Imágenes de células vivas de las primeras autofagia Eventos: Omegasomes y más allá

Resumen

Time-lapse microscopía de marcadores autofagia marcados con fluorescencia permite la monitorización de la respuesta de la autofagia dinámico con alta resolución temporal. Usando la autofagia específico y los marcadores de orgánulos en una combinación de 3 colores diferentes, podemos seguir la aportación de una proteína a la formación autophagosome en un contexto espacial y temporal robusto.

Resumen

La autofagia es una respuesta celular provocada por la falta de nutrientes, especialmente la ausencia de aminoácidos. La autofagia se define por la formación de estructuras de doble membrana, llamada autofagosomas, que secuestran citoplasma, proteínas de larga duración y los agregados de proteínas, orgánulos defectuosos, e incluso virus o bacterias. Autofagosomas finalmente se fusionan con los lisosomas que conducen a la degradación mayor parte de su contenido, con los nutrientes producidos se reciclan de nuevo al citoplasma. Por lo tanto, la autofagia es fundamental para la homeostasis celular y la desregulación de la autofagia puede conducir a la enfermedad, sobre todo la neurodegeneración, el envejecimiento y el cáncer.

Formación autophagosome es un proceso muy elaborado, para el cual las células han asignado un grupo específico de proteínas, llamada la maquinaria autofagia núcleo. La maquinaria de la autofagia núcleo está funcionalmente complementa con proteínas adicionales que intervienen en diversos procesos celulares, por ejemplo, en membranel tráfico de correo, en la biología mitocondrial y lisosomal. La coordinación de estas proteínas para la formación y la degradación de autofagosomas constituye la respuesta altamente dinámica y sofisticada de la autofagia. Imágenes de células vivas permite seguir la contribución molecular de cada proteína relacionada con la autofagia hasta el nivel de un solo evento de formación autofagosoma y en tiempo real, por lo tanto, esta técnica ofrece una alta resolución temporal y espacial.

Aquí se utiliza una línea celular estable expresando GFP-DFCP1, para establecer un contexto espacial y temporal para nuestro análisis. DFCP1 marcas omegasomes, que son estructuras precursoras conducen a la formación autofagosomas. Una proteína de interés (POI) puede ser marcado con una etiqueta de color rojo o cian fluorescente. Los diferentes orgánulos, como el ER, las mitocondrias y los lisosomas, están todos involucrados en diferentes etapas de formación de autofagosoma, y ​​pueden ser marcados utilizando un rastreador tinte específico. Time-lapse microscopía de autophagy en este montaje experimental, permite que la información se extrae de la cuarta dimensión, es decir, tiempo. Por lo tanto podemos seguir la contribución del POI de la autofagia en el espacio y el tiempo.

Introducción

La autofagia es un proceso muy dinámico, que requiere la coordinación de un gran número de proteínas para el resultado final de la formación autophagosome ^1-3. Microscopía es probablemente la técnica más comúnmente aplicada para el estudio de la autofagia ^4. La localización de la mayoría de las proteínas de la autofagia ha sido ampliamente estudiado en células fijadas, tanto por inmuno-tinción de las proteínas endógenas y por la expresión de la proteína exógena marcado con fluorescencia. Además, la microscopía electrónica (EM), solo y en combinación con el etiquetado inmuno-oro, ha descrito los detalles finos de estas estructuras ^5,6. A pesar del hecho de que estas técnicas han establecido nuestra comprensión de la formación autofagosoma en las 3 dimensiones del espacio, que no han logrado proporcionar suficiente cantidad de información acerca de la 4 ^ª dimensión - tiempo. Imágenes de células en vivo supera esta barrera ya que permite después de la formación de un autofagosoma tan cerca como seable a tiempo real ^7. Esta técnica se utilizó primero para estudiar la autofagia por Yoshimori y colegas ^8, y se ha utilizado cada vez más en adelante.

