange gastrique. Utilisez chambres propres et des couvertures qui ont été séchés à l'air. En outre, toutetubes reliant les chambres à l'analyseur ou le CO ₂ de l'air d'alimentation doit être exempt d'humidité, l'eau peut interférer avec le signal lu par l'analyseur
3. Relier les chambres de tubes d'entrée qui fournissent un flux d'air constant. Puis connecter les tubes de sortie des chambres de la machine. Fermer les tubes et allumez le flux d'air.

Remarque: Appliquer une très petite quantité de vaseline à la fin des couvercles de couverture afin qu'ils ferment facilement et sont bien scellés. Cette étanchéité est nécessaire de collecter tout le dioxyde de carbone produit par les souris.

4. Procédures expérimentales

1. Commencez par peser chaque souris. Le poids corporel est une mesure de leur bonne santé continue. Ensuite, placez chaque souris dans la chambre appropriée. Il est bien sûr important d'avoir l'air circulant dans les chambres à l'heure actuelle.
2. Pour démarrer la mesure, permettre aux souris de s'acclimater à la chambre avant de réglertion des niveaux d'air.
3. Une fois que les souris semblent calmes, ce qui peut prendre quelques minutes, régler le débit d'air pour chaque chambre de la souris. Cela peut être différent pour chaque souris. Typiquement, le débit d'air est ajusté au début de l'expérience afin de s'assurer que CO ₂ expiré atteint des niveaux détectables par tout l'équipement est utilisé, et de faire en sorte que le niveau reste assez faible pour assurer une rotation de l'air en bonne santé. Nous utilisons premiers niveaux de CO ₂ entre 1000 et 1500 parties par million.
4. Si des difficultés avec les ajustements, vérifier les fuites d'air. Ensuite, répétez le processus pour chacune des chambres et regarder une autre série de mesures pour voir si les ajustements apportés au flux d'air ont corrigé le niveau de CO _2. Il est important d'obtenir une ligne de base stable à lire avant de nourrir les souris. Nous utilisons une machine avec une fonction de calibrage automatique. Si ce n'est pas le cas, l'étalonnage doit être vérifié.
5. Lorsque ceci est réalisé, administrer le repas oeufà la première de la souris et enregistrer le temps de chaque souris reçoit la nourriture.
6. Nous exécuter la procédure pendant 4 heures pour obtenir des valeurs suffisamment pour ajuster la courbe ¹³ CO ₂ pour chaque enrichissement de la souris. Arrivée sur les souris toutes les 30-60 min pour s'assurer que les niveaux de CO ₂ sont encore sécuritaires pour les souris.
7. Préparer de nouvelles boîtes contenant de la nourriture avant la fin de l'essai, les souris peuvent commencer à manger immédiatement après l'essai est terminé.

Résultats

A données représentatives établies à partir de trois différentes souris est illustré à la figure 2. Le graphique noir représente les points de données provenant d'une souris avec la vidange gastrique normale. Elle montre la fraction de ¹³ C qui est récupérée dans l'air expiré, exprimée en pourcentage de la dose administrée par heure, exprimée en fonction du temps. La courbe bleue est d'une souris avec une accélération de la vidange gastrique avec une valeur moiti...

Discussion

La technique décrite ici permet d'répétées et non invasive la mesure in vivo de la vidange gastrique solide chez la souris. Ce système présente l'avantage que les animaux ne sont pas retenus dans la chambre de mesure, ce qui leur permet de se déplacer et de tourner librement. Comme il s'agit d'un environnement peu familier, les souris ont encore besoin d'être formés et habitués aux chambres d'essais pour prévenir les effets du stress sur la vidange gastrique. En gén?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOM	ENTREPRISE	NOMBRE CAT	COMMENTAIRES
Une source d'amenée d'air constant, le débit et la composition	alimentation en air centrale dans le centre de recherche
130 ml chambre d'échantillonnage qui a l'air d'admission, de sortie d'air, et l'ouverture administration des produits alimentaires Tubes en plastique pour alimentation en air	In-house construit
L'acide octanoïque	Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA)	CLM-293-1
Pour préparer le repas d'œufs: petit bécher Tube de 50 ml en plastique Bec Bunsen œuf spatule	Tout fournisseur		Tâcher deêtre cohérent avec le fournisseur oeuf puisque le contenu nutritionnel et la palatabilité des œufs peuvent affecter la vidange gastrique et l'ingestion du repas
Le dioxyde de carbone isotope analyseur	Los Gatos Research Inc (Mountain View, CA)