Vivre imagerie cellulaire de l'autophagie premiers événements: Omegasomes et au-delà

Résumé

Microscopie time-lapse de marqueurs de l'autophagie marquées par fluorescence permet le suivi de la réponse de l'autophagie dynamique avec une haute résolution temporelle. Utilisation de l'autophagie spécifique et marqueurs organites dans une combinaison de 3 couleurs différentes, nous pouvons suivre la contribution d'une protéine à la formation autophagosome dans un contexte spatial et temporel robuste.

Résumé

Autophagy est une réponse cellulaire déclenchée par le manque de nutriments, en particulier de l'absence d'acides aminés. Autophagy est définie par la formation de structures à double membrane, appelée autophagosomes, qui séquestrent cytoplasme, des protéines à vie longue et des agrégats de protéines, des organites défectueux, et même les virus ou les bactéries. Autophagosomes finalement fusionnent avec les lysosomes entraînant une dégradation majeure partie de leur contenu, les éléments nutritifs produits recyclés vers le cytoplasme. Par conséquent, l'autophagie est essentielle pour l'homéostasie cellulaire, et des dérèglements de l'autophagie peut conduire à la maladie, notamment la neurodégénérescence, le vieillissement et le cancer.

Autophagosome formation est un processus très complexe, pour lequel les cellules ont alloué un groupe spécifique de protéines, appelées les machines de l'autophagie de base. Le mécanisme de l'autophagie de base est complété par des protéines fonctionnellement supplémentaires impliquées dans divers processus cellulaires, par exemple dans membrane trafic, en biologie mitochondriale et lysosomale. La coordination de ces protéines pour la formation et la dégradation des autophagosomes constitue la réponse très dynamique et sophistiqué de l'autophagie. Imagerie de cellules vivantes permet de suivre la contribution moléculaire de chaque protéine autophagie liée vers le bas au niveau d'un seul événement de formation autophagosome et en temps réel, par conséquent, cette technique offre une résolution temporelle et spatiale.

Ici, nous utilisons une lignée cellulaire exprimant de façon stable GFP-DFCP1, d'établir un contexte spatial et temporel pour notre analyse. DFCP1 marques omegasomes, qui sont des structures précurseurs conduisant à la formation de autophagosomes. Une protéine d'intérêt (POI) peut être marqué d'une croix rouge ou marqueur fluorescent cyan. Différents organelles, comme la ER, les mitochondries et les lysosomes, sont tous impliqués dans les différentes étapes de formation autophagosome, et peuvent être marqués en utilisant un colorant de traçage spécifique. Microscopie time-lapse de autophagy dans ce dispositif expérimental, permet aux informations d'être extrait de la quatrième dimension, c'est à dire le temps. Ainsi, nous pouvons suivre la contribution du POI à l'autophagie dans l'espace et le temps.

Introduction

L'autophagie est un processus très dynamique, ce qui nécessite la coordination d'un grand nombre de protéines pour le résultat final de formation autophagosome ^1-3. La microscopie est probablement la technique la plus couramment utilisée pour étudier l'autophagie ^4. La localisation de la plupart des protéines autophagie a été étudiée dans des cellules fixées, tant par immuno-coloration des protéines endogènes et par l'expression de protéines marquées par fluorescence exogène. En outre, la microscopie électronique (EM), seul et en combinaison avec l'étiquetage immuno-or, a décrit les détails les plus fins de ces structures ^5,6. Malgré le fait que ces techniques ont mis en place notre compréhension de la formation autophagosome dans les 3 dimensions de l'espace, ils n'ont pas réussi à fournir une quantité suffisante d'informations sur la 4 ^ème dimension - le temps. Imagerie des cellules vivantes surmonte cet obstacle car il permet de suivre la formation d'un autophagosome aussi proche que possibleble en temps réel ^7. Cette technique a été employée la première à étudier l'autophagie par Yoshimori et ses collègues ^8, et a été de plus en plus recours à l'avenir.

