Почечная капсула ксенотрансплантации и подкожной гранулы Имплантация по оценке простаты канцерогенеза и доброкачественной гиперплазии предстательной железы

Резюме

Опишем производства сжатого гормонов гранул, а также подкожный хирургической имплантации мышам. Эта стратегия может быть объединен с ростом клеток и тканей ксенотрансплантатов под почечную капсулу бестимусных голых мышей для оценки гормонального канцерогенеза и регулирование роста доброкачественных простаты.

Аннотация

Новые методы лечения в течение двух распространенных заболеваний простаты, рака предстательной железы (протяжении) и доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ), в решающей степени зависеть экспериментов, оценивающих свою гормональную регуляцию. Секс стероидные гормоны (в частности, андрогенов и эстрогенов) играют важную роль в PRCA и ДГПЖ, мы исследовать их соответствующие роли в стимулировании роста простаты и канцерогенез у мышей с экспериментов с использованием сжатых гормонов гранул. Гормональные и / или наркотиков гранулы легко производятся с пресс-гранулятор, и имплантируется в подкожную ткань мужского хозяина мыши. Мы также опишем протокол для оценки гормонального канцерогенеза путем объединения подкожной гормон гранул имплантации с ксенотрансплантации рекомбинантов простаты клеток под почечную капсулу с ослабленным иммунитетом мышей. Кроме того, подкожный гормон осадок имплантации, в сочетании с почечной капсулы ксенотрансплантации ДГПЖ ткани, является полезным для лучшего понимания гормональной регуляции доброкачественной Простаели рост, и для тестирования новых методов лечения, направленных половых стероидных гормонов пути.

Введение

Рак предстательной железы (протяжении) и доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ) значительные тяготы здоровья. PRCA является вторым наиболее распространенным солидный рак органов у мужчин и одной из ведущих причин онкологических заболеваний смерть ^1. ДГПЖ является также широко распространена среди пожилых мужчин, и, по оценкам, что клинические проявления ДГПЖ, снижение симптомы мочевых путей (СНМП), повлияет на 50-90% мужчин ^2. В то время как андрогены и эстрогены, как известно, играть важную роль в PRCA и ДГПЖ, наше понимание гормональных механизмов, лежащих в основе канцерогенеза и рост остается неполным ^3,4. Простые и генетически податливые животные модели лежат в основе исследований, которые будут решать эти приоритеты в исследовании простаты. В гормонов отзывчивых заболеваний, таких как PRCA и ДГПЖ, использование подкожной, медленных гормонов релиз гранул, в изоляции или в сочетании с почечной капсулы ксенотрансплантации (передача клеток, тканей или органов от одного вида в другой) в immunocompromised хозяин мыши, обеспечивает простой и воспроизводимый метод изучения гормональной регуляции роста и канцерогенеза.

Подкожный гормон осадок имплантация является простым и воспроизводимым методика исследования гормональной регуляции канцерогенеза и доброкачественной роста в простате ^5. Подкожной имплантации взрослых самцов мышей с 25 мг тестостерона (Т) и 2,5 мг 17β-эстрадиола (Е _2), вызывает увеличение в сыворотке E ₂ и постепенное снижение Т, воссоздавая динамический гормональный фон старения мужчин ^5,6. Кроме того, эта модель повторяет многие из клинических признаков ДГПЖ-СНМП ^5,7. Альтернативные способы введения гормона включают введение устный / через зонд или внутрибрюшинного введения, которые вызывают стресс для грызуна, менее последовательны в реализации такого же количества препарата в течение долгого времени, и являются более трудоемкими, чем одноразовый хирургической имплантации. Другие подкожные режимы для чOrmone и / или доставки лекарств включают Silastic капсулы ^8. В то время как у нас есть опыт работы с использованием Silastic капсул, сжатые гранулы выступает за их простоту использования и воспроизводимости. Кроме того, релиз темпы сжатых гормонов гранул лучше имитировать динамические половых стероидных гормонов соотношения, наблюдаемые в стареющих мужчин ^5,7.