Microscopía de lapso de tiempo captura la localización del punto de interés en células vivas y durante un período de tiempo. Al comparar esta información con la autofagia bien caracterizado y / u orgánulo marcador, el análisis de imágenes de células vivas puede poner el punto de interés en el mayor contexto espacial y temporal de la formación autophagosome. Análisis de imágenes de células vivas se basa en la captura repetitiva de la localización a lo largo de PDI todos los pasos de la formación de autofagosoma, mientras que las imágenes de células fijadas se basa en una sola captura. Por lo tanto, imágenes de células vivas puede demostrar la contribución de los POI a los pasos específicos de formación autophagosome, mientras que las imágenes de las células fijas sólo puede asumir la función de punto de interés, en base a su localización media en muchos autofagosomas capturados simultáneamente en diferentes etapas de su lifecycle.

A pesar de imágenes de células vivas es un método de alta capacidad analítica, tiene algunas limitaciones inherentes que deben ser tomados en consideración. En primer lugar, imágenes de células vivas requiere la expresión de una o más proteínas exógenos marcados con fluorescencia. Etiquetas fluorescentes tienden a ser grandes en tamaño y que a veces puede alterar el comportamiento de una proteína debido a razones estéricas. Esta situación se ve acentuada por las proteínas de membrana, ya que necesitan para funcionar en el espacio limitado de las 2 dimensiones de las membranas. De nota, autofagosomas son estructuras membranosas, y en consecuencia su formación requiere un gran número de proteínas asociadas a la membrana.

Otro conjunto de problemas está conectado a los niveles de expresión de la PDI. En principio, una proteína exógena debe ser expresada a niveles comparables a la proteína endógena. Esto asegura que los reguladores importantes de su localización sub-celular no estarán saturados, y thanálisis e será biológicamente relevante. Por otra parte, la sobreexpresión de proteínas de la autofagia se debe evitar, como cuando se expresan por encima de los niveles endógenos, que tienden a inhibir la respuesta autofagia ^9. A la inversa, ya que los niveles de expresión del POI debe ser lo suficientemente alta como para permitir seguir su localización por un buen período de tiempo sin foto-blanqueo, un compromiso se ha alcanzado. El logro de los niveles de expresión óptimos de una proteína exógena en células mamíferos requiere mucha sintonía fina, pero es factible mediante el establecimiento y la detección de líneas celulares que expresan de forma estable los diferentes niveles de la PDI.

La resolución espacial que se puede lograr con microscopía de fluorescencia estándar es otro factor limitante. La resolución puede ser limitado por una serie de razones, pero en el mejor, resolución lateral será de alrededor de 250 nm. Esto significa que los objetos separados por una distancia menor que esta aparecerán conectado (o como una solaobjeto) y objetos de menos de 250 nm estarán representados en la imagen más grande de lo que realmente son. Por lo tanto, las imágenes siempre deben interpretarse teniendo esto en cuenta y las técnicas complementarias como la EM tendrán que resolver detalles finos ultra-estructural.

Por último, imágenes de células vivas requiere inherentemente exposición de una célula a la luz, potencialmente, para un período de tiempo prolongado. Esto puede alterar las respuestas fisiológicas de una célula, un fenómeno conocido como foto-toxicidad.

Hemos utilizado con éxito imágenes de células vivas de la proteína de unión a PI3P DFCP1 para describir por primera vez que se originan a partir de autofagosomas PI3P ricas en estructuras en forma de anillo omegasomes denominados, que están en estrecha asociación con ER hebras ^10,11. Hemos demostrado claramente que las estructuras de LC3-positivos se empiezan a formar en estrecha asociación con omegasomes. Estamos aquí, sugerimos que el empleo de una línea celular estable expresando GFP-DFCP1 para la célula vivaimagen de la proteína de interés, establece un marco espacial y temporal robusto para la caracterización de su papel en la formación autophagosome.

Protocolo

1. Preparación de células

1. Semilla bajo número de pases de las células HEK-293T que expresan establemente GFP-DFCP1 en cubreobjetos redondos 22 mm; células de cultivos de una noche en medio Dulbecco Modificado de Eagles (DMEM), a una confluencia de 30-40% (objetivo para una confluencia de 80% después de 2 día - día de imágenes de células vivas).

