GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

요약

본 프로토콜에서는, 고유 분해 가능한 GST-태그 및 그의 작은 태그를 조합하여 재조합 단백질의 정제를 허용하는 매우 효율적이고 비용 효과적인 소량의 단백질 정제 방법을 보여준다.

초록

체외에서 단백질의 생화학 적 특성에 대한 효소 학의 핵심 분석은 그 정제 된 단백질의 높은 농도를 필요로. 단백질 정제 프로토콜은 효율, 단순성 및 비용 ^효율성을 배합 ^한 것이다. 여기에서, 우리는 N-말단 글루타티온 세 파로스 태그 (GST) ^2,3 모두 융합 C-말단 10xHis 태그 ^4를 기반으로 재조합 단백질에 대한 새로운 소규모의 친화력 정화 시스템으로 GST - 그의 방법을 설명 관심의 단백질. 후자의 구조는 단백질 발현을위한 ⁵ 인 Sf9 감염된 세포의 감염을 위해, 배큘로 바이러스를 생성하는데 사용된다. GST는 정화 효율을 보장하는 역할을 다소 긴 태그 (29 kDa의)입니다. 그러나, 단백질의 생리 학적 성질에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 후속 ^{적으로 10} PreScission ^효소를 사용하여 단백질을 분해한다. 최대 순도를 보장하고, 쪼개진 GST를 제거하기 위해 우리비교적 작은 그의 - 태그를 기반으로 두 번째 친 화성 정제 단계를 추가했습니다. 중요한 사실은, 우리의 기술이 따라서 저하 된 단백질을 제거하기위한 효과적인 도구이다 단백질의 양단 측면에 위치하고있는 두 개의 서로 다른 태그에 기초하고, 전장 단백질을 풍부. 여기에 제시된 방법은 FPLC 등 고가의 악기 설정을 필요로하지 않습니다. 또한, 우리는 열 충격 단백질 불순물과 핵산을 오염 폐지하는 핵산 분해 효소 처리를 제거하는 _{MgCl2를하고} ATP 세척을 통합. 요약하면, 플 랭킹이 다른 태그의 조합을 N-및 C-말단 및 태그 중 하나를 절단하는 기능을, 또한 고순도 및 전장 단백질의 회수를 보증한다.

서문

재조합 단백질의 정제는 생화학의 근본적인 문제를 해결하기 위해 매우 중요합니다. 이온 교환 크로마토 그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피와 같은 단백질 정제의 통상적 인 방법은 각각 같은 그것의 등전점과 충전 또는 크기와 같은 표적 단백질의 물리적 특성에 의존한다. 후자 단백질 특성은 상당히 통상적 인 단백질 정제 전략 단백질 오염의 기회를 증가 단백질의 다양성에 의해 공유된다. 이 문제는 시간 소모적이다 체류 정화 컬럼의 사용으로 피할 수있다. 동시에, 후자의 크로마토 그래피 방법은 고가의 실험 구성을 요구한다. 대부분의 경우 태그가 관심의 단백질에 고유하므로 선호도 태그 정화가 강하게 대상 특이성을 증가시킨다. 최근 연구에서, 플래그 또는 HA-친화력 정화 널리 사용되어왔다.

기존 REC 대조적하나의 태그가 사용되는 ombinant 단백질 정제 프로토콜은, 우리는이 태그의 고유 한 조합을 설립. 우리의 방법은 양 원하는 단백질의 순도 사이의 최적의 비율에 대한 관심의 단백질의 C-말단의 N-말단과 그의 태그에서 GST-태그의 융합을 포함한다. GST는 글루타티온 세 파로스 구슬 정화에 매우 효율적이다 긴 태그 (29 kDa의)입니다. 또한, GST를 사용하여 우리의 방법 ^1의 비용 효율성을 보장합니다. (두 아미노산의 첨가의 결과로 인식 서열 LeuGluValLeuPheGln / GlyPro 가진) PreScission 효소와 GST를 절단 할 수있는 가능성은 많은 장점을 가지고 예를 들어, 이러한 전략은 알로 스테 릭 장애물로 인해 생리적 단백질 기능의 변경을 방지한다. 다른 단백질 말단에 융합 작은 그의 태그는 벽개 GST를 씻어 내고,뿐만 아니라 분해 단백질 및 기타에 의해 단백질 순도를 증가시키기 위해 제 정제 공정에 제공 오염 물질. 그의 정화 단계의 열 (TALON 수지)에 GST 전환 할 때 또한 프로토콜은 투석 단계가 필요하지 않습니다. 이러한 정제 과정에서 일반 오염 물질은 열 충격 단백질 (HSP)이다. _MgCl2를 ATP와 함께 인큐베이션 단계의 첨가는 이러한 오염물을 제거 (도 1)을 허용한다.

