Imaging cellulare dal vivo dei primi autofagia Eventi: Omegasomes e oltre

Riepilogo

Time-lapse microscopia di marcatori autofagia fluorescente permette il monitoraggio della risposta autofagia dinamica con alta risoluzione temporale. Utilizzando l'autofagia specifico e marcatori di organelli in una combinazione di 3 colori diversi, siamo in grado di seguire il contributo di una proteina di formazione dell'autofagosoma in un contesto spaziale e temporale robusto.

Abstract

Autofagia è una risposta cellulare innescata dalla mancanza di nutrienti, in particolare l'assenza di amminoacidi. L'autofagia è definita dalla formazione di strutture a doppia membrana, chiamata autophagosomes, che sequestrare il citoplasma, proteine ​​longevi e aggregati proteici, organelli difettosi, e anche virus o batteri. Autophagosomes alla fine si fondono con i lisosomi che portano alla degradazione grosso del loro contenuto, con le sostanze nutritive prodotte essere riciclati al citoplasma. Pertanto, l'autofagia è fondamentale per l'omeostasi cellulare, e la disregolazione di autofagia può portare a malattie, in particolare neurodegenerazione, l'invecchiamento e il cancro.

Formazione dell'autofagosoma è un processo molto elaborato, per cui le cellule hanno assegnato un gruppo specifico di proteine, chiamato il macchinario nucleo autofagia. Il macchinario nucleo autofagia è funzionalmente integrata da proteine ​​addizionali coinvolti in diversi processi cellulari, ad esempio in membrane il traffico, nella biologia dei mitocondri e lisosomi. Il coordinamento di queste proteine ​​per la formazione e la degradazione del autophagosomes costituisce la risposta altamente dinamico e sofisticato di autofagia. Imaging dal vivo cella permette di seguire il contributo molecolare di ogni proteina autofagia correlata al livello di un singolo evento formazione dell'autofagosoma ed in tempo reale, pertanto questa tecnica offre un'alta risoluzione temporale e spaziale.

Qui usiamo una linea di cellule che esprimono stabilmente GFP-DFCP1, per stabilire un contesto spaziale e temporale per la nostra analisi. DFCP1 marchi omegasomes, che sono strutture di precursori che portano alla formazione autophagosomes. Una proteina di interesse (POI) può essere contrassegnato con un rosso o un tag fluorescente ciano. Diversi organelli, come ER, mitocondri ed i lisosomi, sono tutti coinvolti nelle diverse fasi di formazione autofagosoma, e possono essere contrassegnati con un colorante specifico inseguitore. Time-lapse microscopia di AutopHagy in questo set up sperimentale, consente alle informazioni di essere estratto per la quarta dimensione, cioè il tempo. Quindi siamo in grado di seguire il contributo del PDI di autofagia nello spazio e nel tempo.

Introduzione

Autofagia è un processo altamente dinamico, che richiede il coordinamento di un gran numero di proteine ​​per l'esito finale della formazione dell'autofagosoma ^1-3. Microscopia è probabilmente la tecnica più comunemente applicato per studiare l'autofagia ^4. La localizzazione della maggior parte delle proteine ​​autofagia è stata ampiamente studiata in cellule fisse, sia mediante immuno-colorazione, le proteine ​​endogene e dalla espressione della proteina esogena fluorescente tag. Inoltre, la microscopia elettronica (EM), da solo e in combinazione con etichettatura immuno-oro, ha descritto i dettagli particolari di queste strutture ^5,6. Nonostante il fatto che queste tecniche hanno stabilito la nostra comprensione della formazione dell'autofagosoma nelle tre dimensioni dello spazio, non sono riusciti a fornire sufficiente quantità di informazioni sulla 4 ^° dimensione - tempo. Imaging dal vivo cella supera questa barriera quanto consente seguito alla formazione di un dell'autofagosoma il più vicino possisibile tempo reale ^7. Questa tecnica è stato impiegato per studiare l'autofagia da Yoshimori e colleghi ^8, ed è stato sempre più utilizzato d'ora in poi.

