초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

요약

찬란 autophagy에 마커의 시간 경과 현미경은 높은 시간적 해상도로 동적 autophagy에 응답을 모니터링 할 수 있습니다. 3 가지 색상의 조합으로 특정 자식 작용과 세포 기관 마커를 사용하여, 우리는 강력한 공간과 시간적 맥락에서 autophagosome 형성 단백질의 기여를 볼 수 있습니다.

초록

autophagy에 특히 영양소, 아미노산의 부재의 부족에 의해 발생 세포 반응이다. 자식 작용은 세포질, 수명이 긴 단백질도 단백질 집계, 결함이있는 세포 소기관, 바이러스 또는 박테리아를 격리 할 autophagosomes라는 이중 막 구조의 형성에 의해 정의됩니다. Autophagosomes 결국 생성 된 영양소가 세포질로 재활용되고 함께 자신의 콘텐츠를 대량으로 저하로 이어지는 리소좀과 융합. 따라서 자식 작용은 세포의 항상성을 위해 중요하고, 자식 작용의 조절 장애는 질병, 특히 신경 변성, 노화 및 암으로 이어질 수 있습니다.

Autophagosome 형성 세포가 핵심 autophagy에 기계라는 단백질의 특정 그룹을 할당 한되는, 매우 정교한 과정이다. 핵심 autophagy에 기계는 기능, 다양한 세포 과정에 관여 추가적인 단백질에 의해 보완 membran의 예입니다미토콘드리아와 리소좀 생물학 전자 매매. autophagosomes의 형성과 분해 이러한 단백질의 조정은 자식 작용의 매우 역동적이고 정교한 응답을 구성합니다. 라이브 셀 이미징 하나 하나 autophagosome 대형 이벤트의 수준으로 각 autophagy에 관련된 단백질의 분자 기여를 따라 할 수 있으며 실시간 따라서이 기술은 높은 공간적 해상도를 제공합니다.

여기에서 우리는 우리의 분석을위한 공간적 컨텍스트를 설정하기 위해, 안정적으로 GFP-DFCP1을 표현하는 세포 라인을 사용합니다. autophagosomes 형성에 선도적 인 전구체 구조입니다 DFCP1 마크 omegasomes. 관심 (POI)의 단백질은 적색 또는 청록색 형광 태그 하나와 함께 표시 할 수 있습니다. 미토콘드리아와 리소좀 ER 같은 다른 세포 소기관은, 모든 autophagosome 형성의 여러 단계에 관여하고 있으며, 특정 추적기 염료를 사용하여 표시 할 수 있습니다. AUTOP의 경과 현미경이 실험 세트 업의 hagy이 정보는 4 차원, 즉 시간에 대한 추출 할 수 있습니다. 따라서 우리는 공간과 시간에서 자식 작용하는 POI의 기여를 볼 수 있습니다.

서문

autophagy에 ^1-3 autophagosome 형성의 최종 결과에 대한 단백질의 다수의 조정을 필요로하는 매우 역동적 인 과정이다. 현미경은 아마도 가장 일반적으로 autophagy에 ⁴ 공부에 적용하는 기술이다. 대부분의 자식 작용 단백질의 지방화는 광범위하게 모두 내생 단백질을 면역 염색 및 형광 태그 외인성 단백질의 표현으로, 고정 세포에서 연구되어왔다. 또한, 전자 현미경 (EM), 혼자 면역 골드 라벨,와 함께 이러한 구조 ^5,6의 정밀한 세부 사항을 설명하고있다. 시간 -이 기술은 공간의 3 차원 autophagosome 형성에 대한 우리의 이해를 설립 있다는 사실에도 불구하고, 그들은 4 ^번째 차원에 대한 정보의 충분한 양을 제공하는 데 실패했다. 이 possi 가까이로 autophagosome의 형성에 따라 허용하는 라이브 셀 이미징이 장벽을 극복실시간 ⁷ BLE. 이 기술은 처음 요시모리와 동료 ^8로 자식 작용을 연구하기 위해 사용되었고, 점점 이제부터 사용되었습니다.

시간 경과 현미경은 살아있는 세포에서 POI의 시간의 기간 동안 현지화를 캡처합니다. 잘 특성화 자식 작용 및 / 또는 세포 소기관 마커로이 정보를 비교하여 라이브 셀 이미징 분석 autophagosome 형성의 큰 공간과 시간적 맥락에서 POI를 넣을 수 있습니다. 라이브 셀 이미징 분석 autophagosome 형성의 단계에 따라 POI 현지화의 반복적 캡처를 기반으로 고정 된 세포의 이미지가 하나의 캡처를 기반으로하는 동안.에게 고정 된 세포의 영상은 그들의 생명주기의 다른 단계에서 동시에 캡처 한 여러 autophagosomes에서의 평균 현지화에 기반 POI의 역할을 가정 할 수있는 동안 따라서, 라이브 셀 이미징, autophagosome 형성의 특정 단계에서 POI의 기여를 입증 할 수CLE.

