GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

Resumo

No presente protocolo, demonstramos um método altamente eficiente e de baixo custo purificação de proteínas em pequena escala, que permite a purificação de proteínas recombinantes, combinando de forma única um GST-tag quebrável e uma pequena His-tag.

Resumo

Ensaios de chave em enzimologia para a caracterização bioquímica de proteínas in vitro, necessitam de elevadas concentrações de proteína purificada de interesse. Protocolos de purificação de proteína deve combinar eficiência, simplicidade e eficácia de custo ^1. Aqui, nós descrevemos a GST-His método como um novo sistema de purificação por afinidade em pequena escala para as proteínas recombinantes, com base em um N-terminal de etiqueta de glutationa-Sepharose (GST) ^{de 2,3} e uma marcação 10xHis C-terminal de ^4, que são ambos fundida para a proteína de interesse. A última construção é usado para gerar baculovírus, para a infecção de células Sf9 infectadas para a expressão da proteína ^5. GST é uma marca bastante longo (29 kDa), que serve para garantir a eficiência da purificação. No entanto, pode influenciar as propriedades fisiológicas da proteína. Por isso, é subsequentemente clivado da proteína usando a enzima PreScission ^6. A fim de assegurar a máxima pureza e para remover a GST clivada, nósadicionou-se uma segunda etapa de purificação por afinidade com base na comparativamente pequena de His. Mais importante, a nossa técnica é baseada em duas etiquetas diferentes flanqueiam as duas extremidades da proteína, que é uma ferramenta eficaz para remover as proteínas degradadas e, portanto, enriquece proteínas de comprimento total. O método aqui apresentado não requer uma configuração instrumental caros, tais como FPLC. Além disso, incorporamos _MgCl2 e lavagens de ATP para remover impurezas da proteína de choque térmico e tratamento nuclease abolir contaminando ácidos nucléicos. Em resumo, a combinação de duas marcas diferentes flanqueiam o N-e C-terminal e a capacidade para clivar um dos marcadores, garante a recuperação de uma proteína altamente purificada e de comprimento completo de interesse.

Introdução

A purificação de proteínas recombinantes é crucial para tratar de questões fundamentais em bioquímica. As formas convencionais de purificação de proteínas, como a cromatografia de permuta iónica e cromatografia de exclusão de tamanho dependem de propriedades físicas da proteína-alvo, tais como o seu ponto isoeléctrico e carga ou tamanho, respectivamente. As características da proteína últimos são partilhados por uma variedade de proteínas, o que aumenta consideravelmente a probabilidade de as proteínas contaminantes, em estratégias de purificação de proteínas convencionais. Este problema pode ser contornado com o uso de várias colunas de purificação, o que é demorado. Ao mesmo tempo, os últimos métodos de cromatografia de exigir configuração experimental caro. A purificação por afinidade-tag aumenta fortemente a especificidade do alvo, tal como na maioria dos casos, a marcação será único para a proteína de interesse. Em estudos recentes, com Flag ou HA-purificação de afinidade tem sido amplamente usado.

Em contraste com rec existenteprotocolos de purificação de proteínas ombinant em que tags simples são utilizados, foi estabelecida a combinação única de duas tags. O nosso método envolve a fusão de uma etiqueta de GST na extremidade N-terminal e uma cauda de His no terminal C da proteína de interesse, para uma óptima relação entre a quantidade e pureza da proteína desejada. A GST é uma marca longa (29 kDa), que é altamente eficiente para a purificação sobre Sepharose de glutationa. Além disso, utilizando GST garante boa relação custo-eficácia de nosso método ^1. A possibilidade de se clivar a GST com o enzima PreScission (com a sequência de reconhecimento LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, resultando na adição de apenas dois aminoácidos) tem muitas vantagens, por exemplo, esta estratégia evita a alteração das funções fisiológicas de proteínas devido a impedimento alostérico. O pequeno His-tag fundido com o outro extremo da proteína serve num segundo passo de purificação para aumentar a pureza da proteína por lavando a GST clivada, bem como proteínas degradadas e outros contaminantes. Além disso, o protocolo não requer um passo de diálise quando se muda de GST para a coluna passo His-purificação (resina TALON). Contaminantes comuns em tais processos de purificação são proteínas de choque térmico (HSP). A adição de um passo de incubação com _MgCl2 e ATP permite a remoção desses contaminantes (Figura 1).

Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) e cromatografia líquida de alta performance (HPLC) são técnicas comuns que dependem instrumentação dispendiosa para gerar um rendimento elevado de proteína purificada de interesse. O protocolo de purificação de lote apresentamos aqui, em contraste, é manual e não necessita de uma instalação instrumental caro. Um rendimento elevado de proteína pode ser alcançado com a expansão do protocolo. Ao mesmo tempo, com o protocolo de purificação do lote, o volume de eluição pode ser ajustada, a fim de aumentar a concentração de proteína, o que não é dada com FPLC ou HPLC.

ntent "> Além disso, com a GST-His protocolo de purificação do lote, proteínas com uma gama de dimensões de ~ 10-300 kDa pode ser purificada. Uma das maiores vantagens é dada pelo facto de que se pode purificar várias proteínas ao mesmo tempo , por exemplo, tanto um de tipo selvagem e a sua proteína mutante. O sucesso do protocolo apresentado apenas depende do nível de expressão e a solubilidade da proteína de interesse.

Protocolo

1. Produção de recombinante de baculovírus

Os baculovírus são gerados utilizando o Sistema de Expressão de Baculovirus Bac-to-Bac de Invitrogen, principalmente de acordo com o protocolo do fabricante, com apenas ligeiras modificações:

1. Um vetor pFastBac1 modificado (Gibco, a vida) foi criado contendo o GST e Seus-tags (Figura 2). O local de clonagem múltipla (MCS) de pET-52b (+) vector (Novagen), que contém uma etiqueta 10xHis, foi inserido no mcs de um vector pFastBac1 para gerar pFastBac1-Strep-10xHis. A sequência de MCS pET-52b (+) foi amplificado por PCR entre os locais de restrição Xbal e BlpI, a adição de um local de restrição de BglII no terminal 5 'da extremidade e um local de restrição Hind III na extremidade 3'. O produto de PCR foi então clonado entre BamHI e HindIII sítio de restrição de pFastBac1, usando a compatibilidade de sequências de restrição de BamHI e BglII. Uma vez que o objetivo era gerar um pFastBac1 permitindo a expressão deproteína recombinante com estreptavidina-e 10xHis-tags, o sítio de restrição BamHI de pET-52b (+) sequência de MCS não foi utilizado. Além disso, o sítio de restrição XbaI não foi usado para evitar a redundância de sítios de restrição que ocorrem entre os sites que já estão no MCS de pFastBac1 e estes inserido com o MCS de pET-52b (+). A sequência de codificação de GST com o local de reconhecimento PreScission Protease (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) foi então inserido no pFastBac1-Strep-10xHis. A sequência de cDNA a partir de GST pGEX-6P-2 (GE Healthcare) foi amplificado por PCR com iniciadores que contêm sítios de restrição Ncol e Kpnl na extremidade 5 'e 3' das extremidades, respectivamente. O local Ncol permite a adição de um codão de iniciação, mas também uma alanina para o GST. O produto de PCR foi então clonado no pFastBac1-Strep-10xHis entre os sítios de restrição Ncol e Kpnl, resultando na deleção da etiqueta de estreptavidina. O novo vetor de fusão assim obtido foi denominado pFastBac1-GST-10xHis.
2. Clonar o cDNA codificante para a protein de interesse no vector pFastBac-GST-10xHis entre a GST (N-terminal) e a cauda de His (C-terminal). Ter cuidado para remover o codão de terminação para permitir que o cDNA de fusão com o His-tag no terminal C.
3. Transforme E. coli DH10Bac com o pFastBac recombinante (obtida no passo 1.2) para gerar o bacmid. Permitir que as colónias crescer durante a noite a 37 ° C e várias horas a 30 ° C em placas de selecção contendo Bluo-gal e IPTG (10 mg / ml de tetraciclina, 50 ug / ml de canamicina, 7 ug / ml de gentamicina, 100 ug / ml de Bluo- Gal, 40 ug / ml de IPTG).
4. Escolha e restreak duas colônias brancas (a partir do passo 1.3) em placas de seleção para confirmar o fenótipo branco.
5. Inocular 2 ml de LB contendo 10 ug / ml de tetraciclina, 50 ug / ml de canamicina, 10 mg / ml de gentamicina, com as duas colónias brancas a partir do passo 1.4 e deixá-los crescer durante a noite, sob agitação (250 rpm) a 37 ° C.
6. A fim de purificar o ADN de bacmid, sedimentar as bactérias do passo 1.5,ressuspender as células em 300 uL de solução I e adicionar 300 mL de solução II (kit Maxiprep da Qiagen). Incubar durante 5 min à temperatura ambiente, adicionar 300 mL de 3 M KOAc, pH 5,5 e incubação durante 10 min em gelo. Centrifugar as amostras a 4 ° C, a velocidade máxima durante 10 min. Adicionar 800 mL de isopropanol para os sobrenadantes e incubar por 10 min em gelo. Centrifugar as amostras durante 15 min a 4 ° C e lava-se o sedimento com 500 ul de etanol a 70%. Deixar o sedimento secar e ressuspender o sob condições estéreis, em 40 ul de Tris-EDTA a pH 8,0. O ADN de bacmid deve ser armazenada a 4 ° C.
7. Gerar baculovírus, conforme descrito no protocolo do fabricante. Os baculovírus pode ser armazenado a 4 ° C protegidos da luz.

