Renal Cápsula xenotrasplante y subcutánea Pellet Implantación para la Evaluación de la próstata Carcinogénesis y la hiperplasia prostática benigna

Resumen

Se describe la fabricación de pellets de la hormona del comprimido, así como la implantación quirúrgica subcutánea en ratones. Esta estrategia se puede combinar con el crecimiento de xenoinjertos de células y tejidos debajo de la cápsula renal de ratones desnudos atímicos para evaluar la carcinogénesis y la regulación del crecimiento benigno de la próstata hormonal.

Resumen

Nuevas terapias para dos enfermedades comunes de la próstata, cáncer de próstata (AEP) y la hiperplasia prostática benigna (HPB), dependen fundamentalmente de experimentos que evaluaban su regulación hormonal. Hormonas sexuales esteroideas (especialmente los andrógenos y estrógenos) son importantes en la PRCA y BPH; sondeamos sus respectivas funciones en la inducción de crecimiento de la próstata y la carcinogénesis en ratones con experimentos utilizando bolitas de hormonas comprimidos. Gránulos hormonales y / o de drogas se fabrican fácilmente con una prensa de pellets, y implantado quirúrgicamente en el tejido subcutáneo del huésped ratón macho. También se describe un protocolo para la evaluación de la carcinogénesis hormonal mediante la combinación subcutánea implantación de los microgránulos de la hormona con xenoinjertos de recombinantes celulares de próstata bajo la cápsula renal de ratones inmunocomprometidos. Por otra parte, la implantación de pellets hormona subcutánea, en combinación con la cápsula renal de los xenoinjertos de tejido de BPH, es útil para comprender mejor la regulación hormonal de Prost benignacomió el crecimiento, y para probar nuevas terapias dirigidas a los esteroides sexuales vías hormonales.

Introducción

El cáncer de próstata (AEP) y la hiperplasia prostática benigna (BPH) son una carga para la salud. La AEP es el segundo cáncer de órgano sólido más frecuente en hombres y una causa principal de muerte por cáncer relacionadas ^1. HPB también tiene una alta prevalencia entre los hombres de mayor edad, y se estima que la manifestación clínica de la HBP, síntomas del tracto urinario inferior (STUI), afectará el 50-90% de los hombres ^2. Mientras que los andrógenos y los estrógenos son conocidos por ser importante en PRCA y la BPH, nuestra comprensión de los mecanismos hormonales que subyacen en la carcinogénesis y el crecimiento sigue siendo incompleta ^3,4. Modelos animales simples y manejables genéticamente sustentan los estudios que aborden estas prioridades en la investigación de la próstata. En hormonales enfermedades sensibles, tales como una AEP y BPH, el uso de la vía subcutánea, los pellets de hormonas de liberación lenta, de manera aislada o en combinación con la cápsula renal xenoinjertos (la transferencia de células, tejidos u órganos de una especie en otra) en el immunocompanfitrión ratón romised, proporciona un método sencillo y reproducible para el estudio de la regulación hormonal de crecimiento y la carcinogénesis.

La implantación subcutánea de pellets hormona es una técnica sencilla y reproducible para estudiar la regulación hormonal de la carcinogénesis y el crecimiento benigno en la próstata ^5. La implantación subcutánea de ratones macho adultos con 25 mg de testosterona (T) y 2,5 mg de 17β-estradiol (E _2), provoca un aumento en el suero E ₂ y la disminución gradual en T, recrear el ambiente hormonal dinámica de hombres de edad avanzada ^5,6. Además, este modelo recapitula muchas de las características clínicas de la HBP-STUI ^5,7. Los métodos alternativos de administración de hormonas incluyen la administración oral / sonda o inyección intraperitoneal, que causar angustia al roedor, son menos consistentes en la entrega de la misma cantidad de fármaco en el tiempo, y son más mano de obra que una implantación quirúrgica de una sola vez. Otros modos de subcutáneos para Hormone y / o la administración de fármacos incluyen cápsulas de Silastic ^8. Mientras que también tenemos experiencia con el uso de cápsulas de Silastic, gránulos comprimidos son favorecidos por su facilidad de uso y reproducibilidad. Por otra parte, las tasas de liberación de gránulos hormonales comprimidas mejor imitan los ratios de hormonas sexuales esteroideas dinámicas observadas en hombres de edad ^5,7.

