TPS-Sa purification: A deux pas d'affinité Protocole Purification Cédant longs protéines purifiées

Résumé

Dans le présent protocole, nous démontrons une méthode de purification de protéine hautement efficace et rentable à petite échelle, qui permet la purification de protéines recombinantes en combinant de manière unique un TPS-marqueur clivable et une petite étiquette His.

Résumé

Dosages clés en enzymologie pour la caractérisation biochimique des protéines in vitro requièrent des concentrations élevées de la protéine purifiée d'intérêt. protocoles de purification de protéines devraient combiner l'efficacité, la simplicité et l'efficacité des coûts ^1. Ici, nous décrivons la TPS-Sa méthode comme un nouveau système de purification d'affinité à petite échelle de protéines recombinantes, basée sur une marque N-terminal glutathion Sepharose (TPS) ^2,3 et une étiquette de 10xHis C-terminal ^4, qui sont tous deux fusionné pour la protéine d'intérêt. Cette dernière construction est utilisée pour générer des baculovirus, par infection de cellules Sf9 infectées pour l'expression des protéines ^5. TPS est un peu long tag (29 kDa) qui sert à assurer l'efficacité de la purification. Toutefois, il pourrait influencer les propriétés physiologiques de la protéine. Par conséquent, il est par la suite éliminé par clivage de la protéine en utilisant l'enzyme PreScission ^6. Afin d'assurer une pureté maximale et d'éliminer la TPS clivé, nousd'ajouter une deuxième étape de purification par affinité sur la base de la relativement faible His-Tag. Surtout, notre technique est basée sur deux étiquettes différentes flanquant les deux extrémités de la protéine, qui est un outil efficace pour éliminer les protéines dégradées et, par conséquent, enrichit protéines pleine longueur. La méthode présentée ici ne nécessite pas une configuration instrumentale coûteux, comme FPLC. En outre, nous avons intégré _MgCl2 et lavages ATP pour enlever les impuretés chaleur de protéines de choc et de traitement à la nucléase de supprimer les acides nucléiques contaminants. En résumé, la combinaison de deux étiquettes différentes flanquant la N-et C-terminal et la capacité de cliver une des balises, garantit la récupération d'une protéine hautement purifiée et sur toute la longueur d'intérêt.

Introduction

La purification de protéines recombinantes est crucial de répondre aux questions fondamentales de la biochimie. Des moyens classiques de purification des protéines, comme la Chromatographie d'échange d'ions et une Chromatographie d'exclusion de taille dépendent des propriétés physiques de la protéine cible, tels que son point isoélectrique et la charge ou de la taille, respectivement. Ces dernières caractéristiques de protéine sont partagées par une variété de protéines, ce qui augmente considérablement le risque de contamination de protéines dans des stratégies de purification de protéines classiques. Ce problème peut être contourné par l'utilisation de plusieurs colonnes de purification, ce qui prend du temps. Dans le même temps, ces derniers exigent des méthodes de chromatographie montage expérimental coûteux. Affinity-tag purification augmente fortement cible spécificité, comme dans la plupart des cas, le tag sera unique à la protéine d'intérêt. Dans des études récentes, la purification de drapeau ou HA-affinité a été largement utilisé.

Contrairement à rec existanteprotocoles de purification de protéines ombinant dans les balises simples sont utilisés, nous avons établi la combinaison unique de deux balises. Notre procédé implique la fusion d'une GST-tag à l'extrémité N-terminale et une étiquette His à l'extrémité C-terminale de la protéine d'intérêt, pour un rapport optimal entre la quantité et la pureté de la protéine souhaitée. La TPS est une longue étiquette (29 kDa), qui est très efficace pour la purification de glutathion billes de Sepharose. En outre, en utilisant la TPS garantit coût-efficacité de notre méthode ^1. La possibilité de cliver la GST avec l'enzyme PreScission (avec la séquence de reconnaissance LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, soit un ajout de seulement deux acides aminés) présente de nombreux avantages, par exemple, cette stratégie permet d'éviter les altérations des fonctions des protéines physiologiques dus à encombrement allostérique. La petite étiquette His fusionnés à l'autre extrémité sert de protéine dans une seconde étape de purification pour augmenter la pureté de la protéine par lavage hors de la TPS clivé, ainsi que les protéines dégradées et les autres contaminants. En outre, le protocole ne nécessite pas d'étape de dialyse lors du passage de la TPS à la colonne de l'étape de purification His-(résine TALON). Contaminants communs dans ces procédés de purification sont Heat Shock Proteins (HSP). L'ajout d'une étape d'incubation avec du MgCl ₂ et de l'ATP permet l'élimination de ces contaminants (Figure 1).

Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) et chromatographie liquide haute performance (HPLC) sont des techniques courantes qui dépendent de l'instrumentation coûteuse à produire un rendement élevé de la protéine purifiée d'intérêt. Le protocole de purification en discontinu nous présentons ici, en revanche, est manuel et ne nécessite pas une installation coûteuse instrumental. Un rendement élevé de protéines peut être atteint par l'intensification de la protocole. Dans le même temps, avec le protocole de purification en discontinu, le volume d'élution peut être ajusté afin d'augmenter la concentration en protéine, qui n'est pas donné par FPLC ou HPLC.

ntent "> En outre, avec la TPS-Son protocole de purification de lots, des protéines avec une gamme de taille de ~ 10-300 kDa peuvent être purifiés. Un des plus grands avantages est donnée par le fait que l'on peut purifier plusieurs protéines en même temps , par exemple, à la fois de type sauvage et de sa protéine mutante. Le succès du protocole présenté dépend uniquement du niveau d'expression et la solubilité de la protéine d'intérêt.

Protocole

Une. Production de baculovirus recombinant

Les baculovirus sont générés en utilisant le système d'expression Bac-to-Bac Baculovirus d'Invitrogen principalement en conformité avec le protocole du fabricant avec seulement de légères modifications:

1. Un vecteur pFastBac1 modifié (Gibco, la vie) a été créé contenant la TPS et ses balises (Figure 2). Le site clonage multiple (MCS) d'un animal-52b (+) vecteur (Novagen), contenant un 10xHis-étiquette, a été inséré dans le MCS d'un vecteur pFastBac1 pour générer pFastBac1-Strep-10xHis. La séquence de MCS pET-52b (+) a été amplifié par PCR entre les sites de restriction XbaI et BLPI, en ajoutant un site de restriction BglII à l'extrémité 5 'et un site de restriction HindIII à l'extrémité 3'. Le produit de PCR a ensuite été clone entre les sites BamHI et HindIII de pFastBac1 de restriction, en utilisant la compatibilité de BamHI et BglII séquences de restriction. Etant donné que l'objectif était de produire un pFastBac1 permettant l'expression d'protéine recombinante avec streptavidine et 10xHis-tags, le site de restriction BamHI de l'animal-52b (+) séquence MCS n'a pas été utilisé. En outre, le site de restriction XbaI n'a pas été utilisé pour éviter la redondance des sites de restriction qui se produisent entre les sites déjà dans le SCM de pFastBac1 et les insérer avec le MCS de pET-52b (+). La séquence codante de la TPS avec le site PreScission protéase reconnaissance (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) a ensuite été inséré dans pFastBac1-Strep-10xHis. La séquence d'ADNc de GST pGEX-6P-2 (GE Healthcare) a été amplifié par PCR avec des amorces contenant des sites de restriction Ncol et Kpnl aux extrémités 5 'et 3' des extrémités, respectivement. Le site Ncol permet l'ajout d'un codon d'initiation, mais aussi une alanine à la GST. Le produit de PCR a ensuite été clone dans pFastBac1-Strep-10xHis entre les sites de restriction Ncol et Kpnl, ce qui entraîne la suppression de la streptavidine-tag. Le nouveau vecteur de fusion ainsi obtenu a été nommé pFastBac1-TPS-10xHis.