Microscopia time-lapse cattura la localizzazione del PDI in cellule vive e per un periodo di tempo. Confrontando questi dati con una autofagia ben caratterizzato e / o organelli marcatore, analisi imaging cellulare dal vivo può mettere il POI nel più ampio contesto spaziale e temporale della formazione autofagosoma. Analisi imaging dal vivo cella è basato sulla cattura ripetitiva della localizzazione PDI lungo tutte le fasi di formazione autofagosoma, mentre l'imaging di cellule fissate si basa su una singola acquisizione. Pertanto, l'imaging cellulare dal vivo in grado di dimostrare il contributo del POI in fasi specifiche di formazione autofagosoma, mentre l'imaging di cellule fisse può assumere solo il ruolo di punti di interesse, in base alla sua localizzazione media in molti autophagosomes catturate simultaneamente in diverse fasi della loro lifecyCLE.

Sebbene l'imaging cellulare dal vivo è un metodo di alta potenza analitica, ha alcune limitazioni intrinseche, che dovrebbero essere presi in considerazione. Prima di tutto, di cellule vive richiede l'espressione di una o più proteine ​​esogene fluorescente. Tag fluorescenti tendono ad essere di grandi dimensioni e che a volte possono alterare il comportamento di una proteina per ragioni steriche. Questa situazione è accentuata per proteine ​​di membrana, poichè devono funzionare nello spazio limitato delle dimensioni di 2 membrane. Di nota, autophagosomes sono strutture membranose, e di conseguenza la loro formazione richiede un gran numero di proteine ​​associate alla membrana.

Un'altra serie di problemi è collegata ai livelli di espressione di POI. In linea di principio, una proteina esogena dovrebbe essere espressa a livelli comparabili alla proteina endogena. Questo assicura che importanti regolatori della sua localizzazione sub-cellulare non saranno saturati, e THanalisi e sarà biologicamente rilevanti. Inoltre, la sovraespressione di proteine ​​autofagia dovrebbe essere evitato, come quando sono espresse sopra dei livelli endogeni, tendono a inibire la risposta autofagia ^9. Viceversa, poiché i livelli di espressione della PDI dovrebbe essere sufficientemente alta da permettere successivo alla localizzazione per un buon periodo di tempo senza fotometabolismo, un compromesso deve essere raggiunto. Raggiungere i livelli di espressione ottimali di una proteina esogena in cellule di mammiferi richiede un sacco di messa a punto, ma è fattibile attraverso la definizione e lo screening di linee cellulari che esprimono stabilmente diversi livelli del POI.

La risoluzione spaziale che si può ottenere con un microscopio a fluorescenza è un altro fattore limitante. Risoluzione può essere limitata per una serie di ragioni, ma nella migliore risoluzione laterale sarà di circa 250 nm. Ciò significa che gli eventuali oggetti separati da una distanza inferiore a questo appariranno collegato (o come singolaoggetto) e gli oggetti di dimensioni inferiori a 250 nm saranno rappresentati nell'immagine più grande di quello che realmente sono. Quindi le immagini devono essere sempre interpretati con questo in mente e tecniche complementari come EM sarà richiesto di risolvere piccoli dettagli ultra-strutturale.

Infine, di cellule vive richiede intrinsecamente esponendo una cella alla luce, potenzialmente per un periodo prolungato di tempo. Ciò può alterare le risposte fisiologiche di una cellula, un fenomeno noto come foto-tossicità.

Abbiamo utilizzato con successo l'imaging cellulare dal vivo della proteina PI3P vincolante DFCP1 a descrivere per la prima volta che autophagosomes provengono da PI3P ricchi di strutture anulari omegasomes chiamati, che sono in stretta associazione con ER filoni ^10,11. Abbiamo chiaramente dimostrato che le strutture LC3-positivi cominciano a formare in stretta associazione con omegasomes. Noi qui suggeriamo che impiegando una linea cellulare che esprime stabilmente GFP-DFCP1 per la cella vivoImaging della proteina di interesse, stabilisce un quadro spaziale e temporale robusto per la caratterizzazione del suo ruolo nella formazione dell'autofagosoma.

Protocollo

1. Preparazione delle cellule

1. Seme basso numero di cellule HEK passaggio-293T esprimono stabilmente GFP-DFCP1 on 22 millimetri coprioggetto arrotondato; cellule di coltura durante la notte in mezzo di Dulbecco Modified Eagles (DMEM), ad una confluenza del 30-40% (obiettivo per una confluenza del 80% dopo 2 giorni - giorno di imaging cellulare dal vivo).