라이브 셀 이미징 높은 분석력하는 방법이지만, 그것은 고려되어야 할 몇 가지 본질적인 한계를 가지고 있습니다. 첫째로 모두의, 라이브 셀 이미징은 하나 이상의 외래 찬란 단백질의 발현을 필요로합니다. 형광 태그의 크기가 큰 경향이 있으며 때로는 입체 이유로 단백질의 동작을 변경할 수 있습니다. 그들이 막 2 차원의 제한된 공간에서 작동하는 데 필요한만큼이 상황은, 막 단백질에 대한 강조된다. 참고로, autophagosomes는 막 구조이며, 그에 따라 형성 막 관련 단백질의 다수를 필요로합니다.

문제의 또 다른 세트는 POI의 발현 수준에 연결됩니다. 원칙적으로, 외인성 단백질은 내인성 단백질에 비해 수준에서 표현되어야한다. 이 하위 세포 지방화의 중요한 규제가 포화되지 않도록 보장하며, 일전자 분석은 생물학적으로 관련이있을 것입니다. 그들은 내생 수준 위에 표현 될 때, 그들은 autophagy에 응답 ^9을 억제하는 경향 또한, 자식 작용 단백질의 과발현은 피해야한다. 반대로, POI의 발현 이후 사진 표백하지 않고 시간의 좋은 기간에 대한 지역화에 따라 수 있도록 충분히 높아야한다, 타협에 도달 할 수있다. mammalians 세포에서 외인성 단백질의 최적 발현 수준을 달성하는 것은 미세 조정이 많이 필요하지만 안정적으로 POI의 다른 수준을 표현하는 세포 라인을 확립하고 심사에 의해 가능한 것입니다.

표준 형광 현미경으로 얻을 수있는 공간 해상도는 또 다른 제한 요인이다. 해상도는 이유로 제한 될 수 있습니다,하지만 기껏 수평 해상도는 250 nm의 주위에있을 것입니다. 이것은이보다 작은 거리로 구분하는 개체 (또는 단일로 연결 표시된다는 것을 의미합니다개체)와 250 nm의보다 작은 개체가 실제로보다 큰 이미지로 표현됩니다. 따라서 이미지는 항상 염두에두고 해석해야하고 EM 등의 보완 기술은 미세 매우 구조적 세부 사항을 확인해야합니다.

마지막으로, 라이브 셀 이미징은 본질적으로 오랜 기간 동안 잠재적으로, 빛에 세포를 노출해야합니다. 이 세포 사진 독성으로 알려진 현상​​의 생리적 반응을 변경할 수 있습니다.

우리는 성공적으로 autophagosomes는 ER 가닥 ^10,11과 밀접한 관계에있다 PI3P 풍부한 고리 같은 구조라고 omegasomes에서 발생하는 첫 번째 시간을 설명하는 PI3P 결합 단백질 DFCP1의 라이브 셀 이미징을 사용했습니다. 우리는 명확하게 LC3 양성 구조 omegasomes와 긴밀한 관계 형성을 시작하는 것으로 나타났습니다. 우리는 여기서 세포 라인을 채택하는 것은 안정적으로 라이브 셀 GFP-DFCP1을 표현하는 것이 좋습니다관심의 단백질의 영상은, autophagosome 형성에 역할의 특성에 대한 강력한 공간과 시간 프레임을 설정합니다.

프로토콜

1. 세포의 준비

1. (2 후 80 %의 confluency에 대한 목표 30-40%의 자랄 때에, Dulbecco 수정 이글스의 중간 (DMEM)에서 하룻밤 배양 세포, HEK - 293T 세포의 씨앗 낮은 통로 번호가 안정적으로 22mm 라운드의 coverslips에 GFP-DFCP1을 표현 일 - 라이브 셀 이미징 일).

