GST-Su purificación: A dos pasos Affinity Protocolo Purificación Cediendo largos proteínas purificadas

Resumen

En el presente protocolo, se demuestra un método de purificación de proteínas a pequeña escala altamente eficiente y rentable, que permite la purificación de proteínas recombinantes, combinando de forma única una etiqueta de GST escindible y una pequeña cola de His.

Resumen

Ensayos de clave en enzimología para la caracterización bioquímica de las proteínas in vitro requieren altas concentraciones de la proteína purificada de interés. Protocolos de purificación de proteínas deben combinar eficiencia, simplicidad y rentabilidad ^1. Aquí, describimos la GST-Su método como un nuevo sistema de purificación por afinidad a pequeña escala para proteínas recombinantes, sobre la base de un N-terminal de la etiqueta glutatión Sepharose (GST) ^2,3 y una etiqueta 10xHis C-terminal ^4, que tanto se fusionan a la proteína de interés. La última construcción se utiliza para generar baculovirus, para la infección de las células Sf9 infectadas para la expresión de proteínas ^5. GST es una etiqueta bastante largo (29 kDa), que sirve para asegurar la eficacia de la purificación. Sin embargo, podría influir en las propiedades fisiológicas de la proteína. Por lo tanto, en que posteriormente se escinde la proteína usando la enzima PreScission ^6. Con el fin de garantizar la máxima pureza y para eliminar el GST escindido, nosañadido una segunda etapa de purificación de afinidad basada en la comparativamente pequeña etiqueta de His. Es importante destacar que, nuestra técnica se basa en dos etiquetas diferentes que flanquean los dos extremos de la proteína, que es una herramienta eficaz para eliminar las proteínas degradadas y, por lo tanto, enriquece proteínas de longitud completa. El método que aquí se presenta no requiere una configuración fundamental caros, tales como FPLC. Además, incorporamos MgCl ₂ y lavados ATP para eliminar las impurezas de la proteína de choque de calor y tratamiento con nucleasa de abolir ácidos nucleicos contaminantes. En resumen, la combinación de dos etiquetas diferentes que flanquean el N-y C-terminal y la capacidad de escindir una de las etiquetas, garantiza la recuperación de una proteína altamente purificada y de longitud completa de interés.

Introducción

La purificación de proteínas recombinantes es crucial para hacer frente a cuestiones fundamentales de la bioquímica. Formas convencionales de purificación de proteínas, como la cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaños se basan en las propiedades físicas de la proteína diana, como su punto isoeléctrico y la carga o el tamaño, respectivamente. Las características de proteínas últimos son compartidos por una variedad de proteínas, lo que aumenta considerablemente la probabilidad de proteínas contaminantes en las estrategias de purificación de proteínas convencionales. Este problema puede ser evitado con el uso de múltiples columnas de purificación, lo que consume tiempo. Al mismo tiempo, los métodos de cromatografía de éstos exigen configuración experimental caro. La purificación por afinidad-etiqueta aumenta fuertemente objetivo-especificidad, como en la mayoría de los casos la etiqueta será único para la proteína de interés. En estudios recientes, la purificación de la bandera-o HA-afinidad se ha usado ampliamente.

En contraste con rec existenteprotocolos de purificación de proteínas ombinant en la que se utilizan etiquetas individuales, se estableció la combinación única de dos etiquetas. Nuestro método implica la fusión de una etiqueta de GST en el extremo N-terminal y una etiqueta de His en el extremo C-terminal de la proteína de interés, para una relación óptima entre la cantidad y la pureza de la proteína deseada. El GST es un largo etiqueta (29 kDa), que es altamente eficiente para la purificación sobre glutatión Sepharose bolas. Por otra parte, el uso de GST garantiza la rentabilidad de nuestro método ^1. La posibilidad de escindir la GST con la enzima PreScission (con secuencia de reconocimiento de LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, lo que resulta en la adición de sólo dos aminoácidos) tiene muchas ventajas, por ejemplo, esta estrategia evita alteraciones de las funciones de las proteínas fisiológicas debido al impedimento alostérico. La pequeña etiqueta de His fusionada a la otra extremidad de proteína sirve en una segunda etapa de purificación para aumentar la pureza de proteína mediante el lavado de la GST escindido, así como las proteínas degradadas y otra contaminantes. Además, el protocolo no requiere una etapa de diálisis cuando se cambia de la GST para columnas de paso de la Su-purificación (resina TALON). Contaminantes comunes en este tipo de procesos de purificación son proteínas de choque térmico (HSP). La adición de una etapa de incubación con MgCl ₂ y ATP permite la eliminación de estos contaminantes (Figura 1).

Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) son técnicas comunes que dependen de instrumentación costosa de generar un alto rendimiento de la proteína purificada de interés. El protocolo de purificación de lotes se presenta aquí, en contraste, es manual y no requiere una configuración de instrumento caro. Un alto rendimiento de proteína se puede llegar por la ampliación del protocolo. Al mismo tiempo, con el protocolo de purificación de lotes, el volumen de elución se puede ajustar con el fin de mejorar la concentración de proteína, que no se da con FPLC o HPLC.

ntent "> También, con el GST-Su protocolo de purificación por lotes, las proteínas con un tamaño de rango de ~ 10-300 kDa pueden purificarse. Una de las mayores ventajas es dada por el hecho de que uno puede purificar varias proteínas al mismo tiempo , por ejemplo, tanto una de tipo salvaje y su proteína mutante. El éxito del protocolo presentado depende únicamente en el nivel de expresión y la solubilidad de la proteína de interés.

Protocolo

1. Producción de baculovirus recombinante

Los baculovirus son generados utilizando el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac de Invitrogen principalmente de acuerdo con el protocolo del fabricante con modificaciones sólo leves:

1. A pFastBac1 vector modificado (Gibco, la vida) fue creado que contiene el GST y Sus etiquetas (Figura 2). El sitio de clonación múltiple (MCS) de un pET-52b (+) vector (Novagen), que contiene una 10xHis-tag, se insertó en el MCS de un vector pFastBac1 generar pFastBac1-Strep-10xHis. La secuencia de MCS pET-52b (+) fue amplificado por PCR entre los sitios de restricción XbaI y BLPI, la adición de un sitio de restricción BglII en el extremo 5 'y un sitio de restricción HindIII en el extremo 3'. El producto de PCR se clonó entonces entre BamHI y el sitio de restricción HindIII de pFastBac1, usando la compatibilidad de las secuencias de restricción BamHI y BglII. Puesto que el objetivo era generar un pFastBac1 permite la expresión deproteína recombinante con estreptavidina y 10xHis-tags, el sitio de restricción BamHI de pET-52b (+) no se utilizó la secuencia de MCS. Además, el sitio de restricción XbaI no se utilizó para evitar la redundancia de los sitios de restricción que se producen entre los sitios que ya están en el MCS de pFastBac1 y estos insertado con el MCS de pET-52b (+). A continuación, se inserta la secuencia de codificación GST con el sitio PreScission proteasa reconocimiento (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) en pFastBac1-Strep-10xHis. La secuencia de ADNc de GST a partir de pGEX-6P-2 (GE Healthcare) se amplificó por PCR con cebadores que contienen sitios de restricción NcoI y KpnI en los extremos 5 'y 3' extremidades, respectivamente. El sitio NcoI permite la adición de un codón de inicio sino también una alanina a la GST. El producto de PCR fue clonado en pFastBac1-Strep-10xHis entre los sitios de restricción NcoI y KpnI, dando lugar a la supresión de la estreptavidina-tag. El nuevo vector de fusión así obtenido se denominó pFastBac1-GST-10xHis.
2. Clonar el ADNc que codifica para la prOtein de interés en el vector pFastBac-GST-10xHis entre la GST (N-terminal) y la etiqueta de His (C-terminal). Tenga cuidado de eliminar el codón de parada de ADNc para permitir la fusión con el extremo C-terminal de His-tag.
3. Transformar E. coli DH10Bac con el pFastBac recombinante (obtenida en la etapa 1.2) para generar el bácmido. Permitir colonias para crecer durante la noche a 37 ° C y varias horas a 30 ° C en placas de selección que contienen Bluo-gal e IPTG (10 mg / ml de tetraciclina, 50 mg / ml de kanamicina, 7 mg / ml de gentamicina, 100 mg / ml de Bluo- Gal, 40 g / ml de IPTG).
4. Pick and restreak 2 colonias blancas (del Paso 1.3) en placas de selección para confirmar el fenotipo blanco.
5. Inocular 2 ml de LB que contienen 10 mg / ml de tetraciclina, 50 mg / ml de kanamicina, 10 mg / ml de gentamicina con las dos colonias blancas de la etapa 1.4 y dejarlos crecer durante la noche bajo agitación (250 rpm) a 37 ° C.
6. Con el fin de purificar el ADN bácmido, sedimentar las bacterias de la etapa 1.5,resuspender las células en 300 l de solución I y añadir 300 l de solución II (kit de Qiagen maxiprep). Incubar durante 5 min a temperatura ambiente, añadir 300 l de 3 M KOAc pH 5,5 y se incuba durante 10 minutos en hielo. Centrifugar las muestras a 4 º C, la velocidad máxima durante 10 min. Añadir 800 l de isopropanol a los sobrenadantes y se incuba durante 10 minutos en hielo. Centrifugar las muestras durante 15 min a 4 ° C y lavar el precipitado con 500 l de etanol al 70%. Deje que el pellet seco y resuspender en condiciones estériles en 40 l de Tris-EDTA pH 8,0. El ADN bácmido debe almacenarse a 4 ° C.
7. Generar baculovirus como se describe en el protocolo del fabricante. Los baculovirus se pueden almacenar a 4 º C protegidas de la luz.

