GST-His-Reinigung: Ein Zwei-Schritt-Affinitätsreinigung Protokoll Nachgeben in voller Länge Gereinigte Proteine

Zusammenfassung

In dem vorliegenden Protokoll, zeigen wir eine hocheffiziente und kostengünstige kleine Proteinreinigungsverfahren, die die Reinigung von rekombinanten Proteinen ermöglicht dank einer einzigartigen Kombination eine spaltbare GST-Tag und einen kleinen His-Tag.

Zusammenfassung

Schlüssel Assays in Enzymology für die biochemische Charakterisierung von Proteinen in vitro erfordern hohe Konzentrationen des gereinigten Proteins von Interesse. Proteinreinigung Protokolle sollten Effizienz, Einfachheit und Kosteneffektivität ¹ kombinieren. Hier beschreiben wir die GST-His Verfahren nach einem neuen kleinen Affinitätsreinigungssystem für rekombinante Proteine, basierend auf einem N-terminalen Glutathion-Sepharose-Tag (GST) ^2,3 und ein C-terminales 10xHis-Tag ^4, der sowohl verschmolzen an das Protein von Interesse. Das letztere Konstrukt wird verwendet, um Baculoviren zu erzeugen, zur Infektion von Sf9-infizierten Zellen für die Proteinexpression ^5. GST ist ein ziemlich langer Tag (29 kDa), die Reinigungsleistung zu gewährleisten dient. Allerdings könnte es physiologischen Eigenschaften des Proteins beeinflussen. Daher wird in der Folge aus dem Protein unter Verwendung des Enzyms PreScission ⁶ gespalten. Um maximale Reinheit zu gewährleisten und die gespaltenen GST entfernen, wirfügte eine zweite Affinitätsreinigungsschritt auf der Basis der vergleichsweise kleinen His-Tag. Wichtig ist, dass unser Verfahren auf zwei verschiedene Tags flankieren die beiden Enden des Proteins, das ein leistungsfähiges Werkzeug, um abgebaute Proteine ​​zu entfernen, und daher ist basiert, reichert Proteine ​​in voller Länge. Das hier vorgestellte Verfahren erfordert nicht eine teure instrumental Einrichtung, wie FPLC. Darüber hinaus haben wir MgCl ₂ und ATP wäscht integriert, um Hitzeschockprotein Verunreinigungen und Nukleasebehandlung abzuschaffen kontaminierenden Nukleinsäuren zu entfernen. Zusammenfassend ist die Kombination von zwei verschiedenen Variablen flankieren die N-und C-terminalen und die Fähigkeit zur Abspaltung eines der Tags, garantiert die Rückgewinnung eines hochgereinigten und Volllängen-Protein von Interesse.

Einleitung

Die Reinigung von rekombinanten Proteinen ist entscheidend, um grundlegende Fragen in der Biochemie adressieren. Herkömmliche Wege zur Proteinreinigung, wie Ionenaustausch-Chromatographie und Größenausschluss-Chromatographie verlassen sich auf die physikalischen Eigenschaften des Zielproteins wie seinem isoelektrischen Punkt und Ladung oder Grße sind. Letztere Proteineigenschaften werden durch eine Vielzahl von Proteinen, die wesentlich die Wahrscheinlichkeit von verunreinigenden Proteinen in herkömmlichen Proteinreinigungsstrategien erhöht geteilt. Dieses Problem kann mit der Verwendung von mehreren Reinigungssäulen, die zeitaufwendig ist, umgangen werden. Zur gleichen Zeit werden die letzteren Chromatographie-Verfahren erfordern teure Versuchsaufbau. Affinitäts-Tag-Reinigung stark erhöht Zielspezifität, wie in den meisten Fällen der Tag einzigartig für das Protein von Interesse sein. In neueren Studien wurde Flag-oder HA-Affinitätsreinigung weit verbreitet.