고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC) 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)는 관심의 정제 된 단백질의 높은 수율을 생성하기 위해 고가의 장비에 의존하는 일반적인 기술이다. 우리가 여기에 존재하는 배치 정화 프로토콜은, 대조적으로, 수동이며, 고가의 악기 설정을 필요로하지 않습니다. 단백질의 높은 수율이 프로토콜을 확장하여 도달 할 수 있습니다. 동시에 일괄 정제 프로토콜, 용출 부피는 FPLC 또는 HPLC와 관련되지 않은 단백질의 농도를 향상시키기 위해 조정될 수있다.

ntent "> 또, 일괄 GST-그의 정제 프로토콜 ~ 10-300 kDa의의 크기 범위를 가진 단백질을 정제 할 수있다. 큰 장점 중 하나는 하나가 동시에 여러 단백질을 정제 할 수 있다는 사실에 의해 주어진다 예를 들어, 야생형과 돌연변이 단백질 둘. 제시된 프로토콜의 성공은 전적으로 그 단백질의 발현 수준과 용해도에 의존한다.

프로토콜

1. 재조합 배큘로 바이러스의 제조

배큘로 바이러스는 주로 단지 약간의 수정 제조자의 프로토콜에 따라 인비 트로겐의 바크 투 바크 배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 생성된다 :

1. 수정 pFastBac1 벡터 (기브, 수명은) GST와 그의 - 태그 (그림 2)를 포함 만들었습니다. PET-52B (+) 벡터 (노바 젠)의를 다중 사이트 (MCS)는 10xHis 태그를 포함, pFastBac1 - 패 혈성-10xHis를 생성하는 pFastBac1 벡터의 MCS에 삽입했다. PET-52B (+) MCS 시퀀스는 5에서 BglII에 제한 사이트 '말단과 3에서 HindIII의 제한 사이트'말단을 추가를 XbaI 및 BlpI 제한 부위 사이에 증폭 된 PCR했다. PCR 생성물을 B​​amHI 및 다음 BglII에 제한 시퀀스의 호환성을 이용하여 제한 효소 BamHI과 HindIII로 pFastBac1의 제한 부위 사이에 클로닝 하였다. 목표는 표현을 허용 pFastBac1를 생성 할 때부터스트렙 타비 딘과 10xHis - 태그 재조합 단백질, PET-52B (+)의 BamHI로 제한 사이트는 MCS 시퀀스는 사용되지 않았다. 또한, XbaI의 제한 사이트는 이미 pFastBac1의 MCS 및 PET-52B의 MCS 삽​​입이 (+)의 사이트 사이에서 발생하는 제한 사이트의 중복을 피하기 위해 사용되지 않았습니다. PreScission 단백질 분해 효소 인식 부위 (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro)와 GST 코딩 순서는 다음 pFastBac1 - 패 혈성-10xHis에 삽입했다. 유전자 pGEX-6P-1 (GE 헬스 케어)에서 GST의 cDNA 서열은 PCR 각각 5에서을 NcoI 및 KpnI으로 제한 부위를 함유하는 프라이머 '및 3'말단으로 증폭 하였다. 을 NcoI 사이트는 개시 코돈의 첨가뿐만 아니라 GST에 알라닌을 허용한다. PCR 생성물이어서 스트렙 타비 딘 - 태그의 삭제 결과를 NcoI 및 KpnI으로 제한 부위 사이 pFastBac1-Strep의-10xHis로 클로닝 하였다. 이렇게 얻어진 새로운 융합 벡터 pFastBac1-GST-10xHis 지명되었다.
2. 홍보에 대한 cDNA를 코딩을 복제GST (N-말단)과 그의 태그 (C 터미널) 사이의 pFastBac-GST-10xHis 벡터에 관심 otein. C-말단 그의 태그와의 융합을 허용하는 cDNA를 정지 코돈을 제거 할주의하십시오.
3. E.에게 변환 (단계 1.2에서 얻은) 재조합 pFastBac와 대장균 DH10Bac는 백 미드를 생성합니다. 식민지 Bluo - 여자와 IPTG (10 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린, 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신, 12 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신, 100 ㎍ / ㎖의 Bluo을 함유 선택 접시에 30 ° C에서 37 ° C 몇 시간에서 하룻밤 성장 할 수 있도록 허용 여자, 40 ㎍ / ㎖의의 IPTG).
4. 선택과 화이트 표현형을 확인하기 위해 선택 접시에 (단계 1.3에서) 2 화이트 식민지를 restreak.
5. 10 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린, 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신, 10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신 단계 1.4에서 두 개의 흰색 식민지로하고 37 ℃에서 교반하면서 밤새 (250 RPM)를 물게을 포함하는 LB 2 ㎖를 접종
6. 백 미드의 DNA를 정제하기 위해서는, 단계 1.5에서 박테리아 펠렛용액 300 μL 난에있는 세포를 재현 탁 및 솔루션 II 300 μL (퀴아 Maxiprep 키트)를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 품어 3 M KOAc이다 산도 5.5의 300 μl를 추가하고 얼음에 10 분 동안 품어. 4 ° C, 10 분 동안 최대 속도로 샘플을 원심 분리기. 상층 액에 이소프로판올 800 μl를 추가하고 얼음에 10 분 동안 품어. 4 ° C에서 15 분 동안 원심 분리하여 70 % 에탄올 500 μL로 펠렛을 씻으십시오. 펠릿 건조시켜 트리스​​ - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 8.0의 40 μL의 멸균 조건을 재현 탁. 백 미드의 DNA는 4 ℃에서 보관해야
7. 제조 업체의 프로토콜에 설명 된대로 배큘로 바이러스를 생성합니다. 배큘로 바이러스는 빛으로부터 보호 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