Microscopie time-lapse capte la localisation du point d'intérêt dans des cellules vivantes et sur une période de temps. En comparant ces informations avec un autophagie bien caractérisé et / ou organite marqueur, l'analyse de l'imagerie des cellules vivantes peut mettre le POI dans le contexte spatial et temporel plus élevé de formation autophagosome. Analyse d'imagerie de cellules vivantes sont basées sur la saisie répétitive de la localisation de points d'intérêt le long de toutes les étapes de la formation autophagosome, tandis que l'imagerie de cellules fixées sont basées sur une seule prise. Par conséquent, imagerie des cellules vivantes peut prouver la contribution du POI à des étapes spécifiques de formation autophagosome, tandis que l'imagerie des cellules fixes ne peut assumer le rôle de POI, en fonction de sa localisation moyenne dans de nombreux autophagosomes capturées simultanément à différents stades de leur lifecycle.

Bien que l'imagerie des cellules vivantes est une méthode de puissance analytique de haut, il a quelques limitations inhérentes, qui devraient être prises en considération. Tout d'abord, l'imagerie de cellules vivantes nécessite l'expression d'une ou plusieurs protéines marquées par fluorescence exogène. Marqueurs fluorescents ont tendance à être de grande taille et ils peuvent parfois modifier le comportement d'une protéine pour des raisons stériques. Cette situation est accentuée pour des protéines membranaires, comme ils ont besoin pour fonctionner dans l'espace limité des 2 dimensions de membranes. Fait à noter, autophagosomes sont des structures membraneuses, et en conséquence leur formation nécessite un grand nombre de protéines associées à la membrane.

Une autre série de problèmes est lié aux niveaux d'expression de la PI. En principe, une protéine exogène doit être exprimée à des niveaux comparables à la protéine endogène. Cela garantit que les régulateurs importants de sa localisation sub-cellulaire ne seront pas saturés, et eanalyse des e sera biologiquement pertinent. En outre, la surexpression de protéines autophagie doit être évitée, car quand ils sont exprimés au-dessus des niveaux endogènes, ils ont tendance à inhiber la réponse autophagie ^9. En revanche, puisque les niveaux d'expression de la POI doit être suffisamment élevé pour permettre de suivre sa localisation pour une bonne période de temps sans photo-blanchiment, un compromis doit être atteint. Atteindre les niveaux d'expression optimale d'une protéine exogène dans les cellules mammifères nécessite beaucoup de réglage fin, mais il est possible en établissant et de criblage des lignées cellulaires exprimant de façon stable différents niveaux du POI.

La résolution spatiale qui peut être réalisé avec la microscopie à fluorescence standard est un autre facteur limitant. Résolution peut être limitée à un certain nombre de raisons, mais, au mieux, la résolution latérale sera autour de 250 nm. Cela signifie que tous les objets séparés par une distance inférieure à ce apparaîtront connecté (ou comme une seuleobjet) et des objets plus petits que 250 nm seront représentés dans l'image plus grande que ce qu'ils sont réellement. Par conséquent images doivent toujours être interprétés avec cela à l'esprit et des techniques complémentaires telles que l'EM seront nécessaires pour résoudre les petits détails ultra-structurelle.

Enfin, l'imagerie de cellules vivantes nécessite intrinsèquement exposition d'une cellule à la lumière, éventuellement pendant une période de temps prolongée. Cela peut modifier les réponses physiologiques d'une cellule, un phénomène connu sous le nom de photo-toxicité.

Nous avons utilisé avec succès imagerie des cellules vivantes de la protéine PI3P contraignant DFCP1 de décrire pour la première fois que autophagosomes proviennent de PI3P riches en structures en forme d'anneau omegasomes appelés, qui sont en étroite association avec ER brins ^10,11. Nous avons clairement montré que les structures LC3-positifs commencent à se former en association étroite avec omegasomes. Nous suggérons ici que l'utilisation d'une lignée cellulaire stable exprimant la GFP-DFCP1 pour la cellule en directimagerie de la protéine d'intérêt, établit un cadre spatial et temporel robuste pour la caractérisation de son rôle dans la formation autophagosome.

Protocole

1. Préparation des cellules

1. Seed faible nombre de passages des cellules HEK-293T exprimant de façon stable GFP-DFCP1 22 lamelles rondes mm, les cellules de culture de la nuit dans du milieu de Dulbecco modifié Eagles (DMEM), à une confluence de 30-40% (objectif pour une confluence de 80% après 2 jours - jour de l'imagerie des cellules vivantes).