Desde el desarrollo de los ratones genéticamente inmunocomprometidos, numerosos sistemas de modelos in vivo en xenoinjertos que incorporan técnicas se han desarrollado para el estudio de una amplia variedad de tejidos normales y enfermos. Hay varias categorías básicas de los xenoinjertos. Xenoinjertos tisulares consisten en un pequeño trozo de tejido intacto, lo que puede ser una estructura normal, tumoral maligna o crecimiento benigno. Szot et al. (2007) han iluminado recientemente renal cápsula xenoinjertos de islotes pancreáticos ^9. Aamdal et al. (1985) describió renal cápsula xenoinjertos de 27 líneas celulares de cáncer humano en imratón munocompromised alberga ^10. Los injertos también pueden estar compuestos de una sola línea celular inmortalizada (canceroso o no tumorigénicos), o pueden consistir en una línea celular inmortalizada en combinación con células aisladas a partir de mesénquima (injerto recombinante de células).

Estamos a favor de los xenoinjertos de recombinantes de células para investigar las funciones respectivas del estroma y el epitelio en el desarrollo de una AEP y BPH. Cunha et al. (1980) fue el primero en informar de que cuando adultos murino epitelio de la vejiga se combina con mesénquima embrionario urogenital sinusal (UGM) y xenoinjertado bajo la cápsula renal de ratones machos anfitriones, el tejido se desarrolla en las estructuras que se asemejan acinos prostáticos ^11. Norman et al. (1986) mostró que el ratón adulto prostática epitelio ductal y UGM, cuando se combinan en los recombinantes de tejido, se someten a un crecimiento ductal y la morfogénesis de ramificación ^12. Hayward et al. (1988) mostró que el epitelio de próstata humano responde a inductivo m fetalesenchyme de una manera similar ^13. Un modelo de carcinogénesis hormonal en la próstata, mediante la combinación de la inmortalizada de próstata humana línea celular epitelial de la HBP-1 con UGM, se informó por primera vez por Wang et al. ¹⁴ (2001) y se ha utilizado ampliamente en nuestro laboratorio ^15. Este modelo es muy adecuado para la comprensión de APCR progresión porque epitelio prostático benigno se transforma en enfermedad metastásica, el modelado avanzado APCR en humanos ^5. Dado que los componentes específicos pueden ser manipuladas genéticamente, el injerto celular recombinante es particularmente útil como un enfoque para evaluar las interacciones estroma epitelial.

Otros sitios adecuados para los xenoinjertos son intradérmica, subcutánea y lugares ortotópico ^16. Dependiendo del proceso de tejido y la enfermedad de interés, estos pueden ser los enfoques alternativos adecuados. Para el estudio de la carcinogénesis hormonal de la próstata y la regulación del crecimiento benigno, elegimos la cápsula renalEl sitio de xenoinjerto debido a sus injerto más altos tasa de absorción, abundante suministro de sangre, y la capacidad de implantar un mayor número de xenoinjertos en un sitio confinado ^16. Por otra parte, la manipulación hormonal de ratón huésped que resulta en la atrofia prostática limita el uso de injerto de próstata ortotópico ^16.

Este protocolo describe las técnicas de fabricación de la hormona comprimido / gránulo de drogas y la implantación quirúrgica, así como la cápsula renal de los xenoinjertos de injertos de células de próstata humana y tejidos. En conjunto, estas técnicas proporcionan un ensayo sensible para determinar si un ratón modificado genéticamente es más susceptible a PRCA y / o iniciación HPB que las cepas de control. Xenotrasplante es una técnica poderosa para la evaluación in vivo de la potencial de las células experimentales para desarrollar histológico y características moleculares de malignidad, así como un ensayo para nuevas estrategias de tratamiento para una amplia variedad de enfermedades benignas y malignas.

