Живых изображений сотовый событий раннего этапа Аутофагия: Omegasomes и на последующий период

Резюме

Покадровый микроскопии флуоресцентно меченных аутофагию маркеров позволяет отслеживать динамические характеристики аутофагию с высоким временным разрешением. Использование конкретного аутофагия и органелл маркеров в комбинации из 3 различных цветов, можно следовать вклада белка аутофагосом образование в прочном пространственной и временной контекст.

Аннотация

Аутофагия клеточный ответ вызвано недостатком питательных веществ, особенно отсутствие аминокислот. Аутофагия определяется образованием двойной мембранных структур, называемых аутофагосомы, которые способствуют удалению цитоплазме, долгоживущие белки и белковые агрегаты, дефектные органелл и даже вирусы или бактерии. Аутофагосомы в конечном итоге сливаются с лизосом приводит к объемной деградации их содержания, с полученным время питательные вещества возвращаются обратно в цитоплазму. Поэтому аутофагию имеет решающее значение для клеточного гомеостаза и регуляции аутофагии может привести к болезни, в первую очередь нейродегенерацию, старение и рак.

Аутофагосом образование очень сложный процесс, в котором клетки выделили определенной группы белков, называемых техники ядро ​​аутофагия. MACHINERY CORE аутофагия функционально дополнена дополнительными белками, участвующими в различных клеточных процессах, например, в мембранныхэлектронной торговли, в митохондриальных и лизосомальных биологии. Координация этих белков для формирования и деградации аутофагосом является очень динамичной и сложной реакции аутофагии. Изображений живых клеток позволяет следовать молекулярной вклад каждого аутофагия-родственного белка до уровня одного аутофагосом событие формирования и в реальном времени, поэтому этот метод обеспечивает высокую временным и пространственным разрешением.

Здесь мы используем клеточной линии, стабильно экспрессирующие GFP-DFCP1, установить пространственные и временные условия для нашего анализа. DFCP1 omegasomes знаки, которые являются предшественником структур, приводящих к образованию аутофагосомы. Белка интереса (POI) могут быть помечены либо с красной или голубой флуоресцентной метки. Разные органеллы, как ER, митохондрий и лизосом, все вовлечены в различные этапы формирования аутофагосом, и могут быть отмечены с помощью специального красителя трекера. Покадровый микроскопии AUTOPHagy в этой экспериментальной установки, позволяет информации быть извлечены о четвертом измерении, т.е. время. Следовательно, мы можем следить за вклад в аутофагию POI в пространстве и времени.

Введение

Аутофагия весьма динамичный процесс, который требует координации большого количества белков для конечного результата аутофагосом формирования ^1-3. Микроскопия, вероятно, техника чаще всего используется для изучения аутофагии ^4. Локализация наиболее аутофагию белки широко изучалась в фиксированных клетках, как по иммуно-окрашивания эндогенных белков и выражение флуоресцентно меткой экзогенных белков. Кроме того, электронная микроскопия (ЭМ), самостоятельно и в сочетании с иммуно-золотые маркировки, описал мельчайшие детали этих структур ^5,6. Несмотря на то, что эти методы создали наше понимание аутофагосом образованием в 3-х измерениях пространства, они не в состоянии обеспечить достаточное количество информации о ^4-е измерение - время. Изображений живых клеток преодолевает этот барьер, так как позволяет после формирования аутофагосом настолько близко, насколько возможнымBLE к реальному времени ^7. Этот метод был впервые применен для изучения аутофагии Yoshimori и коллеги ^8, и все чаще использоваться в дальнейшем.

Покадровый микроскопии захватывает локализации POI в живых клетках и в течение периода времени. Сравнивая эту информацию с хорошо характеризуется аутофагию и / или органеллы маркером, живая анализа изображений Сотовые можете поставить POI в большем пространственном и временном контексте аутофагосом формирования. Онлайн-анализа изображений Сотовые основан на повторяющихся захвату POI по локализации все шаги аутофагосом образование, в то время как изображения основных клеток на основе одного захвата. Поэтому изображений живых клеток может оказаться вклад POI в определенных шагов аутофагосом формирования, в то время как изображения основных клетки могут взять на себя роль POI, исходя из его средней локализации во многих аутофагосомы одновременно захватываются в различных стадиях их lifecyНКУ.

Хотя изображений живых клеток является методом высокой аналитические возможности, она имеет некоторые ограничения, присущие, которые должны быть приняты во внимание. Прежде всего, изображений живых клеток требует экспрессии одного или более экзогенных флуоресцентно меченных белков. Флуоресцентные теги, как правило, большие по размеру и иногда они могут изменять поведение белка вследствие стерических причин. Эта ситуация усугубляется для мембранных белков, так как они должны работать в ограниченном пространстве 2 размеры оболочки. Следует отметить, что аутофагосомы являются мембранных структур и, соответственно, их образование требует большого количества мембранных белков, ассоциированных с.

