Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

Resumo

Microscopia de lapso de tempo de marcadores autofagia fluorescente etiquetado permite o monitoramento da resposta autofagia dinâmico com alta resolução temporal. Usando autofagia organela específica e marcadores numa combinação de três cores diferentes, pode-se seguir a contribuição de uma proteína para a formação autophagosome num contexto espacial e temporal robusta.

Resumo

Autophagy é uma resposta celular desencadeada pela falta de nutrientes, em particular a ausência de aminoácidos. Autophagy é definido pela formação das estruturas de membrana dupla, chamada autofagossomas, que sequestram o citoplasma, proteínas de longa duração e os agregados de proteína, organelas defeituosos, e até mesmo vírus ou bactérias. Autophagosomes eventualmente fundir-se com os lisossomas levam a uma degradação do seu conteúdo em massa, produzidos com os nutrientes a ser reciclado de volta para o citoplasma. Portanto, autofagia é crucial para a homeostasia celular, e a desregulação de autofagia pode levar a doença, mais notavelmente a neurodegeneração, envelhecimento e cancro.

Formação autophagosome é um processo muito elaborado, pelo qual as células foram definidos para um grupo específico de proteínas, chamado de máquinas autofagia núcleo. A maquinaria autofagia núcleo é funcionalmente complementadas por proteínas adicionais envolvidas em diversos processos celulares, por exemplo, em membrantráfico de e, em biologia mitocondrial e lisossomal. Coordenação destas proteínas para a formação e degradação de autofagossomas constitui a resposta dinâmica e altamente sofisticadas de autofagia. Imagem de células vivas permite seguir a contribuição molecular de cada proteína relacionada autofagia até ao nível de um único evento de formação autophagosome e em tempo real, pelo que esta técnica oferece uma resolução temporal e espacial elevada.

Aqui usamos uma linha celular estável expressando GFP-DFCP1, para estabelecer um contexto temporal e espacial para a nossa análise. DFCP1 omegasomes marcas, que são estruturas precursoras que conduzem à formação autofagossomas. Uma proteína de interesse (POI) pode ser marcado com um vermelho ou ciano etiqueta fluorescente. Diferentes organelas, como o ER, mitocôndrias e lisossomos, estão todos envolvidos em diferentes etapas de formação autophagosome, e podem ser marcadas com um corante rastreador específico. Microscopia de lapso de tempo de AUTOPHagy nesta montagem experimental, permite que a informação a ser extraído sobre a quarta dimensão, ou seja, o tempo. Assim podemos seguir a contribuição do POI para autofagia no espaço e no tempo.

Introdução

Autophagy é um processo altamente dinâmico, o que requer a coordenação de um grande número de proteínas para o resultado final da formação do autophagosome ^1-3. Microscopia é provavelmente o método mais vulgarmente aplicados para estudar autofagia ^4. A localização da maioria das proteínas autofagia tem sido extensivamente estudada em células fixadas, quer por imuno-coloração das proteínas endógenas e por expressão de proteína exógena fluorescentemente marcados. Além disso, a microscopia eletrônica (ME), isoladamente e em combinação com marcação imuno-ouro, descreveu os detalhes destas estruturas ^5,6. Apesar do facto de que estas técnicas têm estabelecido nossa compreensão da formação autophagosome nas três dimensões do espaço, eles falharam em fornecer uma quantidade suficiente de informação sobre a dimensão de 4 ^th - tempo. Imagem de células vivas supera esta barreira, uma vez que permite acompanhar a formação de uma autophagosome tão perto quanto possível tempo real ^7. Esta técnica foi empregada pela primeira vez para estudar autofagia por Yoshimori e seus colegas ^8, e tem sido cada vez mais utilizada daqui em diante.