Protocolo

1. Preparación del comprimido hormonal / Drogas Pellet

1. Este procedimiento se debe realizar en una campana de seguridad química, mientras que llevaba una bata de laboratorio, guantes, mascarilla, gafas de seguridad, y el capó. Para evitar la contaminación cruzada, es crítico que el que hace el equipo de pellets se limpia a fondo con etanol al 70% antes y después de la fabricación de cada tipo de pastilla.
2. Usando una balanza analítica y se pesa el papel, mide la cantidad deseada de polvo de hormona / drogas. Se recomienda Aproximadamente el 5% de material extra para acomodar la pérdida durante el prensado.
3. Algunos hormonas / medicamentos requieren un agente de relleno o de unión, que se mezcla antes de la fabricación de pellets. Por ejemplo, para la fabricación de una pastilla de 2,5 mg de 17β-estradiol, la hormona combinar con 22,5 mg de colesterol, lo que resulta en un 25 mg de pellets.
4. Transferir cuidadosamente en juego de matrices, colocar en la prensa y empuje firmemente hacia abajo la palanca para comprimir pellet. Use una presión constante para mantener la superficie constante sonun a relación de volumen.
5. Siguiente revertir el soporte de la matriz y empuje la palanca hacia abajo de nuevo para liberar la pastilla.
6. Inspeccione pellet para la integridad y determinar si la masa final es dentro del rango deseado. Un rango aceptable es una diferencia ± 5% en la masa final (por ejemplo, un rango aceptable para una 25 mg de pellets es 23,8 a 26,3 mg).
7. Los pellets se pueden hacer antes de la cirugía y se almacenan (condiciones y duración de almacenamiento depende de la estabilidad de la hormona o medicamento que se usa en la fabricación de pellets). Gránulos hormonales pueden ser adquiridos como una alternativa para sedimentar la fabricación. La compra de gránulos evita el uso de medicamentos sin grado farmacéutico ya que se formularán y agravados.

2. Preparación de células recombinantes xenoinjertos

1. Cosecha y cultivo primario de ratón mesénquima urogenital (UGM) las células del estroma de menos de 4 semanas antes de ser recogidos para el recuento.
2. Cultura inmortalizó próstata líneas de células epiteliales en el fash habitualiones y recoger para el recuento. Para este ejemplo, preparar injertos de células recombinantes mediante la mezcla de 100 000 células HPB-1 epiteliales por injerto con 250.000 células estromales UGM por injerto en la suspensión.
3. Precipitar las células juntas y volver a suspender en suficiente colágeno tipo neutralizado 1 cola de rata para hacer número deseado de injertos, cada uno en un volumen de 25 l a 50 l.
4. Establecer injertos recombinantes a 37 ° C durante 15 minutos y luego cubra con un medio de crecimiento para el almacenamiento a 37 ° C durante un máximo de 48 horas antes del injerto.

3. Preparación de xenoinjertos de tejido

1. Mantener las precauciones universales para los agentes patógenos transmitidos por la sangre durante la obtención de tejidos y el procedimiento quirúrgico. Tras la aprobación por la junta de revisión institucional y el consentimiento informado, obtener tejido prostático fresco de la resección quirúrgica. Para los estudios de crecimiento de la HPB, los tejidos se pueden cosechar de la resección transuretral de la próstata o prostatectomía procedimientos simples. Xenoinjertos primarias de APCR o prost benignatejido comió se puede obtener de piezas de prostatectomía radical.
2. Tienda cosecha tejido en los medios de comunicación celulares isotónica tamponada o solución salina normal en hielo. Dependiendo de las condiciones de los tejidos y de almacenamiento, las muestras pueden ser almacenadas por hasta 24 horas antes de la preparación de los injertos de tejidos. La práctica común consiste en dividir la muestra en tres piezas, con una sección fija en formalina y se procesan para histología rutinaria, una sola pieza se congeló para el análisis molecular y una pieza dividida en xenoinjertos de tejido (1-3 mm de tamaño).

