GST-Его очистка: Двухступенчатая Affinity Очистка Протокол Уступая полноразмерных очищенных белков

Резюме

В настоящем протоколе, мы демонстрируем высокоэффективную и экономичную мелкого способа очистки белка, что позволяет очистку рекомбинантных белков однозначно объединения расщепляемую GST-тег и небольшой His-тег.

Аннотация

Основные анализы в энзимологии для биохимического характеризации белков в пробирке требуют высоких концентраций очищенного белка, представляющего интерес. Протоколы очистки белков должен сочетать в себе эффективность, простоту и эффективность затрат ^1. Здесь мы опишем GST-его метод в качестве нового малого аффинной очистки системы рекомбинантных белков, основанный на N-концевой глутатион Сефарозе Tag (GST) ^2,3 и С-концевые 10xHis метки ^4, которые оба плавленого к белку интерес. Последний конструкция используется для генерации бакуловирусов, для заражения инфицированных клеток Sf9 для экспрессии белка ^5. НДС является довольно долго тег (29 кДа), который служит для обеспечения эффективности очистки. Тем не менее, это может влиять на физиологические свойства белка. Таким образом, он впоследствии отщепляется белка с использованием фермента предразрывных ^6. Для того, чтобы обеспечить максимальную чистоту и снять расщепленный GST, мыдобавили вторую стадию очистки на основе сродства сравнительно небольшой His-Tag. Важно отметить, что наша методика основана на двух различных меток, фланкирующих два конца белка, который является эффективным средством для удаления деградированных белков и, следовательно, обогащает полноразмерные белки. Метод, представленный здесь, не требует дорогостоящего инструментального настройки, такие как FPLC. Кроме того, мы включили MgCl ₂ и АТФ вымывания белка теплового шока примесей и нуклеазы лечение отменить загрязняющих нуклеиновых кислот. Таким образом, сочетание двух разных тегов фланговые N-и С-концевой и способность расщеплять от одного из тегов, гарантирует восстановление с высокой степенью чистоты и полноразмерного белка интереса.

Введение

Очистку рекомбинантных белков имеет решающее значение для решения фундаментальных вопросов биохимии. Обычные способы очистки белка, такие как ионообменной хроматографии и гель-проникающей хроматографии полагаться на физические свойства белка-мишени, такие как его изоэлектрической точке и заряда или размера, соответственно. Последние характеристики белка являются общими для различных белков, что значительно повышает шансы на примесные белки в обычных стратегий очистки белков. Эта проблема может быть преодолена с использованием нескольких столбцов очистки, которая отнимает много времени. В то же время, последние методы хроматографии требуют дорогой экспериментальную установку. Очистка Affinity-тег сильно возрастает целевой специфичностью, как и в большинстве случаев метка будет уникальным для интересующего белка. В недавних исследованиях, Флаг-или HA-аффинной очистки широко используется.

В отличие от существующих рекombinant протоколы очистки белков, в которых используются одиночные теги, мы создали уникальную комбинацию двух тегов. Наш метод предполагает слияние с GST-тега на N-конце и His-тэга на С-конце белка интереса, для оптимального соотношения между количеством и чистотой целевого белка. GST длинный тег (29 кДа), который является высокоэффективным для очистки на гранулах сефарозы глутатиона. Кроме того, с помощью GST гарантирует экономическую эффективность нашего метода ^1. Возможность для расщепления от GST с ферментом PreScission (с последовательность узнавания LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, в результате добавления всего двух аминокислот) имеет много преимуществ, например, эта стратегия позволяет избежать изменения физиологических функций белка из-за аллостерической помех. Небольшой His-метка, слитый с другим белком конечности служит в качестве второго шага очистки увеличить чистоту белка путем смывания расщепленный GST, а также деградируют белки и другие загрязняющие вещества. Кроме того, протокол не требует стадии диализа при переключении из GST с His-стадии очистки колонку (TALON смолы). Общие загрязняющих веществ в таких процессах очистки являются Белки теплового шока (HSP). Добавление инкубационного ногу с MgCl ₂ и АТФ допускает удаление этих загрязнений (рис. 1).