Im Gegensatz zu bestehenden recombinant Proteinreinigungsprotokolle, in denen einzelne Tags verwendet werden, haben wir die einzigartige Kombination von zwei Tags. Unser Verfahren umfaßt die Fusion eines GST-Tag am N-Terminus und ein His-tag am C-Terminus des Proteins von Interesse, für ein optimales Verhältnis zwischen der Menge und Reinheit des gewünschten Proteins. Die GST ist ein langer Tag (29 kDa), die hocheffiziente zur Reinigung an Glutathion-Sepharose-Kügelchen ist. Darüber hinaus unter Verwendung von GST garantiert Wirtschaftlichkeit unserer Methode ^1. Die Möglichkeit, mit dem PreScission Enzym (mit Erkennungssequenz LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, was die Zugabe von nur zwei Aminosäuren) Abspaltung der GST hat viele Vorteile, zum Beispiel, vermeidet diese Strategie Veränderungen der physiologischen Proteinfunktionen durch allosterische Hindernis. Die kleine His-Tag auf den anderen Protein fusioniert Extremität dient in einem zweiten Reinigungsschritt zur Proteinreinheit durch Abwaschen des gespaltenen GST, als auch abgebaut Proteine ​​und andere erhöhen Verunreinigungen. Zusätzlich kann das Protokoll nicht eine Dialyseschritt, wenn von dem GST an den His-Reinigungsschritt Säule (TALON Harz) erforderlich. Gemeinsame Verunreinigungen in solchen Reinigungsverfahren sind Hitzeschockproteine ​​(HSP). Die Zugabe von einem Inkubationsschritt mit MgCl ₂ und ATP ermöglicht die Entfernung dieser Verunreinigungen (Abbildung 1).

Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) und High Performance Liquid Chromatography (HPLC) sind übliche Techniken, die auf teure Geräte abhängen hohe Ausbeute des gereinigten Proteins von Interesse zu erzeugen. Die Batch-Reinigungsprotokoll wir hier präsentieren, im Gegensatz dazu ist manuell und nicht eine teure Instrumental Setup erfordern. Eine hohe Ausbeute an Protein durch Aufstockung des Protokolls erreicht werden. Zur gleichen Zeit, mit der Chargenreinigungsprotokoll, das Elutionsvolumen kann, um die Proteinkonzentration, die nicht mit FPLC oder HPLC gegeben erweitern eingestellt werden.

ntent "> Auch mit der Batch-GST-His Reinigungsprotokoll, Proteine ​​mit einem Größenbereich von ~ 10-300 kDa gereinigt werden. Einer der größten Vorteile ist durch die Tatsache gegeben, dass man mehrere Proteine ​​gleichzeitig zu reinigen beispielsweise sowohl ein Wildtyp und ihrer Mutanten-Protein. Der Erfolg der dargebotenen Protokoll hängt ausschließlich vom Expressionsniveau und die Löslichkeit des Proteins von Interesse.

Protokoll

1. Herstellung von rekombinantem Baculovirus

Baculoviren werden unter Verwendung des Bac-to-Bac Baculovirus-Expressionssystem von Invitrogen hauptsächlich in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Herstellers mit nur geringen Modifikationen erzeugt:

1. Eine modifizierte pFastBac1 Vektor (Gibco, Leben) wurde mit der GST-und His-Tags (Abbildung 2) erstellt. Die Multiklonierungsstelle (MCS) von einem pET-52b (+)-Vektor (Novagen) und enthält einen 10xHis-Tag, wurde in die MCS eines pFastBac1 Vektor eingesetzt, um pFastBac1-Strep-10xHis generieren. Die pET-52b (+) MCS-Sequenz wurde PCR zwischen den XbaI und BlpI Restriktionsstellen verstärkt, indem eine BglII-Restriktionsstelle am 5'-Ende und eine HindIII-Schnittstelle am 3 'Ende. Das PCR-Produkt wurde dann zwischen BamHI und HindIII-Restriktionsstelle von pFastBac1 kloniert, mit der Kompatibilität der BamHI-und BglII-Restriktionssequenzen. Da das Ziel war, eine pFastBac1, die die Expression erzeugenrekombinante Protein mit Streptavidin-und 10xHis-Tags, die BamHI-Restriktionsstelle des pET-52b (+) MCS-Sequenz wurde nicht verwendet. Auch wurde die XbaI-Restriktionsstelle nicht verwendet werden, um die Redundanz von Restriktionsstellen zwischen den Standorten bereits in der MCS von pFastBac1 und diese mit der MCS von pET-52b eingesetzt (+) auftretenden vermeiden. Die GST kodierende Sequenz mit der PreScission Protease-Erkennungsstelle (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) wurde dann in pFastBac1-Strep-10xHis eingefügt. Die GST-cDNA-Sequenz von pGEX-6P-2 (GE Healthcare) wurde PCR amplifiziert mit Primern, welche NcoI und KpnI-Restriktionsstellen an den 5'-und 3'-Enden auf. Die NcoI-Stelle ermöglicht das Hinzufügen eines Start-Codon, sondern auch ein Alanin an der GST. Das PCR-Produkt wurde anschließend zwischen die NcoI und KpnI-Restriktionsstellen in pFastBac1-Strep-10xHis kloniert, was zu dem Löschen des Streptavidin-tag. Die so erhaltene neue Fusion Vektor wurde mit pFastBac1-GST-10xHis.
2. Klonen der cDNA-Kodierung für die protein von Interesse in das pFastBac-GST-10xHis Vektor zwischen dem GST (N-terminal) und dem His-Tag (C-terminal). Seien Sie vorsichtig, um die cDNA-Stop-Codon entfernen, um die Fusion mit der C-terminalen His-Tag zu ermöglichen.
3. Trans E. coli DH10Bac mit dem rekombinanten pFastBac (im Schritt 1.2) erhaltenen, die Bacmid erzeugen. Ermöglichen Kolonien über Nacht bei 37 ° C und mehrere Stunden bei 30 º C auf Platten, die Auswahl Bluo-gal und IPTG (10 ug / ml Tetracyclin, 50 &mgr; g / ml Kanamycin, 7 &mgr; g / ml Gentamycin, 100 &mgr; g / ml Bluo-wachsen Gal, 40 ug / ml IPTG).
4. Pick und restreak 2 weiße Kolonien (aus Schritt 1.3) auf Selektionsplatten, um den weißen Phänotyp zu bestätigen.
5. Beimpfen von 2 ml LB, enthaltend 10 ug / ml Tetracyclin, 50 &mgr; g / ml Kanamycin, 10 ug / ml Gentamycin mit den beiden weißen Kolonien aus Schritt 1.4 und ließ sie über Nacht unter Schütteln bei 37 ° C wachsen (250 rpm)
6. Um die Bacmid-DNA/CellFECTIN-Gemisch reinigen, zu pelletieren, die Bakterien von Schritt 1.5,Resuspendieren der Zellen in 300 ul Lösung I und 300 ul Lösung II (Maxiprep Kit von Qiagen). Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur, fügen Sie 300 ul 3 M KOAc pH 5,5 und Inkubation für 10 min auf Eis. Zentrifugieren der Proben bei 4 ° C, maximale Geschwindigkeit für 10 min. In 800 ul von Isopropanol zu den Überständen und Inkubation für 10 min auf Eis. Zentrifugieren der Proben für 15 min bei 4 ° C und Waschen des Pellets mit 500 ul 70% Ethanol. Lassen Sie das Pellet zu resuspendieren es trocken und unter sterilen Bedingungen in 40 &mgr; l Tris-EDTA pH 8,0. Die Bacmid-DNA bei 4 ° C gelagert werden
7. Generieren Baculoviren wie in dem Protokoll des Herstellers beschrieben. Baculoviren bei 4 ° C lichtgeschützt gelagert werden.

2. Rekombinante Proteinexpression

1. Um die effizienteste Baculovirus zur Reinigung zu wählen und zu überwachen, wann der Spitzenwert der Proteinexpression zu erreichen, so wird ein Mini-Infektionstest eins folgt: Infect 2 × 10 ⁷ Sf9-infizierten Zellen kultiviert bei 27 ° C in Grace-Medium (mit 10% FBS und 1% P / S ergänzt) mit 133 ul (1/150) des Baculovirus. Sammeln Aliquots von 1,5 ml bei 0, 24, 48 und 72 h nach der Infektion. Pelletierung der Zellen und Analyse der Expressionsspiegel des Proteins von Interesse durch Western-Blotting unter Verwendung von anti-Tag-Antikörper.
2. Verwenden die effizienteste Baculovirus von Schritt 2.1, eine Zentrifuge, die 1,0 × 10 ⁶ Sf9-Zellen pro ml in 500 ml Medium in einem Verhältnis von 1/150 zwischen Virus und Medium zu infizieren. Lassen die infizierten Zellen wachsen in Suspension bei 27 ° C und Ernte der Zellen, wenn die maximale Protein-Expression (wie im Schritt 2.1 bestimmt wird) erreicht ist. Pelletierten Zellen können bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.

3. Herstellung von löslichem Zelllysat

Alle folgenden Inkubationsschritte werden bei 4 ° C unter leichten Drehgeführt.