4. Preparación de fuego de vidrio pulido pipeta

1. Guantes resistentes a usar protección para los ojos, una bata de laboratorio y de calor, lugar de vidrio Pasteur punta de la pipeta en Bunsen quemador de llama en un ángulo de 60 ° para empezar.
2. Mantener una constante, un ligero movimiento de la pipeta a fin de evitar puntos calientes.
3. Dibujar la punta fina y de fuego-pula con el objetivo de ser un final ligeramente curvada con una redondeada, cerrada punta.

5. Elaboración de instrumentos y sala de operaciones

1. Autoclave todos los instrumentos. Antes de la cirugía, inspeccione todos los instrumentos, teniendo cuidado de mantener el campo estéril.
2. Establecer área quirúrgica estéril con almohadillas absorbentes, alcance la disección, anestesia nariz cono, instrumentos quirúrgicos y lámpara de calentamiento dirigido hacia el área de trabajo. Para esterilizar en herramientas entre los ratones, esterilizador de cuentas de precalentamiento.
3. Ensamble y aparatos de anestesia de prueba; sopesar carroñero gas.
4. Uso de las microondas, los cojines de cera de calor para un máximo de 5 minutos (en incrementos de 1 min, amasando la almohadilla de la cera con el fin de combinar fundido y fundir la cera) a la potencia del 70-80%, hasta que todo se funde la cera en forma pareja. Por contacto, asegúrese de la almohadilla no esté demasiado caliente y se coloca bajo la jaula de recuperación roedor vacía.
5. Equipo de protección personal Don para procedimientos quirúrgicos de roedores, incluyendo mascarilla, gorro, guantes y bata.