2. La transfection cellulaire

1. Préparer le mélange complexe de transfection pour chaque plaque, contenant 100 ul OptiMEM j'ai réduit un milieu sans sérum, 3 pi X-tremeGENE 9 ADN réactif de transfection, et 0,5 ug de pECFP-LC3 ADN plasmidique. Mélanger doucement par pipetage de haut en bas et incuber 15 min à température ambiante. [Note: Nous avons constaté à plusieurs reprises que d'autres réactifs de transfection, comme Lipofectamine 2000 ont beaucoup de toxicité, et, en plus, ils produisent des particules fluorescentes sur leur propre qui interfèrent avec de nombreuses techniques de microscopie.]
2. Aspirer le milieu des assiettes et ajouter DMEM frais préchauffé à 37 ° C.
3. Ajouter le transfection complexe de cellules par pipetage, les cellules incuber pendant 24 heures.

3. L'incubation des cellules avec le marqueur Organelle (Facultatif)

1. Ajouter Mitotracker / Lysotracker de DMEM à une concentration finale de 75 nM, et garder sur la glace, dans un tube falcon recouverts d'une feuille d'aluminium, le long de toute la journée d'expérimentation, d'éviter l'exposition lumière et du gel répétitif et dégel.
2. Retirer une aliquote de 2 ml de la contenant Lysotracker moyen de Mitotracker / et réchauffer à 37 ° C; moyen aspiration de cellules transfectées et les remplacer par Mitotracker / Lysotracker milieu contenant les cellules et incuber pendant 30 - 60 min.

4. Préparation de la chambre d'incubation pour l'imagerie de cellules vivantes (Figure 1)

1. Propreté métal et plastique des joints toriques avec 75% d'éthanol et d'appliquer de la graisse de silicone sur le pourtour de l'anneau torique métallique.
2. En utilisant des pinces supprimer la lamelle de la plaque et sécher l'excédent de milieu de la face inférieure de la lamelle couvre-objet,pour éviter de mélanger trop de moyenne avec de la graisse, car cela va augmenter la probabilité de fuite.
3. Laisser la lamelle couvre-objet pour reposer sur le rebord de l'anneau torique en matière plastique et en forme le joint torique métallique sur le dessus du joint torique en matière plastique, avec la lamelle prise en sandwich entre les deux, afin de créer une enceinte fermée.
4. Remplir la chambre avec le milieu de la plaque et de ce point et encore, d'éviter une incubation prolongée des cellules dans du milieu DMEM sans un agent tampon, pour éviter des changements de pH à produire, en tant que système de tampon de bicarbonate de DMEM nécessite artificielle concentration en CO ₂ de 5 à 10% et la concentration en CO ₂ de l'air ambiant est beaucoup plus faible.

5. La famine des cellules

1. Mettre la chambre d'incubation sur la platine du microscope.
2. Aspirer le milieu complet et laver avec 2 ml de milieu de famine 3 fois, pour s'assurer qu'aucun acides aminés sont restés dans le DMEM, qui finira par inhiber la réponse autophagie; régler l'minuterie ON.

6. Microscopie

1. Un système d'imagerie approprié configuré pour cellules vivantes grand champ épi-fluorescence sera nécessaire. Cela comprendra typiquement un cadre de microscope inversé la recherche de qualité, une intense large spectre de rayonnement synchrotron, miroirs et de filtres spécifiques pour la protéine fluorescente (s) / colorant (s) d'intérêt, un objectif de haute qualité, d'un capteur CCD sensible / sCMOS caméra et une chambre d'incubation. Tous les principaux fabricants de microscopes offrent des systèmes à grand champ complètes approprié pour l'imagerie des cellules vivantes, mais il est également possible de la maison à construire un système utilisant des composants à partir d'une variété de fabricants et de contrôler à l'aide de logiciels open source tels que Micro-Manager ( http: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki / ). L'aspect le plus important à nos yeux est d'utiliser un système d'une grande sensibilité ainsi que les niveaux d'expression des journalistes fluorescents peuvent être réduites au minimum.
2. Selète les cellules appropriées à l'image.
   1. Sélectionnez les cellules larges et plats qui permettront aux événements de formation plus autophagosome d'être capturés. En outre, opter pour des cellules qui ont déjà commencé à produire un plus grand nombre de omegasomes.
   2. Démarrer la capture vidéo après 30 min ou bien en réponse autophagie, afin de capter une plus grande proportion d'événements de formation autophagosome par vidéo.
3. Imaging.
   1. Utilisez un objectif à fort grossissement (100x 1,4 NA).
   2. Ajuster l'intensité de la lumière d'excitation à 10-20% du maximum afin d'éviter de photo-blanchiment.
   3. Réglez l'appareil photo (Hamamatsu ORCA ER, la taille de pixel 6,45 um) à 100-500 ms exposition, binning 2x2 et 100 de gain.
   4. Réglez la vitesse d'acquisition d'image à 1 image toutes les 10 sec.

