Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Zusammenfassung

Zeitraffer-Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Autophagie Marker erlaubt die Überwachung der dynamischen Autophagie Reaktion mit hoher zeitlicher Auflösung. Mit spezifischen Autophagie und Organellen Marker in einer Kombination aus 3 verschiedenen Farben, können wir folgen den Beitrag eines Proteins an Autophagosom Bildung in einem robusten räumlichen und zeitlichen Kontext.

Zusammenfassung

Autophagy eine zelluläre Antwort durch das Fehlen von Nährstoffen, insbesondere das Fehlen von Aminosäuren ausgelöst. Autophagie wird durch die Bildung von Doppel-Membran-Struktur, genannt Autophagosomen, das Zytoplasma, langlebigen Proteinen und Protein-Aggregate, fehlerhafte Organellen und sogar Viren oder Bakterien absondern definiert. Autophagosomen schließlich mit Lysosomen, die zu Masse Verschlechterung ihrer Inhalte zu verschmelzen, wobei die Nährstoffe erzeugt werden zurück in das Zytoplasma zurückgeführt. Daher ist von entscheidender Bedeutung für Autophagie Zellhomöostase und Fehlregulation von Autophagie kann zu Krankheiten, vor allem Neurodegeneration, Alterung und Krebs führen.

Autophagosom Bildung ist ein sehr aufwendiges Verfahren, bei denen Zellen haben eine bestimmte Gruppe von Proteinen, die so genannte Kern Autophagie Maschinen zugeordnet. Der Kern Autophagie Maschinen funktional durch zusätzliche Proteine ​​in verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt ergänzt, z. B. in membrane Menschenhandel in der mitochondrialen und lysosomalen Biologie. Die Koordination dieser Proteine ​​für die Bildung und den Abbau von Autophagosomen bildet den hochdynamischen und anspruchsvolle Reaktion der Autophagie. Live Cell Imaging ermöglicht es, die molekularen Beitrag jedes Autophagie-related protein folgen bis auf die Ebene eines einzelnen Autophagosom Bildung Veranstaltung und in Echtzeit, daher bietet diese Technik eine hohe zeitliche und räumliche Auflösung.

Hier verwenden wir eine Zelllinie stabil exprimieren GFP-DFCP1, um einen räumlichen und zeitlichen Kontext für unsere Analyse zu etablieren. DFCP1 Marken omegasomes, die Vorläufer-Strukturen führt zu Autophagosomen Bildung sind. Ein Protein von Interesse (POI) kann entweder mit einem roten oder cyan fluoreszierenden Marker markiert werden. Verschiedene Organellen, wie ER, Mitochondrien und Lysosomen, sind alle in verschiedenen Schritten Autophagosom Bildung beteiligt und können markiert mit einem bestimmten Farbstoff tracker werden. Zeitraffer-Mikroskopie autophagy in diesem experimentellen Aufbau, ermöglicht es, Informationen über die vierte Dimension, dh extrahiert werden. Daher können wir folgen den Beitrag des POI in Raum und Zeit Autophagie.

Einleitung

Autophagie ist ein sehr dynamischer Prozess, der die Koordination einer Vielzahl von Proteinen für das Endergebnis von ^1-3 Autophagosom Bildung erfordert. Mikroskopie ist wahrscheinlich die Technik am häufigsten für das Studium Autophagie ⁴ angelegt. Die Lokalisierung der meisten autophagy Proteine ​​wurde ausführlich in fixierten Zellen untersucht, sowohl durch Immunfärbung der endogenen Proteinen und durch die Expression von exogenen fluoreszenzmarkierten Protein. Darüber hinaus hat Elektronenmikroskopie (EM), allein und in Kombination mit Immun-Gold-Kennzeichnung, die feinen Details dieser Strukturen ^5,6 beschrieben. Trotz der Tatsache, dass diese Techniken haben unser Verständnis der Autophagosom Bildung in den 3 Dimensionen des Raumes gegründet, haben sie es versäumt, ausreichende Menge an Informationen über die ^4. Dimension geben - Zeit. Live Cell Imaging überwindet diese Barriere, wie es im Anschluss an die Bildung einer Autophagosom so nah wie möglich erlaubtble in Echtzeit ^7. Diese Technik wurde erstmals eingesetzt, um durch Autophagie Yoshimori und Kollegen ⁸ zu studieren, und wurde fortan zunehmend genutzt.