2. Expresión de proteínas recombinantes

1. Con el fin de elegir el baculovirus más eficiente para la purificación y para vigilar a qué hora se alcanza el pico de expresión de la proteína, lleve a cabo un ensayo de mini-infección de unas sigue: Infect 2 x 10 ⁷ Sf9 de células infectadas se cultivaron a 27 ° C en medio de Grace (complementado con 10% de FBS y 1% P / S) con 133 l (1/150) de baculovirus. Recoger alícuotas de 1,5 ml a 0, 24, 48, y 72 horas después de la infección. Sedimentar las células y analizar el nivel de expresión de la proteína de interés mediante transferencia Western usando anticuerpos anti-etiqueta.
2. Utilice el baculovirus más eficiente desde el paso 2.1 para infectar una ruleta que contiene 1,0 x 10 ⁶ células Sf9 por ml en 500 ml de los medios de comunicación con una proporción de 1/150 entre el virus y los medios de comunicación. Deje que las células infectadas crecen en suspensión a 27 º C y cosechan las células cuando se alcanza la máxima expresión de proteínas (según lo determinado en el paso 2.1). Las células sedimentadas se pueden almacenar a -80 ° C hasta su uso posterior.

3. Preparación de lisado celular soluble

Todas las siguientes etapas de incubación se llevan a cabo a 4 ° C en rotación suave.

1. Lyse Scélulas F9 que expresan su proteína de interés en ~ 20 ml de tampón de unión de GST (NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,05% de Triton-X-100, 1 mM de DTT en PBS1X para una concentración final de NaCl de 250 mM, y el inhibidor de la proteasa cóctel (Roche). En un baño de agua helada, Dounce la solución 20x con un homogeneizador Dounce, sonicar 3x 30 segundos cada uno (salida 70%), y de nuevo Dounce 20x.
2. (Opcional). Incubar el lisado total de células con 1 mM de MgCl ₂ y Benzonase nucleasa ⁷ (2,5 U / ml) durante 30 min a 4 ° C para eliminar la contaminación de ADN o ARN.
3. Centrifugar a 18000 rpm durante 30 min a 4 ° C. Mantenga el sobrenadante.
4. (Opcional). Centrifugar el sobrenadante de nuevo durante 30 min a 18.000 rpm a 4 ° C para obtener un lisado soluble clara. Pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 o 0,45 micras para evitar obstrucciones.

4. Unión de la proteína en los granos de GST

1. Incubar el lisado soluble de células con 1 ml de perlas de GST (previamente lavada dos veces con10 ml de tampón de unión de GST) durante 1 hora a 4 ° C en rotación suave.

Comentario: El tiempo de incubación debe ser optimizado de acuerdo a la estabilidad de la proteína y la eficacia de unión.

2. Un paseo rápido a 700 rpm y eliminar el sobrenadante que contiene las proteínas no unidas (esto se pueden mantener para su posterior análisis). Lavar las proteínas GST unida (Figura 3B, pista 1) con tampón de lavado de GST (GST tampón de unión con 350 mM de NaCl final de).
3. Repita el paso 4.2 2x. En el último lavado, eliminar la mayor cantidad sobrenadante como sea posible.
4. Incubar las perlas con 5 mM de ATP y 15 mM de MgCl ₂ (en tampón de unión 10 ml de GST) durante 1 hora a 4 ° C para evitar la unión no específica de proteínas de choque térmico ^8. Lavar las perlas tres veces con tampón de lavado de GST.

5. PreScission escisión del GST

1. Centrifugar las perlas de GST, separar el sobrenadante y lavar las perlas de GST con P5 bufFer (50 mM NaHPO ₄ pH 7,0, NaCl 500 mM, 10% de glicerol, 0,05% de Triton-X-100, imidazol 5 mM).
2. Incubar las GST-cuentas con enzima PreScission en tampón P5 de 3 horas a la noche a 4 ° C. (Divida las perlas de GST en fracciones de 100 l y agregue 4-8 unidades (2-4 mu l) de la enzima diluida en 100 l de tampón P5).

Comentario: El tiempo de incubación de la etapa de PreScission debe ser optimizado de acuerdo con el peso molecular, así como la estabilidad de la proteína. Si se observa la degradación, este tiempo de incubación se puede disminuir a un mínimo de 2 horas en lugar de durante la noche.

3. Un paseo rápido y recoger el sobrenadante. Repita este paso dos veces después de la adición de 100 l de P5 amortiguar hasta el talón y aunar todas las fracciones (Figura 3B, carril 2).