2. 세포 형질

1. 나는 혈청 배지, 3 μL X-tremeGENE 9 DNA의 형질 시약 및 pECFP-LC3 플라스미드 DNA 0.5 μg을 감소 100 μL OptiMEM을 포함, 각 플레이트 형질 복잡한 믹스를 준비합니다. 그리고 위아래로 pipetting하여 부드럽게 혼합하고 실온에서 15 분 알을 품다. [참고 : 우리는 반복적으로 같은 lipofectamine과 2000 다른 형질 시약, 독성의 많은 것을 발견하고, 또한, 그들은 많은 현미경 기술을 방해 자신에 형광 입자를 생산하고 있습니다.]
2. 접시에서 매체를 대기음 신선한 DMEM 미리 예열 37 ° C.를 추가
3. 트란 추가24 시간 동안 배양 세포, pipetting하여 세포에 복잡한 sfection.

3. 세포 소기관 마커 (선택 사항)와 세포 배양

1. 75 nm의 최종 농도에서 DMEM에 mitotracker / lysotracker를 추가하고, 빛의 노출과 반복적 동결 융해 사이클을 방지하기 위해, 전체 실험의 날 함께 알루미늄 호일로 덮여 팔콘 튜브에 얼음 계속.
2. mitotracker / lysotracker 함유 배지 2 ㎖의 나누어지는을 제거하고 37 ° C에서 예열, 형질 세포 흡인 중간 mitotracker / 30에 대한 중간 및 부화 세포를 함유 lysotracker로 교체 - 60 분.

4. 라이브 셀 이미징에 대한 배양 챔버의 준비 (그림 1)

1. 깨끗한 금속과 75 %의 에탄올과 금속 O-링의 테두리에 실리콘 그리스를 도포와 O-링 플라스틱.
2. 집게는 접시에서 coverslip을 제거하고 coverslip에의 바닥면에서 매체의 과잉 건조하여,이 같은 그리스 너무 많은 매체를 혼합하지 않도록하려면 누설의 가능성을 증가합니다.
3. 밀폐 챔버를 창조하기 위하여 사이에 끼워 coverslip에 함께 플라스틱 O-링의 선반에 휴식 및 플라스틱 O-링의 상단에 금속 O-링에 맞게 coverslip을 둡니다.
4. 판의 매체와 최고 챔버, DMEM의 중탄산염 버퍼 시스템은 인공 CO ₂ 농도를 필요로이 점에서 그리고에, 발생하는 산도의 변화를 방지하기 위해, 버퍼링 에이전트없이 DMEM 배지에서 세포의 장기 배양을 방지 10 %의와 주위 공기의 CO ₂ 농도는 매우 낮습니다.

5. 세포의 기아

1. 현미경 스테이지에서 배양 챔버를 넣습니다.
2. 전체 매체를 대기음 기아 매체의 2 ㎖ 3 회 씻어, 더 아미노산 결국 자식 작용 반응을 억제 할 DMEM에서 유지되지 않았는지 확인하며 설정ON 타이머.

6. 현미경 사용

1. 살아있는 세포 넓은 분야 에피 형광 위해 구성된 적절한 이미징 시스템이 필요합니다. 이는 일반적으로 연구 등급 거꾸로 현미경 구조, 형광 단백질 (들) / 그 염료 (들), 높은 품질의 대물 렌즈, 민감한 CCD / sCMOS 특정 강렬한 광범위한 스펙트럼 광원, 거울과 필터를 구성합니다 카메라와 배양 챔버. (모든 주요 현미경 제조 업체 라이브 셀 이미징에 적합한 완벽한 넓은 필드 시스템을 제공하지만, 제조 업체의 다양한 구성 요소를 사용하여 시스템을 홈 구축도 가능하고 같은 마이크로 Manager와 같은 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여이를 제어 : HTTP / / valelab.ucsf.edu ~ / MM / MMwiki / ). 우리의 생각에 가장 중요한 부분은 형광 기자의 발현 수준을 최소로 유지 될 수 있도록 고감도의 시스템을 사용하는 것입니다.
2. SEL이미지에 적절한 셀을 변경 합니다.
   1. 더 autophagosome 대형 이벤트를 캡처 할 수 있도록 대형 및 평면 셀을 선택합니다. 또한, 이미 omegasomes의 큰 숫자를 생산하기 시작했습니다 셀을 선택.
   2. 비디오 당 autophagosome 대형 이벤트의 큰 비율을 캡처하기 위해, 30 분 후 또는 잘 autophagy에 대한 응답으로 비디오 캡처를 시작합니다.
3. 영상.
   1. 높은 배율 렌즈 (100X 1.4 NA)를 사용합니다.
   2. 사진 표백을 방지하기 위해 최대 20 %까지 여기 빛의 강도를 조정합니다.
   3. 100-500 밀리 초 노출 × 2 비닝 (binning) 100 이득 카메라 (하마 마츠 ORCA ER, 픽셀 크기 6.45 μm의)을 설정합니다.
   4. 이미지 수집 속도 1 프레임마다 10 초로 설정합니다.