Zeitraffer-Mikroskopie fängt die Lokalisation des POI in lebenden Zellen und über einen Zeitraum von Zeit. Durch den Vergleich dieser Informationen mit einem gut charakterisierten Autophagie und / oder Organellen Marker können Live Cell Imaging Analyse des POI in der größeren räumlichen und zeitlichen Kontext Autophagosom Bildung setzen. Live Cell Imaging Analyse basiert auf der wiederholten Erfassung des POI Lokalisation entlang aller Schritte Autophagosom Bildung basiert, während Bildgebung von fixierten Zellen auf einer einzigen Erfassung beruht. Daher kann Live Cell Imaging beweisen den Beitrag des POI in bestimmten Schritten Autophagosom Bildung, während Bildgebung von fixierten Zellen nur annehmen, kann die Rolle der POI, basierend auf den durchschnittlichen Lokalisation in vielen Autophagosomen gleichzeitig gefangen in den verschiedenen Phasen ihres Lifecyclecle.

Obwohl Live Cell Imaging ist eine Methode der hohe analytische Leistung, hat es einige inhärente Beschränkungen, die in Betracht gezogen werden sollte. Zunächst erfordert lebenden Zellen die Expression eines oder mehrerer exogener fluoreszenzmarkierten Proteinen. Fluoreszierenden Markierungen sind in der Regel in der Größe groß und können manchmal verändern das Verhalten eines Proteins durch sterische Gründe. Diese Situation ist für Membranproteine ​​akzentuiert, wie sie in den begrenzten Raum der 2 Dimensionen von Membranen funktionieren müssen. Zu beachten ist, sind Autophagosomen membranösen Strukturen und dementsprechend ihre Bildung erfordert eine große Anzahl von Membran-assoziierten Proteinen.

Weitere Probleme mit der Expression des POI verbunden. Grundsätzlich sollte ein exogenes Protein auf einem Niveau vergleichbar mit dem endogenen Protein exprimiert werden. Dadurch wird sichergestellt, dass wichtige Regulatoren der sub-zelluläre Lokalisation nicht gesättigt, und the Analyse wird biologisch relevant. Darüber hinaus sollte die Überexpression von Autophagie Proteine ​​vermieden werden, da, wenn sie über den endogenen ausgedrückt werden, sie den Autophagie Antwort ⁹ hemmen neigen. Umgekehrt, da die Expression des POI sollte hoch genug sein, um nach ihrer Lokalisation für eine gute Zeit ohne Fotobleichen ermöglichen, muss ein Kompromiss erzielt werden. Das Erreichen der optimalen Expression eines exogenen Protein in Säugern Zellen erfordert eine Menge Feinabstimmung, aber es ist machbar durch die Errichtung und Screening-Zelllinien stabil exprimiert verschiedenen Ebenen des POI.

Die räumliche Auflösung, die mit Standard-Fluoreszenz-Mikroskopie erreicht werden kann, ist ein weiterer limitierender Faktor. Auflösung kann für eine Reihe von Gründen begrenzt ist, sondern bestenfalls laterale Auflösung wird etwa 250 nm liegen. Dies bedeutet, dass alle Objekte in einem Abstand kleiner als dieser getrennt erscheint verbunden (oder als eine einzigeObjekt) und Objekte, die kleiner als 250 nm wird in das Bild größer als sie tatsächlich sind vertreten. Daher Bilder sollten immer in diesem Sinne interpretiert werden und ergänzende Techniken wie EM wird benötigt, um ultra-feine strukturelle Details zu klären.

Schließlich lebenden Zellen von Natur erfordert Aussetzen einer Zelle, um Licht, möglicherweise über einen längeren Zeitraum. Dies hat Auswirkungen auf die physiologischen Reaktionen einer Zelle, ein Phänomen, das als Phototoxizität bekannt.

Wir haben erfolgreich Live Cell Imaging der PI3P-binding protein DFCP1 verwendet, um zum ersten Mal, dass Autophagosomen von PI3P-reich ring-ähnlichen Strukturen bezeichnet omegasomes, die in enger Zusammenarbeit mit ER Stränge ^10,11 sind stammen beschreiben. Wir haben klar gezeigt, dass LC3-positiven Strukturen bilden in enger Zusammenarbeit mit omegasomes starten. Wir vermuten, dass hier unter Verwendung einer Zelllinie stabil exprimieren GFP-DFCP1 für die lebenden ZellenAbbildung des interessierenden Proteins, wurde eine stabile räumliche und zeitliche Rahmen für die Charakterisierung ihrer Rolle in Autophagosom Bildung.

Protokoll

1. Zellpräparation

1. Seed niedrigen Durchgang Zahl der HEK-293T-Zellen, die GFP-DFCP1 auf 22 mm runde Deckgläser, Kultur Zellen über Nacht in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), bis zu einer Konfluenz von 30-40% (Ziel für eine Konfluenz von 80% nach 2 Tage - Tag des Live Cell Imaging).