Microscopia de lapso de tempo capta a localização do PI em células vivas e ao longo de um período de tempo. Ao comparar essas informações com a autofagia bem caracterizados e / ou organela marcador, a análise de imagens de células vivas pode colocar o POI no maior contexto espacial e temporal da formação autophagosome. Análise de imagem de células vivas baseia-se na captura repetitiva da localização POI ao longo de todos os passos de formação autophagosome, enquanto que imagens de células fixas baseia-se numa única captura. Portanto, imagens de células vivas pode provar a contribuição do POI em etapas específicas de formação autophagosome, enquanto imagens de células fixas só podem assumir o papel de POI, com base em sua localização média em muitos autophagosomes simultaneamente capturados em diferentes fases do seu lifecycle.

Apesar de imagens de células vivas é um método de alto poder analítico, ele tem algumas limitações inerentes, que devem ser levados em consideração. Primeiro de tudo, a imagem de células vivas, requer a expressão de uma ou mais proteínas exógenas marcados com fluorescência. Marcas fluorescentes tendem a ser grande em tamanho, e por vezes, podem alterar o comportamento de uma proteína devido a razões estéricas. Esta situação é acentuado para as proteínas da membrana, uma vez que necessitam para funcionar no espaço limitado das duas dimensões de membranas. De nota, autofagossomas são estruturas membranosas e, consequentemente, a sua formação requer um grande número de proteínas associadas à membrana.

Um outro conjunto de problemas é conectado com os níveis de expressão da PI. Em princípio, uma proteína exógena deverá ser expressa em níveis comparáveis ​​aos da proteína endógena. Isto assegura que os reguladores importantes da sua localização sub-celular não vai ser saturado, e thanálise e será biologicamente relevante. Além disso, a sobre-expressão de proteínas autofagia deve ser evitada, tal como quando são expressas acima dos níveis endógenos, que tendem a inibir a resposta autofagia ^9. Inversamente, uma vez que os níveis de expressão da PI deve ser suficientemente alta para permitir a sua localização na sequência de um bom período de tempo sem foto-branqueamento, um compromisso deve ser alcançado. Atingir os níveis de expressão de ideais de uma proteína exógena em células de mamíferos requer muita sintonia fina, mas é possível através da criação e seleção linhas de células expressando estavelmente diferentes níveis do POI.

A resolução espacial que pode ser obtida com microscopia de fluorescência padrão é outro factor limitante. A resolução pode ser limitada por um número de razões, mas no melhor dos casos, a resolução lateral, será de cerca de 250 nm. Isto significa que quaisquer objectos separados por uma distância menor do que esta aparece ligado (ou como uma únicaobjeto) e objetos menores do que 250 nm será representado na imagem maior do que eles realmente são. Portanto, as imagens devem ser sempre interpretadas com isso em mente e técnicas complementares, tais como EM será necessário para resolver pequenos detalhes ultra-estrutural.

Finalmente, a imagem de células vivas requer inerentemente exposição de uma célula à luz, possivelmente durante um período de tempo prolongado. Isto pode alterar as respostas fisiológicas de uma célula, um fenômeno conhecido como foto-toxicidade.

Nós utilizamos com sucesso imagens de células vivas da proteína de ligação PI3P DFCP1 descrever, pela primeira vez, que se originam a partir autofagossomas PI3P ricos em anel, como estruturas denominadas omegasomes, que estão em estreita associação com ER fios ^10,11. Mostrámos claramente que as estruturas LC3-positivos começam a se formar em estreita associação com omegasomes. Nós, aqui sugerem que emprega uma linha de células que expressam estavelmente GFP DFCP1 para a célula vivaimagiologia da proteína de interesse, estabelece uma estrutura espacial e temporal robusta para a caracterização do seu papel na formação autophagosome.

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Protocolo

1. Preparação celular

1. Semente de baixo número de passagem das células HEK-293T que expressam estavelmente GFP DFCP1 em 22 lamelas redondas mm; células de cultura durante a noite em Meio de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM), a uma confluência de 30-40% (o objectivo de confluência de 80% após 2 dias - dias de imagens de células vivas).