2. Transfección celular

1. Preparar la mezcla de complejo de transfección para cada plato, que contiene 100 l OptiMEM reduje el suero, 3 l X-9 tremeGENE ADN transfección reactivo, y 0,5 g de pECFP-LC3 plásmido ADN. Mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo y se incuba 15 minutos a temperatura ambiente. [Nota: Hemos encontrado repetidamente que otros reactivos de transfección, como Lipofectamine 2000, tienen un montón de toxicidad y, además, producen partículas fluorescentes en sus propios que interfieren con muchas técnicas de microscopía.]
2. Aspirar el medio de las placas y añadir DMEM fresco pre-calentado a 37 ° C.
3. Agregue la transfection complejo a las células por pipeteo, se incuban las células durante 24 horas.

3. Incubación de las células con el marcador Orgánulos (Opcional)

1. Añadir MitoTracker / LysoTracker a DMEM a una concentración final de 75 nM, y mantener en hielo, en un tubo Falcon cubierto con papel de aluminio, a lo largo de todo el día experimental, para evitar la exposición a la luz y la congelación repetitivo y los ciclos de descongelación.
2. Retirar una alícuota de 2 ml del medio que contiene LysoTracker MitoTracker / y calentar a 37 ° C; medio aspirado a partir de células transfectadas y reemplazar con MitoTracker / LysoTracker-que contiene el medio y se incuban las células durante 30 - 60 min.

4. Preparación de la cámara de incubación para imágenes de células vivas (Figura 1)

1. Limpieza de metal y las juntas tóricas de plástico con 75% de etanol y aplicar grasa de silicona en el borde de la junta tórica de metal.
2. El uso de pinzas quitar el cubreobjetos de la placa y secar el exceso de medio desde el lado inferior del cubreobjetos,para evitar que se mezclen demasiado medio con la grasa, ya que esto aumentará la probabilidad de fugas.
3. Deje el cubreobjetos para descansar en el borde de la junta tórica de plástico y adaptarse a la junta tórica de metal en la parte superior de la junta tórica de plástico, con el cubreobjetos insertado en el medio, con el fin de crear una cámara cerrada.
4. Rellenar cámara con el medio de la placa; desde este punto y en, evitar la incubación prolongada de las células en medio DMEM sin ​​un agente tampón, para evitar cambios en el pH que se produzca, como el sistema de tampón de bicarbonato de DMEM requiere concentración artificial de CO ₂ de 5-10% y la concentración de CO ₂ del aire ambiente es mucho menor.

5. Padecer hambre a las células

1. Coloque la cámara de incubación en la platina del microscopio.
2. Aspirar el medio completo y se lava con 2 ml de medio de inanición 3 veces, para asegurarse de que no hay aminoácidos se han mantenido desde el DMEM, que eventualmente inhibir la respuesta autofagia; establecer eltemporizador ON.

6. Microscopía

1. Se requiere un sistema de imagen adecuada configurada para células vivas de gran campo epi-fluorescencia. Este comprenderá típicamente un marco de la investigación de grado microscopio invertido, una intensa de amplio espectro de fuentes de luz, espejos y filtros específicos para la proteína fluorescente (s) / tinte (s) de interés, una lente de objetivo de alta calidad, un CCD / sCMOS sensible cámara y una cámara de incubación. Todos los principales fabricantes de microscopios ofrecen sistemas completos de gran campo apropiado para imágenes de células vivas, pero también es posible en casa a construir un sistema con componentes de una variedad de fabricantes y controlan el uso de software de código abierto como Micro-Manager ( http: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki / ). El aspecto más importante en nuestra opinión es el uso de un sistema de alta sensibilidad para que los niveles de expresión de los periodistas fluorescentes pueden mantenerse al mínimo.
2. Selecting las celdas correspondientes a la imagen.
   1. Seleccione las celdas grandes y planas que permiten eventos de formación más autophagosome a ser capturados. Además, optar por las células que ya han comenzado la producción de un mayor número de omegasomes.
   2. Iniciar la captura de vídeo después de 30 min o bien en respuesta autofagia, con el fin de capturar una proporción más grande de eventos de formación autophagosome por vídeo.
3. Imaging.
   1. Utilice un objetivo gran aumento (100x 1.4 NA).
   2. Ajuste la intensidad de luz de excitación a un 10-20% del máximo para evitar la foto-blanqueo.
   3. Ajuste la cámara (Hamamatsu ORCA ER, tamaño de píxel 6.45 m) para la exposición 100-500 ms, binning 2x2 y 100 de ganancia.
   4. Ajuste la velocidad de adquisición de imágenes de 1 fotograma cada 10 seg.