2. Cloner le ADNc codant pour la protein d'intérêt dans le vecteur pFastBac-TPS-10xHis entre le TPS (N-terminal) et l'His-tag (C-terminal). Faire attention à éliminer le codon d'arrêt de l'ADNc à permettre la fusion avec le His-tag C-terminal.
3. Transformer E. coli avec le pFastBac DH10Bac recombinant (obtenu à l'étape 1.2) pour générer le bacmide. Permettre aux colonies de se développer pendant une nuit à 37 ° C et plusieurs heures à 30 ° C sur des plaques de sélection contenant Bluo-gal et IPTG (10 ng / ml de tetracycline, 50 pg / ml de kanamycine, 7 ng / ml de gentamycine, 100 ug / ml de Bluo- Gal, 40 ug / ml d'IPTG).
4. Choisissez et restreak 2 colonies blanches (de l'étape 1.3) sur des plaques de sélection pour confirmer le phénotype blanc.
5. Inoculer 2 ml de LB contenant 10 ug / ml de tetracycline, 50 pg / ml de kanamycine, 10 pg / ml de gentamycine avec les deux colonies blanches de l'étape 1.4 et de les laisser croître pendant une nuit sous agitation (250 rpm) à 37 ° C.
6. Afin de purifier l'ADN de bacmide, un culot de bactéries à partir de l'étape 1.5,remettre en suspension les cellules dans 300 ul de solution I et ajouter 300 ul de solution II (kit Maxiprep de Qiagen). Incuber pendant 5 min à température ambiante, ajouter 300 ul de 3 M de KOAc pH 5,5 et incubation pendant 10 min sur de la glace. Centrifuger les échantillons à 4 ° C, la vitesse maximale pendant 10 minutes. Ajouter 800 ul d'isopropanol pour les surnageants et incuber pendant 10 min sur la glace. Centrifuger les échantillons pendant 15 min à 4 ° C et on lave le culot avec 500 ul d'éthanol à 70%. Laissez le culot sec et remettre en suspension dans des conditions stériles dans 40 pi de Tris-EDTA pH 8,0. L'ADN de bacmide doit être conservé à 4 ° C.
7. Générer des baculovirus comme décrit dans le protocole du fabricant. Baculovirus peuvent être conservés à 4 ° C à l'abri de la lumière.

2. Recombinant Protein Expression

1. Afin de choisir le baculovirus plus efficace pour la purification et de surveiller ce temps le pic d'expression de la protéine est atteinte, effectuer une mini-infection essai uns suit: Infect 2 x 10 ⁷ de Sf9 infectées en culture à 27 ° C dans les médias de Grace (complété avec 10% de FBS et 1% P / S) avec 133 pi (1/150) de baculovirus. Recueillir des aliquotes de 1,5 ml à 0, 24, 48, et 72 heures après l'infection. Sédimenter les cellules et d'analyser le niveau de la protéine d'intérêt par Western blot en utilisant des anticorps anti-tag expression.
2. Utilisez le baculovirus plus efficace de l'étape 2.1 pour infecter un spinner contenant 1,0 x 10 ⁶ cellules Sf9 par ml dans 500 ml de milieu avec un ratio de 1/150 entre le virus et les médias. Laissez les cellules infectées se développent en suspension à 27 ° C et récolter les cellules où l'expression de la protéine maximale (déterminée à l'étape 2.1 ci-dessus) est atteint. Culot cellulaire peuvent être stockées à -80 ° C jusqu'à son utilisation ultérieure.

3. Préparation de Soluble Cell Lysate

Toutes les étapes d'incubation ci-dessous sont effectuées à 4 ° C sous rotation doux.