2. Transfecção celular

1. Prepare a mistura complexa de transfecção para cada prato, contendo 100 mL OptiMEM eu reduzi meio de soro, 3 mL X-9 tremeGENE reagente de transfecção de DNA, e 0,5 mg de pECFP-LC3 DNA plasmídeo. Misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo e incubar 15 minutos à temperatura ambiente. [Nota: temos encontrado repetidamente que outros reagentes de transfecção, como Lipofectamine 2000, tem um monte de toxicidade, e, além disso, eles produzem partículas fluorescentes por conta própria que interferem com muitas técnicas de microscopia.]
2. Aspirar o meio das placas e adicionam DMEM fresco pré-aquecido a 37 ° C.
3. Adicione o transfection complexo para células por pipetagem, células incubar durante 24 horas.

3. A incubação de células com o marcador Organelle (Opcional)

1. Adicionar Mitotracker / Lyso Tracker para DMEM a uma concentração final de 75 nM, e manter em gelo, em um tubo Falcon coberto com folha de alumínio, ao longo de todo o dia experimental, para evitar a exposição à luz e os ciclos repetitivos de congelamento e descongelamento.
2. Remove-se uma alíquota de 2 ml da Mitotracker / Lyso Tracker, contendo meio e se aquecer a 37 ° C; meio aspirado a partir de células transfectadas e substituir com Mitotracker / Lyso Tracker contendo meio e as células a incubar durante 30 - 60 min.

4. Preparação da câmara de incubação para imagens de células vivas (Figura 1)

1. Limpeza de metal e plástico anéis com etanol a 75% e aplicar massa de silicone sobre o aro do metal o-ring.
2. Usando fórceps remover a lamela da placa e secar o excesso de meio a partir do lado inferior da lamela,para evitar a mistura demasiado médio com a massa lubrificante, pois isso irá aumentar a probabilidade de fugas.
3. Adicione a lamela para descansar sobre a borda do anel de vedação de plástico e encaixam o anel de vedação de metal no topo do anel de vedação de plástico, com a lamela ensanduichada entre elas, de modo a criar uma câmara fechada.
4. Encher com a câmara de suporte da placa, a partir deste ponto em diante, evitar prolongada incubação das células em meio DMEM sem um agente de tamponamento, para evitar alterações de pH para ocorrer, assim como o sistema de tampão de bicarbonato de DMEM exige a concentração de CO ₂ artificial de 5-10% e a concentração de CO ₂ do ar ambiente é muito menor.

5. Fome de Células

1. Coloque a câmara de incubação na platina do microscópio.
2. Aspirar o meio completo e lava-se com 2 ml de meio de inanição três vezes, para assegurar que não há aminoácidos de ter permanecido no meio DMEM, o qual irá eventualmente inibir a resposta autofagia; definir otemporizador ON.

6. Microscopia

1. Será necessário um sistema de imagem apropriado configurado para células vivas de campo amplo epi-fluorescência. Isto irá tipicamente compreender uma armação de microscópio invertido de grau de pesquisa, uma intensa largo espectro fonte de luz, espelhos e filtros específicos para a proteína fluorescente (s) / corante (s) de interesse, uma lente objectiva de alta qualidade, um CCD sensível / scmos câmera e uma câmara de incubação. Todos os principais fabricantes de microscópios oferecer sistemas wide-campo completo apropriado para imagens de células vivas, mas também é possível em casa construir um sistema com componentes de uma variedade de fabricantes e controlá-lo usando o software de código aberto, como Micro-Manager ( http: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki / ). O aspecto mais importante na nossa opinião é a utilização de um sistema de alta sensibilidade de modo que os níveis de expressão dos repórteres fluorescentes pode ser mantido a um mínimo.
2. Selecting as células apropriadas para a imagem.
   1. Seleccionar as células grandes e planas que permitam a formação de eventos mais autophagosome a ser capturado. Além disso, optar por células que já começou a produzir um maior número de omegasomes.
   2. Iniciar a captura vídeo após 30 min ou bem em resposta autofagia, a fim de captar um rácio maior de eventos de formação autophagosome por vídeo.
3. Imaging.
   1. Use uma lente de grande aumento (100x 1.4 NA).
   2. Ajustar a intensidade da luz de excitação para 10-20% do máximo, para evitar foto-branqueamento.
   3. Defina a câmara (Hamamatsu ORCA ER, tamanho do pixel 6,45 mm) a exposição 100-500 ms, binning 2x2 e 100 de ganho.
   4. Definir a taxa de aquisição de imagem para um quadro a cada 10 seg.