7. ImageJ에 함께 Autophagosome 대형 이벤트의 몽타주 만들기

[이 단순히 전자의 병합 된 비디오를 스캔하여 비 체계적인 방법으로 수행 할 수 있습니다관심 통풍구하지만, 아래에 설명 된대로 그것은 또한 체계화 될 수 있습니다.]

1. 3 (또는 2) 오픈 이미지 스택은 ImageJ에 / 피지 채널을 캡처.
2. 해당 채널에 녹색, 빨간색과 파란색 LUT (룩업 테이블)을 적용, 3 색상을 병합하고 저장합니다.
3. 분석 탭에서 도구> 투자 수익 (ROI) 관리자를 선택 ... > 지정한 후 스택의 첫 번째 이미지에서 정의 된 크기의 임의의 영역을 선택합니다.
4. 이미지 탭에서 스택의 선택된 영역을 복제하기 위해 복제를 선택합니다.
5. 이미지 탭에서 스택을 선택> 몽타주를 만들기 ... 포함하는 임시 몽타주를 만들려면 모든 프레임 캡처. 전체 autophagosome 형성 이벤트 장면에서 모든 프레임을 스캔하면 이벤트의 처음과 마지막 프레임의 노트를 유지합니다.
6. 분석 탭에서 도구> 투자 수익 (ROI) 관리자를 선택 ... 다른 2 색이 스택의 첫 번째 이미지뿐만 아니라 병합 색상 이​​미지에 대해 동일한 영역을 선택하고 스택을 복제합니다.
7. t에서그 탭을 파일, 새로 만들기> 이미지를 선택하고 높이 설정 한 투자 수익 (ROI) 관리자를 사용하여 처음 선택한 픽셀의 수에 따라 폭 설정의 4 배 투자 수익 (ROI) 관리자에서 설정 높이를 더한 3 색과 사이의 공간에 대한 3 픽셀 각 스택 프레임의 수와 병합 및 설정 조각입니다.
8. 이미지 탭에서 선택한 스택> 도구> 삽입 ..., 그 사이에 1 픽셀의 공간을두고, 다른 상단에 각 하위 스택 하나를 삽입합니다.에게
9. 이미지 탭에서 스택을 선택> 몽타주를 만들기 ... 몽타주 시작 및 캡처 autophagosome 대형 이벤트의 처음과 마지막 프레임 마무리를 만들 수 있습니다.

결과

프로토콜이 설명에서 우리는 안정적으로 autophagy를 유도 조건 하에서 GFP - 태그 DFCP1을 표현하는 세포 라인 CFP-태그 LC3의 국산화를 따라 시간 경과 현미경을 사용했습니다. 이 실험의 결과는 2 시리즈 또는 GFP-DFCP1와 CFP-LC3에 해당하는 이미지, 녹색에서 하나 파랑 채널에서 하나의 스택의 캡처입니다. 우리는 더 이상 같은 프로토콜 절에 설명 된 단일 autophagosome 대형 이벤트에 해당 몽타주를 작성하?...

토론

이 프로토콜에서 설명하는 방법은 autophagosome 형성하는 동안 단백질의 지방화 시각화 할 수 있습니다. 우리는 이벤트 디스크 공 촛점과 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 회전, 포인트 스캐닝 공 촛점을 포함한 기술 시각화하는 다양한 방법을 시도했다. 우리는 일반적인 목적을 위해 표준 넓은 분야 에피 형광 감도와 해상도 사이의 최고의 타협을 제공하는 것으로 나타났습니다. 이 잡음을 최소화 pho...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	41965
OptiMEM I	Invitrogen	31985-062
MitoTracker Red FM	Invitrogen	M22425
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Applied Science	6365787001
22 mm coverslips	VWR	631-0159
35 mm plates	Fisher NUNC	153066
Silicon grease	RS Components Ltd.	RS 494-124
O-rings			Custom made
Attofluor Cell Chamber	Invitrogen	A-7816	Suggested alternative to custom-made O-rings
Microscope	Olympus	IX81	Inverted microscope
Objective	Olympus	UPLSAPO 100XO	N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5
Camera	Hamamatsu	ORCA-R2 C10600 10B	Progressive scan interline CCD
Illuminator	TILL Photonics	Polychrome V	Ultrafast monochromator
Incubation chamber	Solent Scientific	Cell^R IX81
Software	Olympus	SIS xcellence