6. Procedimiento quirúrgico: Cápsula renal xenotrasplante

1. Todos los procedimientos con animales de investigación se debe realizar con la aprobación de los comités de cuidado animal institucional y el empleo. Antes de la inducción de la anestesia, observar el ratón para asegurar la salud y el bienestar.
2. Coloque el ratón en la cámara para la inducción de anestesia con isoflurano al 3-5%. Cuando el animal ha dejado de moverse y la frecuencia respiratoria ha disminuido, traslado al cono de la nariz en la posición prona, y mantener la anestesia en un 1-3%.
3. Si es necesario, use tijeras de afeitar la parte posterior del ratón. Esto no es necesario cuando se utilizan ratones atímicos desnudos (nu / nu).
4. Aplique una presión firme a la cincha de la pata trasera extendida para evaluar la adecuación de la anestesia. Si el ratón responde a la presión, se necesita más tiempo para que la anestesia surta efecto. Si es necesario, ajustar el flujo de la anestesia ligeramente para conseguir una anestesia adecuada.
5. Cuando el ratón se anestesia adecuada, la desinfección de la zona quirúrgica con yodo quirúrgico solución (Betadine), seguido de70% de alcohol.
6. Don guantes y bata estéril, aplicar paños estériles a la zona quirúrgica. Levante la piel de la espalda con un par de pinzas dentadas, y el uso de las tijeras gruesas crea un cm dorsal línea media incisión 2-3.
7. Usando tijeras de punta roma o una sonda, separar la dermis subyacente de la pared del cuerpo (en ambos lados de la incisión para el injerto bilateral o en un lado para el injerto unilateral).
8. Vuelva a colocar el ratón a la posición de lateral, e identificar el lugar de los riñones por ver el perfil renal a través de la pared muscular. La aplicación de presión manual suave con el pulgar y el dedo índice en el abdomen puede ayudar con la visualización de los órganos internos.
9. Con unas tijeras iris finas, y teniendo cuidado de evitar los grandes vasos y nervios espinales, haga una incisión de 1 cm en la pared del cuerpo paralelo a la espina dorsal. Ampliar esta incisión a 1,5-2,0 cm (ligeramente más largo que el eje largo de la riñón) mediante la apertura de las tijeras suavemente más amplia después de colocarlas en la incisión inicial.
10. Exteriorizar el riñón mediante la aplicación de presión suave fuera de la pared muscular de cualquier lado del riñón usando el dedo índice y el pulgar. Meta bordes de la piel por debajo del riñón exteriorizada, que descansará en la pared del cuerpo. Mientras que el riñón se exterioriza, mantener la hidratación de la cápsula renal mediante la aplicación de solución salina estéril.
11. Uso de finas # 5 fórceps levante suavemente la cápsula renal del parénquima del riñón y con un bisturí fino, crea una incisión de 2 mm -4 en la cápsula. El tamaño de la incisión se determina por el tamaño del injerto, pero debe ser minimizado con el fin de mantener la integridad de la cápsula.
12. Manipular una pipeta Pasteur de vidrio que se ha dibujado delgada y pulida al fuego con un extremo cerrado redondeado bajo la cápsula tangencial a la superficie del riñón. Abra con cuidado un pequeño bolsillo cápsula para los injertos, con mucho cuidado de no dañar el parénquima renal.
13. El borde del corte de la cápsula renal se levantó con las pinzas finas, y la i injertos inserta en el bolsillo debajo de la cápsula mediante la pipeta de vidrio pulido al fuego. Varios injertos se pueden colocar debajo de la cápsula renal y espaciados uniformemente sobre la superficie del riñón.
14. Si, durante el curso de injerto, la cápsula se deshidrata, se debe humedecerse mediante la aplicación de solución salina estéril.
15. Cuando el injerto es completa, levantar suavemente los lados de la incisión de la pared del músculo para reemplazar el riñón de nuevo en la cavidad del cuerpo. Observe que los injertos no se deslizan por debajo de la cápsula.
16. Cierre la pared del músculo con una sola sutura (4-0, FS-2 vicryl suturas). El procedimiento quirúrgico se puede repetir en el riñón contralateral cambiando la posición del ratón.
17. Cuando el injerto se ha completado, el ratón puede someterse a la implantación subcutánea de pellets en el mismo acto quirúrgico (Ver Protocolo paso 7).
18. Con unas pinzas dentadas, alinee los bordes de la incisión de la piel y aplique 2-3 clips de la herida quirúrgica para cerrar la incisión. Administrar la analgesia (usamos 5-10 mg / kg carprofen el uso de una inyección subcutánea) y colocar el ratón en la posición de decúbito lateral en la jaula de recuperación. Garantizar el mantenimiento de la temperatura corporal con el calor de una lámpara o una almohadilla térmica. Observar para la recuperación completa del ratón, lo que debe ocurrir en menos de 15 minutos.
19. Los ratones deben ser observados durante las próximas 24 horas para detectar signos de dolor post-operatorio, sangrado y / o de otras complicaciones. Inspeccione regularmente incisión quirúrgica para detectar signos de infección.
20. Retire los clips de la herida con dispositivo de extracción de clip de la herida quirúrgica 7-14 días después de la cirugía.

7. Procedimiento quirúrgico: subcutánea Pellet Implantación

1. Repita los pasos 06.01 a 06.05 de la cápsula renal xenoinjerto procedimiento quirúrgico.
2. Levante la piel de la espalda con un par de pinzas de la piel, y el uso de las tijeras gruesas crea un cm dorsal línea media incisión 1-2.
3. Usando tijeras de punta roma o una sonda, separar la dermis subyacente de la pared del cuerpo en una dirección craneal.
4. El uso de pinzas de la piel,levante suavemente la parte craneal de la incisión de la piel, y la celebración de la pastilla hormonal suavemente con fórceps, dentadas rectas, inserte el sedimento y la liberación en la piel del cuello, en el bolsillo que ha creado con la sonda roma.
5. Repita los pasos 6.18 a 6.20 de la cápsula renal xenoinjerto procedimiento quirúrgico. Si se realiza la implantación de los microgránulos subcutánea única, usar 1 clip de la herida quirúrgica para cerrar la incisión quirúrgica.

Resultados

Dependiendo de la hipótesis a comprobar, renal cápsula xenoinjertos de tejido o de células recombinantes se puede realizar de manera aislada, o en combinación con subcutánea implantación de los microgránulos de la hormona. Un diagrama esquemático de un experimento hipotético combinando renal experimento cápsula xenoinjertos con implantación de los microgránulos de la hormona subcutánea se ilustra en la Figura 1. Una variedad de sustancias en polvo y / o cristalinos se puede utilizar e...