2. Zelltransfektion

1. Bereiten Sie die Transfektion komplexe Mischung für jede Platte, die 100 ul OptiMEM I reduziert Serummedium, 3 ul X-tremeGENE 9 DNA-Transfektionsreagenz und 0,5 ug pECFP-LC3-Plasmid-DNA. Vorsichtig mischen durch Auf-und Abpipettieren und Inkubation 15 min bei Raumtemperatur. [Anmerkung: Wir haben immer wieder festgestellt, dass andere Transfektionsreagenzien wie Lipofectamine 2000 eine Menge von Toxizität aufweisen, und darüber hinaus, sie produzieren fluoreszierende Partikel auf ihre eigenen, die mit vielen Mikroskopie-Techniken stören.]
2. Saugen Sie das Medium von den Platten und fügen Sie frisches DMEM vorgewärmt auf 37 ° C.
3. Fügen Sie den transfection komplex, um Zellen durch Pipettieren; inkubieren Zellen für 24 Stunden.

3. Handy Inkubation mit dem Organell Marker (Optional)

1. In MitoTracker / Lysotracker zu DMEM in einer Endkonzentration von 75 nM, und halten auf dem Eis, in einem Falcon-Röhrchen mit Alufolie bedeckt, entlang der gesamten experimentellen Tag, um Belichtung und Wiederholtes Auftauen und Einfrieren Zyklen zu vermeiden.
2. Entfernen Sie ein Aliquot von 2 ml des MitoTracker / Lysotracker-haltigem Medium und Aufwärmen bei 37 ° C; absaugen Medium von transfizierten Zellen und ersetzen mit MitoTracker / Lysotracker-haltigem Medium und Inkubation Zellen für 30 - 60 min.

4. Vorbereitung der Inkubation Kammer für das Live Cell Imaging (Abbildung 1)

1. Sauberkeit Metall und Kunststoff O-Ringe mit 75% Ethanol und gelten Silikonfett auf dem Rand der Metall-O-Ring.
2. Mit einer Pinzette entfernen das Deckglas an die Platte und Trocknen der überschüssigen Mediums von der unteren Seite des Deckglases,zu vermeiden Mischen zu viel Medium mit dem Fett, da dies die Wahrscheinlichkeit erhöhen, von Leckagen.
3. Lassen Sie das Deckglas auf dem Sims der Kunststoff-O-Ring ruhen und den O-Ring auf der Oberseite des Kunststoff-O-Ring, mit dem Deckglas dazwischen eingefügt ist, um eine geschlossene Kammer zu schaffen.
4. Nachfüllen Kammer mit dem Medium von der Platte, von diesem Punkt und vermeiden längerer Inkubation der Zellen in DMEM-Medium ohne Puffer, um Änderungen in pH verhindern zu rechnen, da das Bicarbonat-Puffersystem DMEM erfordert künstliche CO _{2-Konzentration} von 5-10% und die CO _{2-Konzentration} der Umgebungsluft ist viel geringer.

5. Verhungern der Zellen

1. Setzen Sie den Inkubationsraum am Mikroskop Bühne.
2. Saugen Sie das komplette Medium und waschen mit 2 ml Hungermedium 3 mal, um sicherzustellen, dass keine Aminosäuren aus dem DMEM, die schließlich hemmen die Autophagie Antwort geblieben, setzen dieTimer ON.

6. Mikroskopie

1. Ein geeignetes Abbildungssystem für lebende Zelle Weitfeld-Auflicht-Fluoreszenz konfiguriert erforderlich. Dies wird typischerweise eine Forschunggrad inversen Mikroskop Rahmen eine intensive Breitspektrum-Lichtquelle, Spiegel und Filter spezifisch für das fluoreszierende Protein (e) / Farbstoff (e) von Interesse, eine hohe Qualität Objektivlinse, einem empfindlichen CCD / sCMOS Kamera und eine Inkubation Kammer. Alle großen Hersteller bieten komplette Mikroskop Weitfeld-Systeme geeignet für Live Cell Imaging, aber es ist auch möglich, nach Hause zu-bauen ein System mit Komponenten aus einer Vielzahl von Herstellern und steuern es mit Open-Source-Software wie Micro-Manager ( http: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki / ). Der wichtigste Aspekt in unserer Meinung ist, ein System mit hoher Empfindlichkeit zu verwenden, so dass Expression der fluoreszierenden Reporter auf ein Minimum reduziert werden können.
2. Selecting die entsprechenden Zellen auf Bild.
   1. Wählen Sie große und flache Zellen, die damit mehr Autophagosom Bildung Ereignisse erfasst werden. Auch bei Zellen, die bereits begonnen haben, Erzeugen einer größeren Anzahl von omegasomes entscheiden.
   2. Rufen Sie die Videoaufnahme nach 30 min oder auch in Autophagie Reaktion, um ein größeres Verhältnis von Bildung Autophagosom Ereignisse per Video festzuhalten.
3. Imaging.
   1. Verwenden Sie eine hohe Vergrößerung Linse (100x 1.4 NA).
   2. Stellen Sie die Intensität von Anregungslicht auf 10-20% der maximalen zu Fotobleichen verhindern.
   3. Stellen Sie die Kamera (Hamamatsu ORCA ER, Pixelgröße 6,45 um) 100-500 ms Belichtung, 2x2 Binning und 100 Gewinn.
   4. Stellen Sie die Bildaufnahme Rate auf 1 Frame alle 10 Sekunden.