С развитием генной ослабленным иммунитетом мышей, многочисленные естественных условиях модельных систем в которых применяются методы ксенотрансплантации были разработаны для изучения широкого спектра нормальных и пораженных тканей. Есть несколько основных категорий ксенотрансплантации. Тканевые ксенотрансплантатов состоять из небольшой кусочек неповрежденной ткани, который может быть нормальным структура, злокачественная опухоль, или доброкачественной роста. Szot соавт. (2007) недавно подсветкой почечной капсулы ксенотрансплантации панкреатических островков ^9. Aamdal соавт. (1985) описал капсулу почки ксенотрансплантации из 27 клеток рака человеком линий в имmunocompromised мышь проходит ^10. Трансплантатов также может состоять из одной иммортализированной клеточной линии (раковой или не онкогенных), или может состоять из иммортализированной клеточной линии, в сочетании с клетками, выделенными из мезенхимы (клетка рекомбинантного трансплантата).

Мы выступаем ксенотрансплантации клеточных рекомбинантами исследовать соответствующие роли стромы и эпителия в развитии PRCA и ДГПЖ. Кунья и др.. (1980) был первым, кто сообщил, что, когда взрослых мышей эпителий мочевого пузыря сочетается с эмбрионального урогенитального синуса мезенхимы (UGM) и ксенотрансплантированной под капсулу почки самцов мышей хозяев, ткань развивается в структуры, напоминающие ацинусы простаты ^11. Норман и др.. (1986) показали, что взрослые мыши предстательной железы эпителия протоков и UGM, в сочетании в тканевых рекомбинантами, пройти протоков роста и морфогенеза ветвления ^12. Хейворд и др.. (1988) показали, что человеческий эпителий простаты реагирует на индуктивные плода мesenchyme аналогично ^13. Гормональный модель канцерогенеза в простате, путем объединения увековечены предстательной железы человека линии эпителиальных клеток ДГПЖ-1 с UGM, было впервые сообщено Ван и др.. ¹⁴ (2001) и широко используется в нашей лаборатории ^15. Эта модель хорошо подходит для понимания прогрессирования PRCA потому доброкачественной эпителий переходит в метастатической болезни, моделирования передовые PRCA у человека ^5. Поскольку конкретные компоненты могут быть генетически манипулировать, клетка рекомбинантного прививка особенно полезна в качестве подхода для оценки стромальных-эпителиальных взаимодействий.

Другие сайты, подходящие для ксенотрансплантации являются внутрикожные, подкожные и Ортотопическая места ^16. В зависимости от ткани и болезни процессе интерес, они могут быть подходящими альтернативные подходы. Для изучения простаты гормонального канцерогенеза и доброкачественной регуляции роста, мы выбираем почечной капсулысайт для ксенотрансплантации из-за его высоких трансплантата принять ставку, обильные кровоснабжение, и способность имплантировать большее количество ксенотрансплантаты в один ограниченном месте ^16. Кроме того, гормональный манипуляция хост мыши, что приводит к атрофии предстательной железы ограничивает использование простаты ортотопической трансплантации ^16.

Этот протокол описывает методы сжатого гормон / наркотиков производства пеллет и хирургической имплантации, а также почечной капсулы ксенотрансплантации из человеческих клеток простаты и тканевых трансплантатов. Вместе эти методы обеспечивают более чувствительного анализа, чтобы определить, является ли генетически модифицированные мыши более чувствительны к PRCA и / или ДГПЖ, чем инициирования контрольных штаммов. Ксенотрансплантации является мощным средством в естественных условиях оценке потенциала экспериментальных клеток для разработки гистологические и молекулярные особенности злокачественных опухолей, а также анализа на новых стратегий лечения для широкого спектра доброкачественных и злокачественных заболеваний.