1. Lyse SF9 Zellen, die Protein von Interesse exprimieren, in ~ 20 ml GST-Bindungspuffer (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% Triton-X-100, 1 mM DTT in PBS1X für eine Endkonzentration von 250 mM NaCl und Proteaseinhibitor Cocktail (Roche). In einem Eis-Wasser-Bad, Dounce der Lösung 20x mit einem Dounce Homogenisator beschallen jeweils 3x 30 Sekunden (70% Leistung) und DOUNCE wieder 20x.
2. (Optional). Inkubieren der Gesamt Zelllysats mit 1 mM MgCl ₂ und ⁷ Nuklease Benzonase (2,5 U / ml) für 30 min bei 4 ° C auf DNA-oder RNA-Kontamination zu entfernen.
3. Zentrifuge bei 18.000 rpm für 30 min bei 4 ° C. Halten Sie den Überstand.
4. (Optional). Zentrifuge der Überstand erneut für 30 min bei 18.000 rpm bei 4 ° C, um eine klare lösliche Lysat zu erhalten. Führen Sie den Überstand durch ein 0,2 oder 0,45 um Filter, um ein Verstopfen zu vermeiden.

4. Die Bindung von Protein an GST Perlen

1. Inkubieren des löslichen Zell-Lysat mit 1 ml GST-Kügelchen (vorgewaschen zweimal mit10 ml GST-Bindungspuffer) für 1 h bei 4 º C unter leichter Rotation.

Kommentar: Die Inkubationszeit muß nach der Stabilität des Proteins und Bindungseffizienz optimiert werden.

2. Schnell Spin bei 700 rpm und Überstand entfernen ungebundenen Proteine ​​enthält (dies kann zur weiteren Analyse aufbewahrt werden). Waschen der gebundenen Proteine ​​GST-(3B, Spur 1) mit Waschpuffer GST (GST-Bindungspuffer mit 350 mM NaCl endgültig).
3. Wiederholen Sie Schritt 4.2 2x. Bei der letzten Waschung zu entfernen, so viel Überstand wie möglich.
4. Der Kügelchen mit 5 mM ATP und 15 mM MgCl ₂ inkubieren (in 10 ml Bindungspuffer GST) für 1 h bei 4 ° C nicht-spezifische Bindung des Hitzeschock-Proteine ^​​8 zu vermeiden. Dreimal mit Waschpuffer GST Waschen der Kügelchen.

5. PreScission Spaltung des GST

1. Zentrifugieren Sie die GST-Perlen, den Überstand entfernen und waschen Sie die GST Perlen mit P5 buffer (50 mM NaHPO _4, pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% Glycerin, 0,05% Triton-X-100, 5 mM Imidazol).
2. Die GST-Kügelchen mit PreScission Enzym in Puffer inkubieren P5 von 3 h bis über Nacht bei 4 ° C. (Teile die GST-Kügelchen in Fraktionen von 100 &mgr; l hinzugefügt und 4-8 Einheiten (2-4 &mgr; l) des Enzyms in 100 ul Puffer verdünnt, P5).

Kommentar: Die Inkubationszeit der PreScission Schritt muss nach dem Molekulargewicht als auch die Stabilität des Proteins zu optimieren. Ein Abbau beobachtet, kann dieser Inkubationszeit auf ein Minimum von 2 Stunden statt über Nacht verringert werden.

3. Schnell Spin und sammeln den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei Zeitpunkten nach Zugabe von 100 ul P5 Puffer zu den Perlen und bündeln alle Fraktionen (3B, Spur 2).

Kommentar: Die restlichen Perlen können für die Analyse der Spaltungseffizienz verwendet werden (Abbildung 3B , Spur 3). Üblicherweise wird 70-80% des Proteins abgespalten.

6. Protein-Bindung an TALON Metall Affinity Resin

1. Teilen Sie die Elution von oben in 3 Fraktionen von 1 ml und Inkubation mit jeweils 100 ul Talon Metallaffinitätsharz Trockenperlen (zweimal mit Puffer P5 vorgewaschen) für 1 h unter Rotation.

Kommentar: Die Aufteilung der Elution in mehrere Fraktionen erhöht die Bindung / Wascheffizienz.

2. Mit P30-Puffer (P5 Puffer mit einer Endkonzentration von 30 mM Imidazol) Das Harz 5 min.
3. Wiederholen Sie Schritt 6,2 und 2x bündeln die Perlen in einer einzigen Röhre. Vor dem letzten Waschvorgang, zu entfernen, so viel Überstand wie möglich.