1. Lyse Scellules F9 exprimant votre protéine d'intérêt à ~ 20 ml de TPS tampon de liaison (NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,05% de Triton-X-100, 1 mM de DTT dans PBS1X pour une concentration finale de NaCl de 250 mM, et de l'inhibiteur de la protéase cocktail (Roche). dans un bain d'eau glacée, la solution 20x Dounce avec un homogénéisateur Dounce, sonication 3 x 30 secondes chacun (de sortie) de 70%, et encore une fois de Dounce 20x.
2. (Optionnel). Incuber le lysat cellulaire totale avec 1 mM de _MgCl2 et benzonase nuclease ⁷ (2,5 U / ml) pendant 30 min à 4 ° C pour éliminer l'ADN de l'ARN ou de contamination.
3. Centrifuger à 18 000 tours par minute pendant 30 min à 4 ° C. Gardez le surnageant.
4. (Optionnel). Centrifuger le surnageant à nouveau pendant 30 min à 18 000 rpm à 4 ° C pour obtenir un lysat soluble claire. Passez le surnageant à travers un filtre de 0,2 ou 0,45 um pour éviter le colmatage.

4. Liaison de la protéine sur Perles TPS

1. Incuber le lysat cellulaire soluble avec 1 ml de billes de GST (préalablement lavée deux fois avec de l'10 ml de tampon TPS) de liaison pendant 1 h à 4 ° C sous une légère rotation.

Commentaire: Le temps d'incubation doit être optimisée en fonction de la stabilité de la protéine et de l'efficacité de liaison.

2. Tour rapide à 700 rpm et enlever le surnageant contenant les protéines non liées (ce peuvent être conservés pour analyse ultérieure). Laver les protéines de la TPS lié (figure 3B, piste 1) avec le tampon de lavage de la TPS (TPS tampon de liaison avec 350 mM de NaCl final).
3. Répétez l'étape 4.2 2x. Au dernier lavage, enlever autant de surnageant que possible.
4. Incuber les billes avec 5 mM d'ATP et 15 mM de _MgCl2 (10 ml dans un tampon de liaison TPS) pendant 1 h à 4 ° C pour éviter la liaison non spécifique des protéines de choc thermique ^8. Laver les billes trois fois avec du tampon de lavage de la TPS.

5. PreScission clivage de la TPS

1. Centrifuger les perles de la TPS, éliminer le surnageant et laver les billes de la TPS avec P5 buffer (50 mM, pH 7,0 NaHPO _4, 500 mM de NaCl, 10% de glycerol, 0,05% de Triton-X-100, 5 mM d'imidazole).
2. Incuber les TPS-perles avec PreScission enzyme dans un tampon P5 de 3 heures à une nuit à 4 ° C. (Diviser les perles de la TPS en fractions de 100 ul et ajouter 4-8 unités (2-4 pi) d'enzyme dilué dans 100 pi de tampon P5).

Commentaire: Le temps d'incubation de l'étape de PreScission doit être optimisée en fonction de la masse moléculaire ainsi que la stabilité de la protéine. Si la dégradation est observée, ce temps d'incubation peut être réduite à un minimum de 2 heures au lieu d'une nuit.

3. Rotation rapide et recueillir le surnageant. Répétez cette étape deux fois après addition de 100 pi de P5 tampon pour les perles et mutualiser toutes les fractions (figure 3B, piste 2).

Commentaire: Les perles restantes peuvent être utilisées pour l'analyse de l'efficacité de clivage (figure 3B , piste 3). Habituellement, 70 à 80% de la protéine est clivée.

6. Protéine de liaison à TALON Métal Résine Affinity

1. Diviser l'élution à partir d'au-dessus dans 3 fractions de 1 ml et incuber chacun avec 100 billes sèches Talon de résine d'affinité métallique pl (prélavées deux fois avec du tampon P5) pendant 1 heure sous rotation.

Commentaire: La division de la élution en plusieurs fractions augmente de liaison / lavages efficacité.

2. Laver la résine 5 min avec du tampon P30 (tampon P5 avec une concentration finale de 30 mM imidazole).
3. Répétez l'étape 6.2 2x et mutualiser les perles dans un seul tube. Avant le dernier lavage, enlever autant de surnageant que possible.