7. Criando montagens de Eventos Formação autophagosome com ImageJ

[Isto pode ser feito de uma forma não sistemática, basta digitalizar o vídeo incorporado pela eaberturas de interesse, mas também pode ser sistematizado, conforme descrito abaixo.]

1. Abertas as pilhas de imagem para a 3 (ou 2) capturou canais em ImageJ / Fiji.
2. Aplicar verde, vermelho e azul LUT (tabelas de pesquisa) para o canal correspondente; fundir três cores e salvar.
3. Na guia Analisar, selecione Ferramentas> ROI gerente ... > Especifique, em seguida, selecione uma área aleatória de tamanho definido na primeira imagem da pilha.
4. A partir da guia Imagem, selecione duplicar, a fim de duplicar a área selecionada da pilha.
5. A partir da guia Imagem, selecione Pilhas> Faça montagem ... para criar uma montagem experimental que contém todos os quadros capturado. Verificar todos os quadros na montagem de um evento completo formação autophagosome; manter notas do primeiro e do último quadro do evento.
6. Na guia Analisar, selecione Ferramentas> ROI gerente ... seleccionar a mesma área na primeira imagem da pilha para as outras duas cores, bem como para a imagem de cores resultante da fusão e pilhas duplicado.
7. De tele guia Arquivo, selecione Novo> Imagem e defina a largura de acordo com o número de pixels inicialmente selecionados usando o gerenciador de ROI, estabelecidos para a altura quatro vezes a altura definida no gerenciador de ROI mais 3 pixels de espaço entre as três cores e as se fundiram, e definir fatias como o número de quadros em cada pilha.
8. A partir da guia Imagem, selecione Pilhas> Ferramentas> Inserir ..., em seguida, insira cada um sub-stack em cima da outra, deixando um espaço de 1 pixel no meio.
9. A partir da guia Imagem, selecione Pilhas> Faça montagem ... para criar uma montagem e acabamento de partida com o primeiro e o último quadro do evento formação autophagosome capturado.

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Resultados

No protocolo descrito, utilizou-se microscopia de lapso de tempo a seguir a localização de PCP marcado com LC3 numa linha de células que expressam estavelmente GFP DFCP1, sob condições indutoras autofagia. O resultado desta experiência é a captura de duas séries ou pilhas de imagens, uma do verde e uma do canal azul, correspondentes a GFP-DFCP1 e CFP-LC3. Analisamos ainda mais esses vídeos usando ImageJ, a fim de criar montagens correspondentes a eventos únicos formação autophagosome, conforme descrito na se...

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Discussão

O método descrito neste protocolo permite a visualização da localização de uma proteína durante a formação autophagosome. Temos tentado vários métodos de visualização dos eventos descritos incluindo ponto-de varredura confocal, disco giratório confocal e microscopia de fluorescência Total Internal Reflection (TIRF). Descobrimos que para fins gerais padrão de campo amplo epi-fluorescência oferece o melhor compromisso entre a sensibilidade ea resolução. Isso garante bom sinal para ruído, photo-bleaching...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	41965
OptiMEM I	Invitrogen	31985-062
MitoTracker Red FM	Invitrogen	M22425
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Applied Science	6365787001
22 mm coverslips	VWR	631-0159
35 mm plates	Fisher NUNC	153066
Silicon grease	RS Components Ltd.	RS 494-124
O-rings			Custom made
Attofluor Cell Chamber	Invitrogen	A-7816	Suggested alternative to custom-made O-rings
Microscope	Olympus	IX81	Inverted microscope
Objective	Olympus	UPLSAPO 100XO	N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5
Camera	Hamamatsu	ORCA-R2 C10600 10B	Progressive scan interline CCD
Illuminator	TILL Photonics	Polychrome V	Ultrafast monochromator
Incubation chamber	Solent Scientific	Cell^R IX81
Software	Olympus	SIS xcellence