7. Création Montages de autophagosome Formation événements avec ImageJ

[Cela peut être fait de manière non systématique en scannant simplement la vidéo fusionnée pour eévents d'intérêt, mais il peut aussi être systématisé comme indiqué ci-dessous.]

1. Piles d'images ouvertes pour le 3 (ou 2) capturés canaux dans ImageJ / Fidji.
2. Appliquer vert, rouge et bleu LUT (tables de correspondance) sur le canal correspondant; fusionner 3 couleurs et économisez.
3. Dans l'onglet Analyser, sélectionner Outils> ROI gestionnaire ... > Définir, puis sélectionnez une zone aléatoire de taille définie dans la première image de la pile.
4. Dans l'onglet Image, sélectionnez deux exemplaires, afin de dupliquer la zone sélectionnée de la pile.
5. Dans l'onglet Image, sélectionnez Piles> Assurez-montage ... pour créer un montage provisoire contenant toutes les trames capturées. Analyser tous les cadres dans le montage d'un événement complete de formation autophagosome; conserver des notes de la première et la dernière image de l'événement.
6. Dans l'onglet Analyser, sélectionner Outils> ROI gestionnaire ... sélectionner la même zone dans la première image de la pile pour les deux autres couleurs, ainsi que pour l'image de couleurs fusionnée et dupliquer des piles.
7. De til onglet Fichier, sélectionnez Nouvelle> Image et définir la largeur en fonction du nombre de pixels initialement sélectionnés à l'aide du gestionnaire ROI, prévu pour une hauteur de 4 fois la hauteur définie dans le gestionnaire ROI plus 3 pixels pour l'espace entre les 3 couleurs et les Tranches fusionné, et défini comme le nombre de cadres dans chaque pile.
8. Dans l'onglet Image, sélectionnez Piles> Outils> Insérer ..., puis insérez chaque sous-pile les uns sur les autres, en laissant un espace de 1 pixel entre les deux.
9. Dans l'onglet Image, sélectionnez Piles> Assurez-montage ... pour créer un montage de départ et de finition avec la première et la dernière image de l'événement de formation autophagosome capturée.

Résultats

Dans le protocole décrit, nous avons utilisé la microscopie time-lapse de suivre la localisation de CFP-étiqueté LC3 dans une lignée cellulaire exprimant de façon stable GFP-étiquetée DFCP1, dans des conditions d'induction de l'autophagie. Le résultat de cette expérience est la capture de 2 séries ou piles d'images, l'une du vert et l'autre du canal bleu, correspondant à la GFP-DFCP1 et CFP-LC3. Nous avons également analysé ces vidéos en utilisant ImageJ, afin de créer des montages co...

Discussion

La méthode décrite dans ce protocole permet la visualisation de la localisation d'une protéine pendant la formation autophagosome. Nous avons essayé différentes méthodes de visualisation des événements décrits, y compris point confocale à balayage, la filature disque confocale et Total Internal Reflection Fluorescence de la route (FRBR) de microscopie. Nous avons constaté que pour les fins générales de norme à grand champ épi-fluorescence offre le meilleur compromis entre la sensibilité et la résolu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	41965
OptiMEM I	Invitrogen	31985-062
MitoTracker Red FM	Invitrogen	M22425
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Applied Science	6365787001
22 mm coverslips	VWR	631-0159
35 mm plates	Fisher NUNC	153066
Silicon grease	RS Components Ltd.	RS 494-124
O-rings			Custom made
Attofluor Cell Chamber	Invitrogen	A-7816	Suggested alternative to custom-made O-rings
Microscope	Olympus	IX81	Inverted microscope
Objective	Olympus	UPLSAPO 100XO	N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5
Camera	Hamamatsu	ORCA-R2 C10600 10B	Progressive scan interline CCD
Illuminator	TILL Photonics	Polychrome V	Ultrafast monochromator
Incubation chamber	Solent Scientific	Cell^R IX81
Software	Olympus	SIS xcellence