2. 재조합 단백질 발현

1. 정제를위한 가장 효율적인 배큘 선택할 및 단백질 발현의 피크에 도달 몇시 모니터하기 위해, 미니 감염 분석을 수행의는 다음과 같다 : 2 인 Sf9의 X 10 ⁷ 배큘로 바이러스의 133 μL (1 / 150)으로 (10 % FBS, 1 % P / S 보완) 그레이스의 미디어에있는 27 ° C에서 배양 된 세포를 감염 감염하십시오. 0, 24, 48에 1.5 ㎖를 분취를 수집하고, 72 시간 게시물 감염. 펠렛은 세포 및 안티 태그 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 그 단백질의 발현 수준을 분석한다.
2. 바이러스와 미디어 사이의 1 / 150의 비율로 미디어 500 ㎖에 ML 당 1.0 × 10 ⁶ 인 Sf9 세포를 포함하는 회 전자를 감염시키기 위해 2.1 단계에서 가장 효율적인 배큘로 바이러스를 사용합니다. 감염된 세포는 27 ° C에서 서스펜션의 성장과 최대의 단백질 발현 (위 2.1 단계에서 결정)에 도달하면 세포를 수확 할 수 있습니다. 펠렛 세포는 나중에 사용할 때까지 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.

3. 수용성 세포 용 해물의 제조

다음 배양 단계는 모두 가벼운 회전에서 4 ° C에서 수행됩니다.