2. Recombinant Protein Expression

1. De modo a escolher o baculovírus mais eficiente para a purificação e para controlar o tempo do pico da expressão da proteína é alcançada, execute um mini-ensaio de uma infecçãos seguintes: Infect 2 x 10 ⁷ de Sf9 infectadas células cultivadas a 27 ° C em meio de Grace (complementado com SBF a 10% e 1% P / S) com 133 ul (1/150) de baculovírus. Recolhe alíquotas de 1,5 ml a 0, 24, 48, e 72 horas pós-infecção. Sedimentar as células e analisar o nível da proteína de interesse por western blotting utilizando anticorpos anti-tag de expressão.
2. Use o baculovírus mais eficiente a partir do passo 2.1 para infectar um spinner contendo 1,0 x 10 ⁶ células Sf9 por ml em 500 ml de mídia com uma proporção de 1/150 entre o vírus e meios de comunicação. Permitir que as células infectadas crescer em suspensão a 27 ° C e colheita das células, quando a expressão máxima de proteína (como determinado no passo 2.1 acima) é alcançado. As células sedimentadas podem ser armazenadas a -80 ° C até posterior utilização.

3. Preparação de Lisado celular solúvel

Todos os seguintes passos de incubação são realizados a 4 ° C sob rotação suave.

1. Lyse SAs células que expressam f9 sua proteína de interesse, em ~ 20 ml de tampão de ligação de GST (NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,05% de Triton-X-100, DTT 1 mM em PBS1X para uma concentração final de NaCl de 250 mM, e inibidores da protease cocktail (Roche). Num banho de água gelada, a solução 20x Dounce com um homogeneizador de Dounce, sonicado 3x 30 segundos cada (produção de 70%), e novamente Dounce 20x.
2. (Opcional). Incubar o ligado total de células com 1 mM de MgCl ₂ e ⁷ nuclease Benzonase (2,5 U / ml) durante 30 min a 4 ° C para remover o ADN de contaminação ou de ARN.
3. Centrifugar a 18.000 rpm durante 30 min a 4 ° C. Manter o sobrenadante.
4. (Opcional). Centrífuga-se o sobrenadante de novo durante 30 min a 18.000 rpm a 4 ° C para obter um lisado solúvel claro. Passar o sobrenadante através de um filtro de 0,2 ou 0,45 mM para evitar o entupimento.

4. Ligação da proteína em GST Beads

1. Incubar o ligado celular solúvel com 1 ml de pérolas de GST (pré-lavado duas vezes com10 ml de tampão GST) de ligação, durante 1 hora a 4 ° C, sob suave rotação.

Comentário: O tempo de incubação deve ser optimizado de acordo com a estabilidade da proteína e eficiência de ligação.

2. Rotação rápida a 700 rpm e remover o sobrenadante contendo as proteínas não ligadas (o que pode ser mantido para uma análise mais aprofundada). Lavar as proteínas ligadas a GST (Figura 3B, pista 1) com tampão de lavagem de GST (GST com tampão de ligação NaCl 350 mM final).
3. Repita o passo 4.2 2x. Na última lavagem, remover tanto sobrenadante quanto possível.
4. Incubar os grânulos com 5 mM de ATP e 15 mM de MgCl ₂ (em 10 ml de tampão de ligação a GST) durante 1 hora a 4 ° C para evitar ligação não específica de proteínas de choque de calor ^8. Lavar as pérolas três vezes com tampão de lavagem de GST.

5. PreScission clivagem do GST

1. Centrifugar as esferas de GST, remover o sobrenadante e lavar as contas de GST com P5 buffer (50 NaHPO ₄ mM pH 7,0, NaCl 500 mM, 10% de glicerol, 0,05% de Triton-X-100, 5 mM de imidazole).
2. Incubar as GST-esferas com enzimas PreScission, em tampão P5 a partir de 3 horas a durante a noite a 4 ° C. (Dividir as esferas de GST em fracções de 100 mL e adicionar 4-8 unidades (2-4 ul) de enzima diluído em 100 ul de tampão de P5).

Comentário: O tempo de incubação do passo PreScission precisa ser optimizada de acordo com o peso molecular, assim como a estabilidade da proteína. Se se observar degradação, este tempo de incubação pode ser reduzido até um mínimo de 2 horas em vez de durante a noite.

3. Rotação rápida e recolher o sobrenadante. Repita esta etapa duas vezes depois de adicionar 100 ml de P5 de tampão aos grânulos e reunir todas as fracções (Figura 3B, pista 2).