2. Trasfezione delle cellule

1. Preparare la trasfezione complesso mix per ogni piastra, contenente 100 ml OptiMEM ho ridotto mezzo privo di siero, 3 ml X-tremeGENE 9 DNA Transfezione reagente, e 0,5 mg di pECFP-LC3 DNA plasmidico. Mescolare delicatamente pipettando su e giù e incubare 15 min a temperatura ambiente. [Nota: abbiamo più volte riscontrato che altri reagenti di trasfezione, come Lipofectamine 2000, hanno un sacco di tossicità, e, inoltre, producono particelle fluorescenti per conto proprio che interferiscono con molte tecniche di microscopia.]
2. Aspirare il terreno dalle piastre e aggiungere DMEM fresco pre-riscaldato a 37 ° C.
3. Aggiungere il transfection complesso di cellule con una pipetta; cellule incubare per 24 ore.

3. L'incubazione delle cellule con il Marker Organelle (Opzionale)

1. Aggiungere Mitotracker / Lysotracker a DMEM ad una concentrazione finale di 75 nM, e tenere in ghiaccio, in un tubo falcon coperta con un foglio di alluminio, lungo l'intera giornata sperimentale, per evitare l'esposizione della luce e il congelamento ripetitivo e disgelo.
2. Rimuovere una aliquota di 2 ml di Mitotracker / Lysotracker contenenti medio e scaldare a 37 ° C; medie aspirato da cellule transfettate e sostituirlo con Mitotracker / Lysotracker contenenti medio e cellule incubare per 30 - 60 min.

4. Preparazione della camera di incubazione per imaging cellulare dal vivo (Figura 1)

1. Pulito metallo e plastica O-ring con il 75% di etanolo e applicare grasso al silicone sul bordo della O-anello metallico.
2. Utilizzando pinze rimuovere il vetrino dalla piastra e asciugare l'eccesso di supporto dal lato inferiore del vetrino,per evitare di mescolare troppi media con il grasso, in modo da aumentare la probabilità di perdite.
3. Lasciare il vetrino ad appoggiarsi sul davanzale della O-ring in plastica e montare l'O-ring di metallo sopra l'O-ring in plastica, con il coprioggetto inserita tra, al fine di creare una camera chiusa.
4. Top up da camera con il supporto dalla piastra, da questo punto in poi, evitare di incubazione prolungata delle cellule in DMEM senza un agente tampone, per evitare variazioni di pH che si verifichi, come il sistema tampone bicarbonato di DMEM richiede la concentrazione di CO ₂ artificiale del 5-10% e la concentrazione di CO ₂ dell'aria ambiente è molto più basso.

5. La fame di celle

1. Mettere la camera di incubazione sul palco microscopio.
2. Aspirare il terreno completo e lavare con 2 ml di mezzo inedia 3 volte, per garantire che nessun amminoacidi sono rimasti dal DMEM, che finirà per inibire la risposta autofagia; impostare l'timer ON.

6. Microscopia

1. Un sistema di imaging appropriato configurato per vivere cella a grande campo epi-fluorescenza sarà richiesto. Questo in genere comprendono un telaio microscopio invertito ricerca-grado, un intenso ampio spettro sorgente di luce, specchi e filtri specifici per la proteina fluorescente (s) / colorante (s) di interesse, un obiettivo obiettivo di alta qualità, un CCD sensibile / sCMOS fotocamera e una camera di incubazione. Tutti i maggiori produttori offrono sistemi microscopio a largo campo completi adeguata per l'imaging cellulare dal vivo, ma è anche possibile in casa costruire un sistema che utilizza i componenti da una varietà di produttori e controllarlo utilizzando software open source come Micro-Manager ( http: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki / ). L'aspetto più importante nel nostro parere è utilizzare un sistema di elevata sensibilità in modo che i livelli di espressione dei reporter fluorescenti possono essere ridotte al minimo.
2. Selette le celle appropriate per immagini.
   1. Selezionare le celle grandi e piatte che permetteranno eventi formativi più autofagosoma per essere catturato. Inoltre, optare per le cellule che hanno già iniziato la produzione di un maggior numero di omegasomes.
   2. Avviare l'acquisizione video dopo 30 min o anche in risposta autofagia, al fine di acquisire un maggiore rapporto di eventi di formazione autofagosoma al video.
3. Imaging.
   1. Utilizzare una lente ad alto ingrandimento (100x 1.4 NA).
   2. Regolare l'intensità della luce di eccitazione al 10-20% del massimo per evitare fotometabolismo.
   3. Impostare la fotocamera (Hamamatsu ORCA ER, dimensione del pixel 6.45 micron) a 100-500 msec esposizione, binning 2x2 e 100 di guadagno.
   4. Impostare la velocità di acquisizione delle immagini a 1 fotogramma ogni 10 sec.