Discusión

Este papel y el protocolo descrito en el presente documento describen la fabricación de la hormona del comprimido y / o gránulos de drogas, y el procedimiento quirúrgico para la implantación de los microgránulos subcutánea de ratones. Dependiendo de la pregunta de investigación a tratar, esta técnica se puede realizar por separado, o en combinación con la cápsula renal de los xenoinjertos de injertos de células recombinantes de próstata o xenoinjertos de tejido de próstata, que son técnicas ampliamente uti...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			EQUIPMENT & MATERIALS
Pellet press	PARR Industries	2815	3mm Punch & Die set
Analytical Balance	Ohaus	1918302	Voyager or other
Bunsen burner	Fisher Scientific	03-962Q
Dissecting microscope	Leica	L2
Deltaphase Pad Kit (reheatable wax)	Braintree Scientific	39DP	Alternative to an electric heating pad
Hot Bead sterilizer	F.S.T.	18000-45
Isoflurane Vaporizer	Supera Anesthesia Innov	VAP3000
Induction Chamber	Supera Anesthesia Innov	RES644
F/AIR Canister	Supera Anesthesia Innov	80120
4 port Manifold	Supera Anesthesia Innov	RES536
Rebreathing Circuits	Supera Anesthesia Innov	CIR529
Inlet/Outlet Fittings	Supera Anesthesia Innov	VAP203/4
Pressure Reg/Gauge	Supera Anesthesia Innov	OXY508
Oxygen Flowmeter	Supera Anesthesia Innov	OXY660
21mm Clear Tubing	Supera Anesthesia Innov	301-150
Small Mice Nose Cone	Supera Anesthesia Innov	ACC526
Sterile surgical gown	Midwest Vet Supply	350.79866.2
Surgical mask	Midwest Vet Supply	350.50111.2	2-ply w/ earloops
Sterile gauze	Midwest Vet Supply	001.14100.2	2 x 2 inches
Sterile Gloves	Kimberly Clark	55092
Bouffant	Midwest Vet Supply	001.27100.2
Cotton Tip Applicator	Midwest Vet Supply	001.06220.2
Surgical Scrub Wash	Midwest Vet Supply	733.80010.3
Sterile Fields (Fenestrated)	General Econopak, Inc	88VCSTF
			REAGENTS
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-3292
Testosterone Proprionate	Sigma-Aldrich	T-1875
17β-estradiol	Sigma-Aldrich	E-2758
Isoflurane	Midwest Vet Supply	193.33161.3
Carprofen	Midwest Vet Supply	193.70200.3	Injectable (Rimadyl)
Betadine	Webster Veterinary	07-836-3379
Sterile saline	Midwest Vet Supply	193.74504.3	NaCl 0.9%, Injectable
			SURGICAL INSTRUMENTS
Straight Sharp/Blunt Scissors	Fine Scientific Tools (F.S.T.)	14054-13
Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved)	F.S.T.	11055-10
Fine Iris scissors	F.S.T.	14090-09
Graefe Scalpel	F.S.T.	10071-12
Dumont #5 forceps	F.S.T.	11251-20
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	S67050	5" length
Graefe forceps (Serrated, Curved)	F.S.T.	11052-10
Graefe forceps (Serrated, Straight)	F.S.T.	11050-10
Vicryl Suture	Midwest Vet Supply	295-92100.2	4-0, FS-2, Absorbable
Needle Holder w/ scissor action	F.S.T.	12002012
Wound Clips	Braintree Scientific	ACS CS	May use 7mm or 9mm clips
Reflex Wound Clipper	F.S.T.	12031-09	Correspond w/ wound clip size
Would Clip Remover	F.S.T.	12033-00	Universal
Sterilization Container	F.S.T.	20810-01	Any autoclavable container will do
Syringe w/ needle	BD	148292C	1cc, 25Gx1
Ear Tag Applicator	National Band & Tag Co.	1005s1	Alternative to ear notching
Small Animal Ear Tags	National Band & Tag Co.	1005-1