7. Erstellen von Montagen Autophagosom Formation Events mit ImageJ

[Dies kann in einer nicht-systematischen Weise durch einfaches Scannen des fusionierten Video für e getan werdenLüftungsöffnungen von Interesse, aber es kann auch sein, systematisiert, wie unten beschrieben.]

1. Offene Bildstapeln für die 3 (oder 2) eingefangen Kanäle in ImageJ / Fiji.
2. Bewerben grün, rot und blau LUT (Lookup-Tabellen) auf den entsprechenden Kanal; fusionieren 3 Farben und sparen.
3. Von der Registerkarte Analysieren, wählen Sie Extras> ROI-Manager ... > Geben Sie, und wählen Sie dann einen zufälligen Bereich definierter Größe in dem ersten Bild des Stapels.
4. Von der Registerkarte Bild, wählen Sie duplizieren, um den ausgewählten Bereich des Stapels zu duplizieren.
5. Von der Registerkarte Bild, wählen Stacks> Make montage ... , eine vorläufige montage enthält erstellen alle Bilder eingefangen. Scannen Sie alle Frames in der Montage für eine komplette Autophagosom Bildung Ereignis; halten Noten des ersten und letzten Frame der Veranstaltung.
6. Von der Registerkarte Analysieren, wählen Sie Extras> ROI-Manager ... Wählen Sie die gleiche Fläche im ersten Bild des Stapels für die anderen 2 Farben sowie für die fusionierte Farben Bild und duplizieren Stacks.
7. Von ter Registerkarte Datei, wählen Sie Neu> Bild, und stellen Sie für die Breite nach der Anzahl der Pixel mit der ursprünglich ausgewählten ROI-Manager, für die Höhe eingestellt 4 mal die Höhe in der ROI-Manager eingestellt Pixel Plus 3 für Raum zwischen den 3 Farben und den zusammengeführt und stellen Slices als die Anzahl von Rahmen in jedem Stapel.
8. Von der Registerkarte Bild, wählen Stacks> Tools> Legen Sie ..., dann legen jedes Sub-Stapel eine über der anderen, so dass Raum 1 Pixel dazwischen.
9. Von der Registerkarte Bild, wählen Stacks> Make montage ... um eine Montage mit Start und Ziel mit dem ersten und letzten Frame des Autophagosom Bildung Ereignis erfasst erstellen.

Ergebnisse

In das Protokoll beschrieben, haben wir Zeitraffer-Mikroskopie verwendet, um die Lokalisierung von GFP-markierten LC3 in einer Zelllinie folgen stabil exprimieren GFP-markierten DFCP1 unter Autophagie induzierenden Bedingungen. Das Ergebnis dieses Experiments ist die Einnahme von 2-Serie oder Stapel von Bildern, einer aus der grünen und einer aus dem blauen Kanal, entsprechend GFP-DFCP1 und CFP-LC3. Wir haben weiterhin diese Videos analysiert mit ImageJ, um Montagen entsprechend einzigen Autophagosom Bildung Veranstalt...

Diskussion

Das Verfahren in diesem Protokoll beschrieben ermöglicht die Visualisierung von Lokalisation eines Proteins während Autophagosom Bildung. Wir haben verschiedene Methoden der Visualisierung die Ereignisse beschrieben, einschließlich Point-konfokalen, Spinning Disk konfokalen und Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie versucht. Wir haben festgestellt, dass für allgemeine Zwecke Standard Weitfeld-Auflicht-Fluoreszenz den besten Kompromiss zwischen Empfindlichkeit und Auflösung bietet. Dies gewährle...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	41965
OptiMEM I	Invitrogen	31985-062
MitoTracker Red FM	Invitrogen	M22425
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Applied Science	6365787001
22 mm coverslips	VWR	631-0159
35 mm plates	Fisher NUNC	153066
Silicon grease	RS Components Ltd.	RS 494-124
O-rings			Custom made
Attofluor Cell Chamber	Invitrogen	A-7816	Suggested alternative to custom-made O-rings
Microscope	Olympus	IX81	Inverted microscope
Objective	Olympus	UPLSAPO 100XO	N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5
Camera	Hamamatsu	ORCA-R2 C10600 10B	Progressive scan interline CCD
Illuminator	TILL Photonics	Polychrome V	Ultrafast monochromator
Incubation chamber	Solent Scientific	Cell^R IX81
Software	Olympus	SIS xcellence