7. Creazione di montaggi di autofagosoma Formazione Eventi con ImageJ

[Questo può essere fatto in modo non sistematico semplicemente leggendo il video unito per postabocchette di interesse, ma può anche essere sistemato come indicato di seguito.]

1. Aperte stack di immagini per il 3 (o 2) catturati canali in ImageJ / Figi.
2. Applicare LUT verde, rosso e blu (tabelle di ricerca) per il canale corrispondente; unire 3 colori e risparmiare.
3. Dalla scheda Analizza, selezionare Strumenti> ROI direttore ... > Specifica, quindi selezionare una zona casuale di dimensione definita nella prima immagine della pila.
4. Nella scheda Immagine, selezionare duplicare, al fine di duplicare l'area selezionata dello stack.
5. Nella scheda Immagine, selezionare Stack> Fai fotomontaggio ... per creare un montaggio provvisorio che contiene tutti i fotogrammi catturati. Scansione di tutti i fotogrammi del montaggio per un evento complete formazione dell'autofagosoma; tenere le note del primo e l'ultimo fotogramma della manifestazione.
6. Dalla scheda Analizza, selezionare Strumenti> ROI direttore ... selezionare la stessa area nella prima immagine della pila per gli altri due colori, nonché per l'immagine colori fusa e pile duplicato.
7. Da tegli scheda File, selezionare Nuovo> Immagine e impostare per la larghezza in base al numero di pixel inizialmente selezionate utilizzando il gestore ROI, fissati per altezza 4 volte l'altezza impostata nel gestore ROI più 3 pixel di spazio tra i 3 colori e le Fette fuse, e impostare come il numero di fotogrammi per ogni stack.
8. Nella scheda Immagine, selezionare Stack> Strumenti> Inserisci ..., quindi inserire ognuno sub-stack sopra l'altro, lasciando spazio di 1 pixel in mezzo.
9. Nella scheda Immagine, selezionare Stack> Fai fotomontaggio ... per creare un fotomontaggio partendo e terminando con il primo e l'ultimo fotogramma della manifestazione formazione autofagosoma catturato.

Risultati

Nel protocollo descritto, abbiamo usato la microscopia time-lapse di seguire la localizzazione di CFP-tag LC3 in una linea di cellule che esprimono stabilmente GFP-tagged DFCP1, in condizioni che inducono autofagia. Il risultato di questo esperimento è la cattura di serie 2 o pile di immagini, uno dal verde e uno del canale blu, corrispondenti a GFP-DFCP1 e CFP-LC3. Abbiamo inoltre analizzato questi video usando ImageJ, al fine di creare montaggi corrispondenti ad eventi di formazione autofagosoma singoli, come descrit...

Discussione

Il metodo descritto in questo protocollo permette la visualizzazione di localizzazione di una proteina durante la formazione dell'autofagosoma. Abbiamo provato vari metodi per visualizzare gli eventi descritti anche da punto di scansione confocale, spinning disk confocale e Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopia. Abbiamo trovato che per scopi generali standard wide-field epi-fluorescenza fornisce il miglior compromesso tra sensibilità e risoluzione. Questo assicura buon segnale al rumore, photo-b...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	41965
OptiMEM I	Invitrogen	31985-062
MitoTracker Red FM	Invitrogen	M22425
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Applied Science	6365787001
22 mm coverslips	VWR	631-0159
35 mm plates	Fisher NUNC	153066
Silicon grease	RS Components Ltd.	RS 494-124
O-rings			Custom made
Attofluor Cell Chamber	Invitrogen	A-7816	Suggested alternative to custom-made O-rings
Microscope	Olympus	IX81	Inverted microscope
Objective	Olympus	UPLSAPO 100XO	N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5
Camera	Hamamatsu	ORCA-R2 C10600 10B	Progressive scan interline CCD
Illuminator	TILL Photonics	Polychrome V	Ultrafast monochromator
Incubation chamber	Solent Scientific	Cell^R IX81
Software	Olympus	SIS xcellence