Commentaire: Ceci correspond à la TALON lié échantillon (figure 3B, piste 4).

7. L'élution de la protéine purifiée

1. Incuber la résine TALON lié aux protéines pendant 5 min sous rotation avec P500 un tampon (tampon de P5 avec une concentration finale de 500 mM d'imidazole). Utiliser un ratio entre le tampon et perles de 1:1 v / v (Par exemple, si vous aviez pris 200 ul de billes sèches, vous devrez ajouter 200 ul de P500). Répétez cette étape deux fois et garder chaque fraction éluée séparément (nommé élution 1 (E1), élution 2 (E2) et élution 3 (E3); la figure 3B, pistes 5-7).

Commentaire: Les perles restantes peuvent être utilisées pour l'analyse de l'efficacité d'élution (figure 3B, piste 8). Typiquement, 60 à 80% de la protéine est éluée au total.

2. Analyser la quantité et la qualité de votre protéine purifiée en chargeant environ 20-40 ul de chaque fraction avec une concentration standard BSA sur un SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie (figure 3B) ou SYPRO protéine tache pour la visualisation.

Commentaire: La protéine d'intérêt peut également être détectée throughout la procédure de purification utilisant des anticorps anti-GST et ses anti-anticorps (Figure 3C).

8. Le stockage de la protéine purifiée

1. Dialyser la protéine purifiée contre un tampon de stockage approprié (par exemple, 20 mM de Tris acétate pH 8,0, KAc 200 mM, glycérol 10%, EDTA 1 mM, DTT 0,5 mM) à 4 ° C. Il est important de vérifier la précipitation de la protéine purifiée au cours de la dialyse. Nous dialyser habituellement 2x pendant 1 h à 4 ° C sous rotation de l'agitation.
2. Faire de petites fractions de la protéine purifiée (10-20 pi) et geler sur glace sèche pendant 30 min. Entreposer les aliquotes à -80 ° C et éviter de nombreuses dégel / cycles de congélation.

Résultats

Afin d'illustrer l'efficacité de la GST-His protocole de purification, nous avons purifié Rec14, un S. protéine de 32,9 kDa pombe. Le Rec14 ADNc a été cloné dans notre vecteur pFastBac1 modifiée permettant l'ajout de la TPS et-ses-tags à la N-et C-terminales, respectivement (figure 1A). Baculovirus recombinants ont ensuite été préparés et utilisés pour infecter des cellules SF9 infectées pour l'expression de la protéine. Les lysats cellulaires solubles on...

Discussion

Le-His TPS protocole de purification présentée ici est approprié pour la purification d'une large gamme de tailles et de protéines recombinantes: Nous avons purifié avec succès Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), et une protéine de haut poids moléculaire instable de Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) ^6,9. En outre, les protéines purifiées avec ce protocole étaient biochimiquement active ^6. Le succès de ce procédé dépend uniquement de l'ex...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
E.Coli DH10Bac (competent)	Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Invitrogen
Maxi Prep Kit	Qiagen	12163	Solution I and II
Ultra Pure Bluo-Gal	Gibco (Life)	15519028
IPTG	Gibco (Life)	15529019
Sf9 infected cells	ATCC	CRL-1711
PreScission enzyme	GE Healthcare	27084301
Grace's infected medium supplemented	Gibco (Life)	11605-094
Fetal Bovine Serum characterized	Hyclone	SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin)	Gibco (Life)	15070-063
Glutathione Sepharose resin	GE bioscience	17075605
Protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Talon resin	Clontech	635504
Imidazole	BioShop	288324
Gentamicin	Gibco (Life)	15710064
Polyclonal GST-antibody	Production in house
Monoclonal 6X-His-antibody	Clontech	631212
EQUIPMENT
Dounce homogenizer (tight)	Wheaton	357546
Sonicator (Fisher dismembrator)	Fisher	Model 150
Dialysis bag (50 mm)	Fisher Scientific	2115217