Другой ряд проблем связана с уровни экспрессии POI. В принципе, экзогенных белков должно быть выражено на уровне, сопоставимом с эндогенным белком. Это гарантирует, что важные регуляторы его суб-клеточная локализация не будет насыщен, и гоэлектронной анализ будет биологически значимых. Кроме того, сверхэкспрессия белков аутофагия следует избегать, так как, когда они выражены выше эндогенные уровни, они имеют тенденцию к ингибированию аутофагия ответ ^9. С другой стороны, так как уровни экспрессии POI должна быть достаточно высокой, чтобы после его локализации для хорошего периода времени без фотообесцвечивания, компромисс должен быть достигнут. Достижение оптимального уровня экспрессии экзогенного белка в клетках млекопитающих требует много тонкой настройки, но это возможно путем создания и скрининга клеточные линии, стабильно экспрессирующие различные уровни POI.

Пространственное разрешение, которое может быть достигнуто при стандартной флуоресцентной микроскопии другой ограничивающим фактором. Разрешение может быть ограничено по ряду причин, но в лучшем случае, боковые разрешение будет около 250 нм. Это означает, что любые объекты на расстоянии меньше, чем это будет выглядеть подключен (или в виде одногообъекта) и объектов меньше, чем 250 нм будет представлена ​​в образе больше, чем они на самом деле. Поэтому изображения всегда следует интерпретировать с учетом этого и дополнительные методы, такие как EM будет необходимо решить ультра-тонкий структурных деталей.

Наконец, изображений живых клеток по существу требует подвергая клетки к свету, потенциально в течение длительного периода времени. Это может привести к изменению физиологических реакций клетки, явление, известное как фото-токсичности.

Мы успешно использовали изображений живых клеток из PI3P-связывающий белок DFCP1 описать в первый раз, что аутофагосомы происходят из богатых PI3P кольцевые структуры называются omegasomes, которые находятся в тесной связи с нитями ER ^10,11. Мы четко показали, что LC3-положительные структуры начинают формироваться в тесной связи с omegasomes. Мы здесь, показывают, что использование клеточной линии, стабильно экспрессирующие GFP-DFCP1 для живой клеткивизуализации белка, представляющего интерес, создает надежную пространственные и временные рамки для характеризации его роль в формировании аутофагосом.

протокол

1. Подготовка клеток

1. Семенной низкое число прохождение клеток НЕК-293Т, стабильно экспрессирующих GFP-DFCP1 на 22 мм круглые покровные; культуре клетки на ночь в Dulbecco изменения орлов в среде Игла (DMEM), для слияния на 30-40% (цель для слияния 80% после 2 дней - День изображений живых клеток).

2. Трансфекции клеток

1. Подготовьте трансфекции сложное сочетание для каждой пластины, содержащие 100 мкл OptiMEM я уменьшил сыворотки средний, 3 мкл X-tremeGENE 9 трансфекции ДНК реагента и 0,5 мкг pECFP-LC3 плазмидной ДНК. Осторожно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз и инкубировать 15 мин при комнатной температуре. [Примечание: мы неоднократно обнаружили, что другие реагенты трансфекции, например, Lipofectamine 2000, есть много токсичность, и, кроме того, они производят флуоресцентные частицы сами по себе, которые препятствуют многие методы микроскопии.]
2. Аспирируйте среду из пластин и добавить свежей DMEM предварительно нагревают при 37 ° С.
3. Добавить Transfection комплекс в клетки с помощью пипетки; клетки инкубируют в течение 24 часов.

3. Инкубации клеток с маркером органелл (необязательно)

1. Добавить Mitotracker / Lysotracker в DMEM, в конечной концентрации 75 нМ и держать на льду, в трубку сокола покрытый алюминиевой фольгой, а весь день экспериментальный, для предотвращения попадания света и повторных циклов замораживания и оттаивания.
2. Удалить аликвоты по 2 мл Mitotracker / Lysotracker-содержащую среду и прогреть при 37 ° С; аспирации среды из трансфицированных клеток и заменить Mitotracker / Lysotracker-содержащую среду и клетки инкубируют в течение 30 - 60 мин.

4. Подготовка инкубационной камеры для изображений живых клеток (рис. 1)

1. Чистый металл и пластик уплотнительные кольца с 75%-ным этанолом и применять силиконовую смазку на обод металлического уплотнительного кольца.
2. Использование щипцов удалить покровное от пластины и высушить избыток среды из нижней части покровного,для недопущения смешивания слишком много средних со смазкой, так как это увеличит вероятность утечки.
3. Оставьте покровное отдохнуть на выступе пластикового уплотнительного кольца и его металлические уплотнительное кольцо поверх пластикового уплотнительного кольца, с покровным зажатой между ними, с тем чтобы создать закрытую камеру.
4. Пополнение камеру со средой от пластины; с этого момента и далее, избегать длительной инкубации клеток в среде DMEM без буферного агента для предотвращения изменения рН происходит, так как бикарбонат системы буфер DMEM требует искусственной концентрации СО ₂ 5-10%, а концентрация СО ₂ из окружающего воздуха значительно ниже.

5. Голод клеток

1. Положите инкубационной камере на столик микроскопа.
2. Аспирируйте полную среду и промывают 2 мл голода среднего 3 раза, чтобы убедиться в отсутствии аминокислот не осталось от DMEM, которые в конечном итоге препятствует аутофагию реагирования; установитьТаймер ON.