1. 를 Lyse SGST 결합 완충액 (150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 0.05 % 트리톤 - X-100, 1 ㎜ 250 ㎜의 염화나트륨의 최종 농도에 대한 PBS1X의 DTT, 및 단백질 분해 효소 억제제 ~ 20 ㎖에 관심 단백질을 발현 F9 세포 칵테일 (로슈). 빙수 욕에서, 다운스 균질 기, 초음파 처리 3X 30초 각 (70 % 출력)와 용액 20X 다운스 다시 20X를 다운스.
2. (선택 사항). DNA 또는 RNA의 오염을 제거하기 위해 4 ° C에서 30 분 동안 1 mM의 MgCl2를 ₂ ⁷ 클레아 제 (2.5 U / ㎖) 벤조 전체 세포 용 해물을 품어.
3. 4 ℃에서 30 분간 18,000 rpm으로 원심 분리기 뜨는을 유지합니다.
4. (선택 사항). 원심 분리기는 상층 액을 다시 4 ° C에서 18,000 rpm으로 30 분 동안 명확한 가용 해물를 얻을 수 있습니다. 막힘을 방지하기 위해 0.2 또는 0.45 μm의 필터를 통해 뜨는을 전달합니다.

4. GST 구슬에 단백질의 결합

1. GST 비즈 1 ㎖로 용해 세포 용 해물을 품어 (로 2 회 prewashedGST의 10 ㎖의 부드러운 회전에서 4 ° C에서 1 시간 동안 버퍼)를 결합.

의견 배양 시간은 단백질의 안정성과 결합 효율에 따라 최적화 될 필요가있다.

2. 빠른 700 rpm에서 스핀과 결합되지 않은 단백질을 함유 뜨는을 제거 (이는 추가 분석을 위해 유지 될 수있다). GST 세척 버퍼 GST-결합 단백질 (그림 3B, 레인 1) 세척 (GST는 350 mM의 염화나트륨 마지막으로 버퍼를 바인딩).
3. 단계를 반복 4.2 배. 마지막 세척에서, 가능한 한 많은 뜨는을 제거합니다.
4. 열 충격 단백질 ^(8)의 비특이적 결합을 방지하기 위해 4 ° C에서 1 시간 동안 (10 ㎖ GST 바인딩 버퍼) 5 mM의 ATP, 15 mM의 _MgCl2를 가진 구슬을 품어. GST 세척 버퍼로 구슬을 세 번 씻으십시오.

5. GST의 PreScission 분열

1. GST 비즈를 원심 분리기, 뜨는을 제거하고 P5 버피와 GST 비즈를 씻어FER (50 mM의 NaHPO _4의 pH 7.0, 500 mM의 NaCl을, 10 % 글리세롤, 0.05 % 트리톤 - X-100, 5 mM의 이미 다졸).
2. 3 시간에 밤새 4 ℃에서 P5 버퍼 PreScission 효소와 GST-구슬을 품어 (100 μL의 분수 GST 비즈를 나누고 P5 버퍼 100 ㎕의 희석 효소의 4-8 단위 (2-4 μL)를 추가).

의견 PreScission 단계의 배양 시간은 분자량뿐만 아니라 단백질의 안정성에 따라 최적화 될 필요가있다. 열화가 관찰되는 경우,이 배양 시간 밤새 2 시간의 최소 대신에 감소 될 수있다.

3. 빠른 스핀과 상층 액을 수집합니다. P5의 100 μl를 추가 한 후이 단계를 두 번 반복 구슬에 버퍼 및 모든 분수 (그림 3B, 레인 2) 풀.

코멘트 : 나머지 구슬 절단 효율성의 분석을 위해 사용될 수있다 (그림 3B , 레인 3). 일반적으로, 단백질 70 ~ 80 %가 절단된다.

6. 단백질 결합 TALON 금속 친 화성 수지에

1. 1 ㎖의 3 분수에 위의 용출을 나누고 회전에서 1 시간 동안 (P5 버퍼로 2 회 prewashed) 100 ㎕의 발톱 금속 친 화성 수지 건조 구슬과 각을 품어.

코멘트 : 여러 분수 용출을 나누면 바인딩 / 세척 효율을 증가시킨다.

2. P30 버퍼 (30 mM의 이미 다졸의 최종 농도로 P5 버퍼)와 수지 5 분을 씻으십시오.
3. 단계 6.2 배를 반복하여 하나의 튜브에 비즈를 풀. 마지막 세척하기 전에 가능한 한 많은 뜨는을 제거합니다.

코멘트 :이 TALON 바인딩 샘플 (그림 3B, 4 레인)에 해당합니다.