7. La creación de montajes de autophagosome Formación Eventos con ImageJ

[Esto se puede hacer de una manera no sistemática por el simple escaneado el vídeo fusionado para el correorespiraderos de interés, pero también puede ser sistematizados como se indica a continuación.]

1. Pilas de imágenes abiertas para el 3 (o 2) capturaron canales en ImageJ / Fiji.
2. Aplicar LUT verde, rojo y azul (Tablas de búsqueda) para el canal correspondiente; combinar 3 colores y ahorrar.
3. En la ficha Analizar, seleccione Herramientas> ROI gerente ... > Especificar, a continuación, seleccionar un área aleatoria de tamaño definido en la primera imagen de la pila.
4. En la ficha Imagen, seleccione duplicado, con el fin de duplicar el área seleccionada de la pila.
5. En la ficha Imagen, seleccione Pilas> Hacer montage ... para crear un montaje provisional contiene capturan todos los marcos. Analizar todos los marcos en el montaje de un evento complete la formación autophagosome; tomar notas de la primera y la última imagen del evento.
6. En la ficha Analizar, seleccione Herramientas> ROI gerente ... seleccionar la misma zona en la primera imagen de la pila para los otros 2 colores, así como para la imagen resultante de la concentración colores y duplicar pilas.
7. De tél pestaña Archivo, seleccione Nuevo> Imagen, y para un ancho de acuerdo al número de píxeles seleccionados inicialmente con el administrador de retorno de la inversión, establecidos para la altura 4 veces la altura establecida en el gestor de ROI más 3 píxeles de espacio entre los 3 y los colores Rebanadas fusionado, y se definen como el número de fotogramas en cada pila.
8. En la ficha Imagen, seleccione Pilas> Herramientas> Insertar ... y luego insertar cada sub-pila encima de otra, dejando un espacio de 1 pixel en el medio.
9. En la ficha Imagen, seleccione Pilas> Hacer montage ... para crear un montaje de partida y acabado con la primera y última trama de la formación de evento autofagosoma capturado.

Resultados

En el protocolo descrito, hemos utilizado la microscopía de lapso de tiempo para seguir la localización de la PPC de etiquetado LC3 en una línea celular estable expresando GFP-etiquetados DFCP1, en condiciones que inducen la autofagia. El resultado de este experimento es la captura de 2 series o pilas de imágenes, uno de la verde y uno desde el canal azul, correspondientes a GFP-DFCP1 y CFP-LC3. Hemos analizado más estos videos usando ImageJ, con el fin de crear montajes correspondientes a eventos de formación aut...

Discusión

El método descrito en este protocolo permite la visualización de la localización de una proteína durante la formación de autofagosoma. Hemos intentado varios métodos de visualización de los eventos descritos como punto confocal de barrido, disco giratorio confocal y de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) microscopía. Hemos encontrado que para los propósitos generales de campo amplio epi-fluorescencia estándar proporciona el mejor compromiso entre la sensibilidad y la resolución. Esto asegura una ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	41965
OptiMEM I	Invitrogen	31985-062
MitoTracker Red FM	Invitrogen	M22425
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Applied Science	6365787001
22 mm coverslips	VWR	631-0159
35 mm plates	Fisher NUNC	153066
Silicon grease	RS Components Ltd.	RS 494-124
O-rings			Custom made
Attofluor Cell Chamber	Invitrogen	A-7816	Suggested alternative to custom-made O-rings
Microscope	Olympus	IX81	Inverted microscope
Objective	Olympus	UPLSAPO 100XO	N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5
Camera	Hamamatsu	ORCA-R2 C10600 10B	Progressive scan interline CCD
Illuminator	TILL Photonics	Polychrome V	Ultrafast monochromator
Incubation chamber	Solent Scientific	Cell^R IX81
Software	Olympus	SIS xcellence