Comentário: Os restantes grânulos pode ser usada para a análise de eficácia de clivagem (Figura 3B , pista 3). Normalmente, 70-80% da proteína é clivada.

6. Para TALON metal Affinity Resin-A ligação às proteínas

1. Divide-se a eluição a partir de cima em 3 fracções de 1 ml e incubar cada uma com 100 de resina de afinidade com metal Talon grânulos secos ul (pré-lavado duas vezes com tampão de P5) durante 1 hora sob rotação.

Comentário: Dividindo a eluição em várias frações aumenta a eficiência de ligação / lavagens.

2. Lava-se a resina 5 min com tampão de P30 (P5 tampão com uma concentração final de 30 mM de imidazol).
3. Repita o passo 6.2 2x e reunir as contas em um único tubo. Antes da última lavagem, remover tanto sobrenadante quanto possível.

Comentário: Isto corresponde à amostra ligado GARRA (Figura 3B, pista 4).

7. A eluição da proteína purificada

1. Incubar a resina TALON proteína ligada por 5 min sob rotação com P500 tampão (tampão P5 com uma concentração final de 500 mM de imidazol). Use uma proporção entre o buffer e gotas de 1:1 v / v (Por exemplo, se você tivesse tomado 200 mL de contas secas, você terá que adicionar 200 mL de P500). Repetir este passo duas vezes e manter cada fracção eluída separadamente (chamado de eluição 1 (E1), eluição 2 (E2) e eluição 3 (E3) e a figura 3B, pistas 5-7).

Comentário: Os grânulos restantes podem ser utilizados para análise de eficiência de eluição (Figura 3B, pista 8). Tipicamente, 60-80% da proteína é eluída no total.

2. Analisar a quantidade e qualidade da sua proteína purificada por carregar aproximadamente 20-40 ul de cada fracção com uma concentração padrão de BSA em SDS-PAGE e mancha com azul de Coomassie (Figura 3B) ou SYPRO mancha de proteína para visualização.

Comentário: A proteína de interesse pode também ser detectado throughout o procedimento de purificação utilizando anticorpo anti-GST e anti-Seus anticorpos (figura 3C).

8. Armazenamento da Proteína Purificada

1. Dializar a proteína purificada contra um tampão de armazenamento adequado (por exemplo, 20 mM de Tris-Acetato, pH 8,0, KAc 200 mM, Glicerol a 10%, EDTA 1 mM, DTT 0,5 mM) a 4 ° C. É importante verificar a precipitação de proteína purificada durante a diálise. Nós normalmente dialisar 2x durante 1 hora a 4 ° C, sob agitação de rotação.
2. Fazer pequenas aliquotas de proteína purificada (10-20 mL) e congelam-se em gelo seco durante 30 min. Armazenar as alíquotas a -80 ° C e evitar muitos ciclos de congelamento / descongelamento.

Resultados

A fim de ilustrar a eficácia da GST-His protocolo de purificação, que purificado Rec14, um S. pombe proteína de 32,9 kDa. O Rec14 cDNA foi clonada no nosso vector pFastBac1 modificado permitindo a adição de GST-e Seus-tags no N-e C-terminais, respectivamente, (Figura 1A). Baculovírus recombinantes foram então preparados e utilizados para infectar células SF9 infectadas para a expressão da proteína. Os lisados ​​celulares solúveis foram incubados com contas de GST e proteínas li...

Discussão

A GST-His protocolo de purificação aqui apresentada é adequada para a purificação de uma ampla gama de tamanhos de proteínas recombinantes: Foram purificados com sucesso Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), e um alto teor de proteína de peso molecular de instável Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) ^6,9. Além disso, as proteínas purificadas com este protocolo foram bioquimicamente ativo ^6. O sucesso deste método depende unicamente da expressão, solubil...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			REAGENTS
E.Coli DH10Bac (competent)	Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Invitrogen
Maxi Prep Kit	Qiagen	12163	Solution I and II
Ultra Pure Bluo-Gal	Gibco (Life)	15519028
IPTG	Gibco (Life)	15529019
Sf9 infected cells	ATCC	CRL-1711
PreScission enzyme	GE Healthcare	27084301
Grace's infected medium supplemented	Gibco (Life)	11605-094
Fetal Bovine Serum characterized	Hyclone	SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin)	Gibco (Life)	15070-063
Glutathione Sepharose resin	GE bioscience	17075605
Protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Talon resin	Clontech	635504
Imidazole	BioShop	288324
Gentamicin	Gibco (Life)	15710064
Polyclonal GST-antibody	Production in house
Monoclonal 6X-His-antibody	Clontech	631212
			EQUIPMENT
Dounce homogenizer (tight)	Wheaton	357546
Sonicator (Fisher dismembrator)	Fisher	Model 150
Dialysis bag (50 mm)	Fisher Scientific	2115217