Быстрой жидкостной хроматографии протеинов (FPLC) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) общие методы, которые зависят от дорогих приборов для генерации высокий выход очищенного белка. Очистка протокола пакетного мы представляем здесь, в отличие, является ручной и не требует дорогостоящего инструментального установки. Высокий выход белка может быть достигнуто путем расширения протокола. В то же время, с протоколом пакетной очистки, объем элюирования можно регулировать с целью повышения концентрации белка, который не дано с FPLC или ВЭЖХ.

ntent "> Кроме того, с GST-Его протокол очистки пакетного белки с размером-диапазоне ~ 10-300 кДа может быть очищен. Одна из самых больших преимуществ задается на то, что можно очистить несколько белков в то же время Например, как дикого типа и его мутантный белок. Успех представленной протокола зависит исключительно от уровня экспрессии и растворимости белка, представляющего интерес.

протокол

1. Производство рекомбинантного бакуловируса

Бакуловирусы генерируются с использованием Бакуловирусные Expression System Бак-в-Баке из Invitrogen в основном в соответствии с протоколом производителя с только незначительными изменениями:

1. Модифицированная pFastBac1 вектор (Гибко, жизнь) была создана, содержащий GST и Его-теги (рис. 2). Поликлональном сайта (MCS) из ПЭТ-52b (+) вектор (Novagen), содержащий 10xHis тег, была вставлена ​​в MCS вектора pFastBac1 генерировать pFastBac1-Strep-10xHis. ПЭТ-52b (+) последовательность MCS был ПЦР-амплификации между сайтами рестрикции XbaI и BlpI, добавив сайт рестрикции BglII на 5'конечности и сайт рестрикции HindIII на 3'-конечности. Затем продукт ПЦР клонировали между BamHI и HindIII сайтом рестрикции pFastBac1, используя совместимость BamHI и BglII последовательностей рестрикции. Поскольку целью было создать pFastBac1 позволяющий выражениерекомбинантный белок с стрептавидином и 10xHis-тегами, ограничение сайт BamHI из ПЭТ-52b (+) MCS последовательность не используется. Кроме того, сайт рестрикции XbaI не был использован, чтобы избежать избыточности сайтов рестрикции, происходящих между сайтами уже в ПСК из pFastBac1 и эти вставляется с МКС ПЭТ-52b (+). Кодирующую НДС с сайтом PreScission протеазы распознавания (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) был затем вставляется в pFastBac1-Strep-10xHis. Последовательность кДНК из GST pGEX-6P-2 (GE Healthcare) был ПЦР-амплификации с использованием праймеров, содержащих NcoI и KpnI сайты рестрикции на 5'-и 3'-концах соответственно. Сайт NcoI дает добавление стартового кодона, но также аланин к GST. Затем продукт PCR был клонирован в pFastBac1-Strep-10xHis между сайтами рестрикции NcoI и KpnI, в результате делеции стрептавидин-тега. Полученный таким образом новый фьюжн вектор был назван pFastBac1-GST-10xHis.
2. Клонировать кДНК, кодирующий пр.otein интерес в вектор pFastBac-GST-10xHis между GST (N-терминал) и His-тэга (С-терминал). Следует иметь в виду кДНК стоп-кодон, чтобы позволить слияние с С-концевой His-меткой.
3. Трансформации E. палочка DH10Bac рекомбинантным pFastBac (полученного на стадии 1.2) для генерации Бакмидную. Разрешить колонии расти в течение ночи при 37 ° С и нескольких часов при 30 ° С на чашках, содержащих отбора Bluo-гал и IPTG (10 мкг / мл тетрациклина, 50 мкг / мл канамицина, 7 мкг / мл гентамицина, 100 мкг / мл Bluo- Gal, 40 мкг / мл IPTG).
4. Комплектование и restreak 2 белых колоний (со стадии 1.3) на выбор пластин для подтверждения белый фенотип.
5. Привить 2 мл LB, содержащие 10 мкг / мл тетрациклин, 50 мкг / мл канамицина, 10 мкг / мл гентамицина с двумя белыми колоний от шага 1.4, и пусть они расти в течение ночи при перемешивании (250 оборотов в минуту) при 37 ° С
6. Для того, чтобы очистить Бакмидную ДНК, гранулы бактерии от стадии 1.5,ресуспендирования клеток в 300 мкл раствора I и добавить 300 мкл раствора II (максипреп комплект из Qiagen). Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре, добавляют 300 мкл 3 М KOAc рН 5,5 и инкубируют в течение 10 мин на льду. Центрифуга образцов при 4 ° С, максимальной скоростью в течение 10 мин. Добавить 800 мкл изопропанола в супернатантах и ​​инкубировать в течение 10 мин на льду. Центрифуга образцов в течение 15 мин при 4 ° С и промывают осадок 500 мкл 70% этанола. Пусть осадок сухой и ресуспендируют его в стерильных условиях в 40 мкл Трис-ЭДТА рН 8,0. Бакмидную ДНК следует хранить при температуре 4 ° C.
7. Создать бакуловирусов, как описано в протоколе производителя. Бакуловирусы могут храниться при 4 ° С в защищенном от света месте.