6. Микроскопия

1. Соответствующие системы визуализации настроены для живой клетки широкого поля флуоресценции будет требоваться. Это обычно включает исследование класса перевернутой кадр микроскопом интенсивный широкого спектра источников света, зеркала и фильтры специфичных для флуоресцентного белка (ы) / краситель (ы), представляющие интерес, высокое качество объектива, ПЗС / sCMOS камеру и инкубационной камере. Все крупные производители предлагают полный микроскоп широкого поля системы подходят для изображений живых клеток, но это также возможность домашнего построить систему с использованием компонентов от различных производителей и контролировать его с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом, таких как микро-Manager ( Http: / / valelab.ucsf.edu / ~ мм / MMwiki / ). Наиболее важным аспектом по нашему мнению, использовать систему с высокой чувствительностью, так что уровни экспрессии флуоресцентного репортеров может быть сведено к минимуму.
2. Selнад каждым из соответствующих клеток к изображению.
   1. Выберите большие и плоские клетки, которые позволят более аутофагосом событий формирования попасть в плен. Кроме того, выбирают клетки, которые уже дает большее количество omegasomes.
   2. Начать захват видео через 30 мин или хорошо в аутофагию ответ, для того, чтобы захватить большую отношение аутофагосом событий в формировании видео.
3. Изображений.
   1. Использовать высококачественный объектив увеличением (100х 1,4 NA).
   2. Регулировка интенсивности возбуждающего света до 10-20% от максимальной для предотвращения фото-отбеливание.
   3. Установите камеру (Хамамацу ORCA ER, размер пикселя 6,45 мкм) до 100-500 мс экспозиции, 2x2 биннинге и набором 100.
   4. Установите скорость получения изображения 1 кадр каждые 10 сек.

7. Создание монтажи аутофагосом Формирование событий с ImageJ

[Это может быть сделано в бессистемно, просто просматривая видео объединенного электронногоотверстия интереса, но она также может быть систематизирована как описано ниже.]

1. Открыть изображение для стеков 3 (или 2) захваченных каналов в ImageJ / Фиджи.
2. Примените зеленый, красный и синий LUT (Lookup Tables) на соответствующий канал; слияния 3-х цветов и сохранить.
3. От вкладке Анализ выберите Сервис> ROI менеджер ... > Укажите, затем выберите случайную область определенного размера в первом образе стека.
4. Из образа выберите пункт дублировать, для того, чтобы дублировать выделенную область стека.
5. Из образа выберите пункт стеки> Сделать монтаж ... Для создания предварительного монтажа, содержащий все кадры, захваченные. Проверять все кадры в монтаж для полного формирования аутофагосом события; вести записи первого и последнего кадра события.
6. От вкладке Анализ выберите Сервис> ROI менеджер ... выбрать ту же область в первое изображение стека для других 2-х цветов, а также для объединенного изображения цветов и дублировать стеков.
7. С тОн вкладке Файл выберите команду Создать> Картинку, и установлены на ширину в зависимости от количества пикселей изначально выбирается с помощью менеджера ROI, набор для высоты 4 раза высоту установленные в менеджере ROI плюс 3 пикселей пространство между 3 цвета и объединены и установить Ломтики как число кадров в каждом стеке.
8. Из образа выберите пункт стеки> Инструменты> Вставить ..., а затем вставьте каждого суб-стек один поверх другого, оставляя место в 1 пиксель между ними.
9. Из образа выберите пункт стеки> Сделать монтаж ... для создания коллажа начиная и заканчивая первый и последний кадр аутофагосом событием формирования плен.

Результаты

В протокол, описанный мы использовали покадровой микроскопии следовать локализации CFP-меченый LC3 в клеточной линии, стабильно экспрессирующие GFP с метками DFCP1 под аутофагия условий вызывающие. Результат этого эксперимента состоит в захвате 2 серии или стопку фотографий, одна из зеленых...

Обсуждение

Метод, описанный в этом протоколе позволяет визуализировать локализацию белка во время аутофагосом формирования. Мы пробовали различные методы визуализации событий, описанных включая линии сканирующей конфокальной, вращающийся диск конфокальной и флуоресцентной полного внутренне?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	41965
OptiMEM I	Invitrogen	31985-062
MitoTracker Red FM	Invitrogen	M22425
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Applied Science	6365787001
22 mm coverslips	VWR	631-0159
35 mm plates	Fisher NUNC	153066
Silicon grease	RS Components Ltd.	RS 494-124
O-rings			Custom made
Attofluor Cell Chamber	Invitrogen	A-7816	Suggested alternative to custom-made O-rings
Microscope	Olympus	IX81	Inverted microscope
Objective	Olympus	UPLSAPO 100XO	N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5
Camera	Hamamatsu	ORCA-R2 C10600 10B	Progressive scan interline CCD
Illuminator	TILL Photonics	Polychrome V	Ultrafast monochromator
Incubation chamber	Solent Scientific	Cell^R IX81
Software	Olympus	SIS xcellence