Comentario: Las perlas restantes pueden ser utilizados para el análisis de la eficacia de escisión (Figura 3B , carril 3). Por lo general, 70-80% de la proteína se escinde.

6. A TALON metal Affinity Resin La unión a proteínas-

1. Divida la elución desde arriba en 3 fracciones de 1 ml e incubar cada uno con 100 perlas secas de resina de afinidad de metal Talon mu l (prelavadas dos veces con tampón de P5) durante 1 hora bajo rotación.

Comentario: La división de la elución en varias fracciones aumenta la eficiencia de unión / lavados.

2. Lavar la resina 5 min con tampón de P30 (tampón P5 con una concentración final de imidazol 30 mM).
3. Repita el paso 6.2 2x y agrupar las cuentas en un solo tubo. Antes de que el último lavado, eliminar la mayor cantidad sobrenadante como sea posible.

Comentario: Esto corresponde a la TALON unido de la muestra (Figura 3B, carril 4).

7. La elución de la proteína purificada

1. Se incuba la proteína unida a resina TALON durante 5 min en rotación con P500 tampón (tampón P5 con una concentración final de imidazol 500 mM). Utilice una relación entre la memoria y cuentas de 1:1 v / v (Por ejemplo, si usted ha tomado 200 l de granos secos, usted tendrá que añadir 200 l de P500). Repita este paso dos veces y mantener cada fracción eluida por separado (llamado elución 1 (E1), elución 2 (E2) y la elución 3 (E3); Figura 3B, carriles 5-7).

Comentario: Las perlas restantes pueden ser utilizados para el análisis de la eficiencia de elución (Figura 3B, pista 8). Típicamente, un 60-80% de la proteína se eluye en total.

2. Analizar la cantidad y la calidad de su proteína purificada por la carga de aproximadamente 20-40 l de cada fracción con una concentración patrón de BSA en un SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie (Figura 3B) o SYPRO tinción de proteínas para la visualización.

Comentario: La proteína de interés se puede detectar también excelentes referenciasughout el procedimiento de purificación utilizando anti-GST y anticuerpos anti-His (Figura 3C).

8. El almacenamiento de la proteína purificada

1. Se dializa la proteína purificada contra un tampón de almacenamiento apropiado (por ejemplo 20 mM de Tris Acetato pH 8,0, 200 mM de KAc, 10% de glicerol, EDTA 1 mM, DTT 0,5 mM) a 4 ° C. Es importante comprobar la precipitación de la proteína purificada durante la diálisis. Por lo general, diálisis a 2x durante 1 hora a 4 ° C bajo rotación agitación.
2. Hacer pequeñas alícuotas de la proteína purificada (10-20 l) y la congelación en hielo seco durante 30 min. Almacene las alícuotas a -80 ° C y evitar muchos ciclos de descongelación / congelación.

Resultados

Con el fin de ilustrar la eficiencia de la GST-Su protocolo de purificación, purificamos Rec14, un S. pombe proteína de 32,9 kDa. El cDNA fue clonado Rec14 en nuestro vector pFastBac1 modificado que permite la adición de GST-y sus etiquetas en el extremo N-y C-terminales, respectivamente (Figura 1 A). El baculovirus recombinante se prepararon entonces y se utilizan para infectar células SF9 infectadas para la expresión de proteínas. Los lisados ​​celulares solubles se incubaron con pe...

Discusión

El GST-Su protocolo de purificación que aquí se presenta es adecuado para la purificación de una amplia gama de tamaños de proteínas recombinantes: Se purificaron con éxito Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120 kDa), PALB2 (130kDa), y una proteína de alto peso molecular inestable peso de Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) ^6,9. Por otra parte, las proteínas purificadas con este protocolo eran bioquímicamente activa ^6. El éxito de este método depende únicamente de la expres...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			REAGENTS
E.Coli DH10Bac (competent)	Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Invitrogen
Maxi Prep Kit	Qiagen	12163	Solution I and II
Ultra Pure Bluo-Gal	Gibco (Life)	15519028
IPTG	Gibco (Life)	15529019
Sf9 infected cells	ATCC	CRL-1711
PreScission enzyme	GE Healthcare	27084301
Grace's infected medium supplemented	Gibco (Life)	11605-094
Fetal Bovine Serum characterized	Hyclone	SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin)	Gibco (Life)	15070-063
Glutathione Sepharose resin	GE bioscience	17075605
Protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Talon resin	Clontech	635504
Imidazole	BioShop	288324
Gentamicin	Gibco (Life)	15710064
Polyclonal GST-antibody	Production in house
Monoclonal 6X-His-antibody	Clontech	631212
			EQUIPMENT
Dounce homogenizer (tight)	Wheaton	357546
Sonicator (Fisher dismembrator)	Fisher	Model 150
Dialysis bag (50 mm)	Fisher Scientific	2115217