2. Рекомбинантный белок Выражение

1. Для того чтобы выбрать наиболее эффективный бакуловирусы для очистки и контроля в какое время будет достигнут пик экспрессии белка, выполнить мини-инфекции анализа использовалис следующим образом: Infect 2 х 10 ⁷ клеток, инфицированных Sf9 культивировали при 27 ° С в средах Грейс (дополненной 10% FBS и 1% P / S) с 133 мкл (1/150) от бакуловируса. Сбор аликвоты 1,5 мл на 0, 24, 48 и 72 ч после заражения. Гранул клеток и анализировать уровень экспрессии интересующего белка с помощью Вестерн-блоттинга с использованием анти-Tag антитела.
2. Используйте наиболее эффективную бакуловирусы с шага 2.1 заразить счетчик, содержащий 1,0 х 10 ⁶ Sf9 клеток на мл в 500 мл сред с соотношении 1/150 между вирусом и СМИ. Пусть инфицированные клетки растут в суспензии при 27 ° С и сбора клеток при максимальной экспрессии белка (как определено на этапе 2.1 выше) будет достигнута. Осажденные клетки можно хранить при -80 ° С до дальнейшего использования.

3. Приготовление растворимого клеточного лизата

Все последующие стадии инкубации проводили при 4 ° С при умеренном вращения.

1. Lyse SF9 клетки, экспрессирующие свой интерес белок в ~ 20 мл буфера для связывания GST (150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,05% Triton-X-100, 1 мМ ДТТ в PBS1X для конечной концентрации NaCl 250 мМ, и ингибитора протеазы коктейль (Roche). В бане с ледяной водой, Dounce решения 20x с Dounce гомогенизатор, ультразвуком 3x 30 секунд каждое (70% выход), и Dounce снова 20x.
2. (Необязательно). Инкубировать общее лизата клеток с 1 мМ MgCl ₂ и ⁷ Benzonase нуклеазой (2,5 ед / мл) в течение 30 мин при 4 ° С для удаления ДНК или РНК загрязнения.
3. Центрифуге при 18000 оборотах в минуту в течение 30 мин при 4 ° С. Держите супернатант.
4. (Необязательно). Центрифуга супернатант снова в течение 30 мин при 18 000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С, чтобы получить четкое растворимый лизат. Pass супернатанта через 0,2 или 0,45 мкм фильтр, чтобы избежать засорения.

4. Связывание белка на GST Бусы

1. Инкубируйте растворимого клеточного лизата с 1 мл GST шариков (предварительно промывали два раза10 мл буфера GST) связывание в течение 1 часа при 4 ° С при осторожном вращении.

Комментарий: Инкубационный период должен быть оптимизирован в соответствии с стабильности белка и переплетного эффективности.

2. Быстрый спин при 700 оборотах в минуту и ​​удалите супернатант, содержащий несвязанных белков (это может быть для дальнейшего анализа). Вымойте GST-связанные белки (рис. 3б, дорожка 1) с GST промывочного буфера (буфер GST связывания с 350 мм NaCl финале).
3. Повторите шаг 4.2 2x. На последней промывки удалить как можно больше супернатант насколько это возможно.
4. Инкубируйте бисером 5 мМ АТФ и 15 _мМ MgCl2 (в 10 мл буфера для связывания GST) в течение 1 часа при 4 ° С, чтобы избежать неспецифического связывания белков теплового шока ^8. Вымойте бисером три раза GST промывочного буфера.

5. PreScission Расщепление GST

1. Центрифуга GST шарики, удалите супернатант и мыть GST шарики с P5 BUFFER (50 мМ NaHPO ₄ рН 7,0, 500 мМ NaCl, 10% глицерина, 0,05% Triton-X-100, 5 мМ имидазол).
2. Инкубируйте GST-бисер с PreScission фермента в P5 буфера от 3 часов до ночи при 4 ° C. (Разделить GST шарики в долях 100 мкл и добавить 4-8 единиц (2-4 мкл) разбавленного фермента в 100 мкл буфера Р5).

Комментарий: Время инкубации на стадии PreScission должен быть оптимизирован в соответствии с молекулярной массой, а также стабильности белка. Если наблюдается деградация, это время инкубации может быть уменьшена до минимума 2 часов вместо ночь.