7. 정제 된 단백질의 용출

1. P5와 회전에서 5 분의 단백질 결합 TALON 수지를 품어00 버퍼 (500 MM의 이미 다졸의 최종 농도로 P5 버퍼). 버퍼 1:1 V / V의 구슬의 비율을 사용 (당신이 건조 구슬 200 μl를 촬영 한 경우 예를 들어, 당신은 P500의 200 μl를 추가해야합니다). 이 단계를 두 번 반복하고 개별적으로 각각의 용출 분획을 유지 (, 그림 (b), 5-7 차선), 용출 1 (E1)라는 이름의 용출 2 (E2 및 용출 3 (E3)).

의견 남은 비즈 용출 효율 (도 3b, 레인 8)의 분석에 이용 될 수있다. 전형적으로, 단백질 60 ~ 80 %가 전체에 용출된다.

2. 쿠마시 블루 (그림 3B) 또는 시각화를위한 SYPRO 단백질 얼룩 SDS-PAGE와 얼룩에 표준 BSA 농도가 각 부분의 약 20 ~ 40 μl를로드하여 정제 된 단백질의 양과 질을 분석합니다.

코멘트 : 관심의 단백질은 또한 죽 검출 할 수있다항-GST 및 안티 그의 항체 (도 3C)를 이용하여 정제 절차 ughout.

8. 정제 된 단백질의 저장

1. 4 ℃에서 적절한 저장 버퍼에 대한 정제 된 단백질 (예를 들어, 20 mM 트리스 아세테이트 산도 8.0, 200 MM의 한국 공항 공사, 10 % 글리세롤, 1 mM의 EDTA, 0.5 mM의 DTT)을 Dialyze 그것은 투석 중에 정제 된 단백질의 침전을 확인하는 것이 중요합니다. 우리는 일반적으로 교반 회전에서 4 ° C에서 1 시간 동안 2 배 dialyze.
2. 정제 된 단백질 (10 ~ 20 μL)의 작은 분취 량을 확인하고 30 분 동안 드라이 아이스에 냉동. -80 ° C에서 분취를 저장하고 여러 해동 / 냉동 사이클을 피할 수 있습니다.

결과

GST-그의 정제 프로토콜의 효율을 예시하기 위해, 우리는 Rec14, S. 정제 32.9 kDa의의의 pombe 단백질. Rec14 cDNA를 각각 N-및 C-말단 (그림 1A)에서 GST - 그의 - 태그의 추가를 허용하는 우리의 수정 pFastBac1 벡터에 클로닝 하였다. 재조합 배큘로 바이러스는 다음 제조 및 단백질 발현을 위해 감염된 SF9 세포를 감염시키기 위해 사용되었다. 수용성 세포 용 해물은 GST 비즈 배양과 결합...

토론

여기에 제시된 GST - 그의 정화 프로토콜은 재조합 단백질의 크기의 넓은 범위의 정화를 위해 적당하다 : 우리는 성공적으로 리 RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), 불안정한 고 분자량의 단백질을 정제 리 슈만 편모충의 infantum : 리튬 BRCA2 (125kDa) ^6.9. 또한,이 프로토콜을 사용하여 정제 된 단백질은 ⁶ 생화학 적 활성했다. 이 방법의 성공은 전적으로 목적 단백질...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
E.Coli DH10Bac (competent)	Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Invitrogen
Maxi Prep Kit	Qiagen	12163	Solution I and II
Ultra Pure Bluo-Gal	Gibco (Life)	15519028
IPTG	Gibco (Life)	15529019
Sf9 infected cells	ATCC	CRL-1711
PreScission enzyme	GE Healthcare	27084301
Grace's infected medium supplemented	Gibco (Life)	11605-094
Fetal Bovine Serum characterized	Hyclone	SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin)	Gibco (Life)	15070-063
Glutathione Sepharose resin	GE bioscience	17075605
Protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Talon resin	Clontech	635504
Imidazole	BioShop	288324
Gentamicin	Gibco (Life)	15710064
Polyclonal GST-antibody	Production in house
Monoclonal 6X-His-antibody	Clontech	631212
EQUIPMENT
Dounce homogenizer (tight)	Wheaton	357546
Sonicator (Fisher dismembrator)	Fisher	Model 150
Dialysis bag (50 mm)	Fisher Scientific	2115217