Kommentar: Dies entspricht der TALON gebunden Probe (3B, Spur 4).

7. Elution des gereinigten Proteins

1. Inkubation des Protein gebunden TALON Harz für 5 min unter Rotation mit P500 Puffer (P5 Puffer mit einer Endkonzentration von 500 mM Imidazol). Verwenden Sie ein Verhältnis zwischen Puffer und Perlen von 1:1 v / v (Zum Beispiel, wenn Sie 200 ul Trockenperlen genommen hatte, haben Sie zu 200 ul P500 hinzufügen). Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal und halten jede eluierte Fraktion separat (benannt Elution 1 (E1), Elution 2 (E2) und Elution 3 (E3), 3B, Bahnen 5-7).

Kommentar: Die restlichen Perlen können für die Analyse der Effizienz der Elution (3B, Spur 8) verwendet werden. Typischerweise wird 60-80% des Gesamtproteins in eluiert.

2. Analysieren Sie die Menge und die Qualität der gereinigten Protein durch Laden ca. 20-40 ul jeder Fraktion mit einem Standard-BSA-Konzentration auf einem SDS-PAGE und Coomassie-Blau-Färbung mit (3B) oder SYPRO Protein-Färbung für die Visualisierung.

Bemerkung: Das Protein von Interesse kann auch erkannt werden throughout des Reinigungsverfahrens unter Verwendung von Anti-GST-und Anti-His-Antikörper (Fig. 3C).

8. Lagerung des gereinigten Proteins

1. Dialyse des gereinigten Proteins gegenüber einer entsprechenden Speicherpuffer (z. B. 20 mM Tris-Acetat pH 8,0, 200 mM KAc, 10% Glycerin, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT) bei 4 ° C. Es ist wichtig, zur Ausfällung des gereinigten Proteins während der Dialyse zu überprüfen. Wir dialysieren Regel 2x für 1 h bei 4 ° C unter Rühren Rotation.
2. Machen Sie kleine Aliquots des gereinigten Proteins (10-20 ul) und frieren auf Trockeneis für 30 min. Bewahren Sie die Aliquots bei -80 ° C und vermeiden viele Tau-/ Gefrierzyklen.

Ergebnisse

Um die Effizienz des GST-His-Reinigungsprotokolls veranschaulichen, reinigten wir Rec14, einen S. pombe Protein von 32,9 kDa. Die Rec14 cDNA wurde in unserer modifizierten pFastBac1 Vektor ermöglicht die Zugaben von GST-und His-Tags an der N-und C-Termini, die jeweils (1A) kloniert. Rekombinanten Baculovirus wurden hergestellt und verwendet, um Sf9-infizierten Zellen für die Proteinexpression zu infizieren. Die löslichen Zelllysate wurden mit GST inkubiert und Perlen-gebundenen Proteine ​?...

Diskussion

Die hier vorgestellte GST-His Reinigungsprotokoll ist geeignet für die Reinigung von einer breiten Palette von Größen von rekombinanten Proteinen: Wir haben erfolgreich gereinigt Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa) und eine instabile hochmolekularen Protein von Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) ^6,9. Außerdem wurden die Proteine ​​mit diesem Protokoll gereinigt biochemisch aktiven ^6. Der Erfolg dieser Methode hängt nur von der Expression, Löslichkeit u...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
E.Coli DH10Bac (competent)	Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Invitrogen
Maxi Prep Kit	Qiagen	12163	Solution I and II
Ultra Pure Bluo-Gal	Gibco (Life)	15519028
IPTG	Gibco (Life)	15529019
Sf9 infected cells	ATCC	CRL-1711
PreScission enzyme	GE Healthcare	27084301
Grace's infected medium supplemented	Gibco (Life)	11605-094
Fetal Bovine Serum characterized	Hyclone	SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin)	Gibco (Life)	15070-063
Glutathione Sepharose resin	GE bioscience	17075605
Protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Talon resin	Clontech	635504
Imidazole	BioShop	288324
Gentamicin	Gibco (Life)	15710064
Polyclonal GST-antibody	Production in house
Monoclonal 6X-His-antibody	Clontech	631212
EQUIPMENT
Dounce homogenizer (tight)	Wheaton	357546
Sonicator (Fisher dismembrator)	Fisher	Model 150
Dialysis bag (50 mm)	Fisher Scientific	2115217