3. Быстрый спин и собирать супернатант. Повторите этот шаг два раза после добавления 100 мкл P5 буфер на шарики и объединить все фракции (рис. 3б, дорожка 2).

Комментарий: Остальные гранулы могут быть использованы для анализа эффективности расщепления (фиг.3В , дорожка 3). Как правило, 70-80% белка расщепляется.

6. Белково-привязки к TALON Metal Affinity Ресин

1. Разделите вымывание сверху на 3 фракции по 1 мл и инкубировать друг с 100 мкл Талон металла сродство смолы сухих шариков (предварительно промытую два раза P5 буфера) в течение 1 часа при вращении.

Комментарий: Разделение вымывание в нескольких фракций повышает эффективность связывания / стирок.

2. Промыть смола 5 мин с P30 буфера (буферной P5 с конечной концентрации 30 мМ имидазола).
3. Повторите шаг 6,2 2x и объединить бусины в одной пробирке. Перед последней промывки удалить как можно больше супернатант насколько это возможно.

Комментарий: Это соответствует TALON связаны образца (рис. 3В, переулок 4).

7. Элюирование очищенного белка

1. Выдержите белок связан TALON смолы в течение 5 мин при вращении с P500 буфера (P5 буфер с конечной концентрацией 500 мМ имидазола). Использование соотношение между буфером и шариков 1:1, об / об (Например, если вы взяли 200 мкл сухих шариков, вам придется добавить 200 мкл P500). Повторите этот шаг два раза и сохранить каждый элюированной фракции отдельно (по имени элюирования 1 (E1), элюирования 2 (E2) и элюирования 3 (E3); 3В, дорожки 5-7).

Комментарий: Остальные гранулы могут быть использованы для анализа эффективности элюции (рисунок 3B, дорожка 8). Как правило, 60-80% белка элюировали в общей сложности.

2. Анализ количество и качество вашего очищенного белка путем загрузки приблизительно 20-40 мкл каждой фракции со стандартной концентрации БСА на ДСН-ПААГ и красителем Кумасси синим (рис. 3б) или SYPRO белка пятно для визуализации.

Комментарий: интерес белок может также быть обнаружены беспересадочныйughout процедуры очистки с использованием анти-GST и анти-His антител (рис. 3в).

8. Хранение очищенного белка

1. Диализировать очищенный белок против соответствующем буфере для хранения (например, 20 мМ Трис ацетата рН 8,0, 200 мМ КАс, 10% глицерина, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ DTT) при 4 ° С. Важно, чтобы проверить для осаждения очищенного белка во время диализа. Мы обычно диализировать 2x в течение 1 часа при 4 ° С при вращении перемешивании.
2. Сделать небольшие аликвоты очищенного белка (10-20 мкл) и замораживают на сухом льду в течение 30 мин. Храните аликвоты при -80 ° С и избежать многих оттаивания / замораживания циклов.

Результаты

Для того чтобы проиллюстрировать эффективность GST-Его протокол очистки, мы очистили Rec14, в С. ротЬе белок 32,9 кДа. Rec14 кДНК клонировали в нашей модифицированной pFastBac1 вектора позволяя добавки GST-и ГИС-тегов в то N-и C-концов, соответственно (рис. 1А). Рекомбинантный бакуловирус З?...

Обсуждение

GST-Его очистка протокол, представленные здесь, пригодны для очистки в широком диапазоне размеров рекомбинантных белков: Мы успешно очищен Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa) и нестабильную высокой молекулярной массой белок Лейшмания infantum: Ли BRCA2 (125kDa) ^6,9. Кроме того, белки, очищен...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
E.Coli DH10Bac (competent)	Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Invitrogen
Maxi Prep Kit	Qiagen	12163	Solution I and II
Ultra Pure Bluo-Gal	Gibco (Life)	15519028
IPTG	Gibco (Life)	15529019
Sf9 infected cells	ATCC	CRL-1711
PreScission enzyme	GE Healthcare	27084301
Grace's infected medium supplemented	Gibco (Life)	11605-094
Fetal Bovine Serum characterized	Hyclone	SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin)	Gibco (Life)	15070-063
Glutathione Sepharose resin	GE bioscience	17075605
Protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Talon resin	Clontech	635504
Imidazole	BioShop	288324
Gentamicin	Gibco (Life)	15710064
Polyclonal GST-antibody	Production in house
Monoclonal 6X-His-antibody	Clontech	631212
EQUIPMENT
Dounce homogenizer (tight)	Wheaton	357546
Sonicator (Fisher dismembrator)	Fisher	Model 150
Dialysis bag (50 mm)	Fisher Scientific	2115217