протокол

1. Подготовка сжатого гормона / наркотиками Пелле

1. Эта процедура должна быть сделано в области химической безопасности капотом, а носить лабораторный халат, перчатки, маску, защитные очки и шляпу. Для предотвращения перекрестного загрязнения, крайне важно, что осадок Оборудование для производства тщательно очищается 70% этанолом до и после изготовления каждого вида гранул.
2. Использование аналитический масштаб и весят бумагу, измерить необходимое количество порошка гормона / наркотиков. Приблизительно 5% дополнительный материал рекомендуется для размещения потери во время прессования.
3. Некоторые гормоны / наркотики требуют связующего или наполнителя, которая смешивается до производства пеллет. Например, чтобы изготовить 2,5 мг гранул из 17β-эстрадиола, объединить гормона с 22,5 мг холестерина, что приводит к 25 мг таблетки.
4. Тщательно передачи в плашек, место под пресс и нажмите рычаг твердо вниз, чтобы сжать осадок. Используйте постоянное давление для поддержания постоянной поверхность являютсяк объему.
5. Следующая обратного держатель штампа и нажмите на рычаг вниз, чтобы выпустить осадок.
6. Осмотрите осадок на целостность и определить, если конечная масса находится в пределах желаемого диапазона. Допустимый диапазон составляет разница в конечной массы ± 5% (например, допустимый диапазон для 25 мг гранул является 23.8-26.3 мг).
7. Пеллеты могут быть сделаны до операции и хранить (условия и продолжительность хранения зависит от стабильности гормона или лекарственного средства, используемого в производстве окатышей). Гормональные таблетки можно приобрести в качестве альтернативы для производства пеллет. Покупка пеллет позволяет избежать использования класса препаратов нелекарственных, так как они будут сформулированы и усугубляется.

2. Подготовка Сотовые рекомбинантных ксенотрансплантатов

1. Урожай и культура первичной мыши мочеполовой мезенхимы (УГМ) стромальных клеток для менее 4 недель до собираются для подсчета.
2. Культура увековечены простаты линии эпителиальных клеток в обычном мучитьсяионный и собирать для подсчета. В этом примере подготовки клеток рекомбинантных трансплантатов путем смешивания 100000 BPH-1 на эпителиальных клеток трансплантата с 250 000 UGM стромальных клеток на трансплантата в суспензии.
3. Гранул клетки вместе и повторно приостанавливать в достаточно нейтрализовали 1 типа коллагена хвоста крысы, чтобы сделать необходимое количество трансплантатов, каждый в объеме 25 мкл до 50 мкл.
4. Набор рекомбинантных трансплантатов при 37 ° С в течение 15 минут и затем покрывают питательной среды для хранения при 37 ° С в течение до 48 часов перед прививкой.

3. Подготовка тканей ксенотрансплантатов

1. Поддерживать универсальных мер предосторожности для крови патогенов во время закупок тканей и хирургического вмешательства. После утверждения Экспертный совет организации и информированного согласия, получить свежую ткань простаты от хирургической резекции. Для изучения роста ДГПЖ, ткани могут быть собраны из трансуретральной резекции простаты или простых процедур простатэктомии. Первичные ксенотрансплантаты из PRCA или доброкачественной Простели ткань может быть получена из радикальной простатэктомии образцов.
2. Магазин собирают ткань в изотонических буферных клеток массовой информации или физиологического раствора на льду. В зависимости от ткани и условий хранения, образцы могут храниться до 24 часов до приготовления тканевых трансплантатов. Обычная практика заключается в разделении образца на три части, с одной секции фиксированной в формалине и регулярно обработанного для гистологического исследования, одна часть быстро замораживали для молекулярного анализа и одна часть делится на ткани ксенотрансплантаты (1-3 мм в размерах).

4. Подготовка Fire полированного стекла пипетки

1. Ношение защиты глаз, лабораторные пальто и термостойкие перчатки, место стекло пипетки Пастера наконечник в Бунзена горелки пламени примерно в 60 ° угла, чтобы начать.
2. Держать постоянную, легкое движение в пипетку так, чтобы избежать горячих пятен.
3. Ничья кончик тонко и пожарную для ногтей с целью того, чтобы быть слегка изогнутые конец с округлой, закрыты наконечник.

5. Подготовка инструментов и хирургической Люкс

1. Автоклав все инструменты. До операции, проверять все документы, заботясь, чтобы сохранить стерильное поле.
2. Настройка стерильную хирургическую область с впитывающие прокладки, рассечение рамки, анестезии носового конуса, хирургических инструментов и отопления лампы, направленной в сторону рабочей зоны. Для стерилизации инструментов в между мышами, prewarm шарик стерилизатор.
3. Собрать и тест наркозный аппарат; весят газа поглотитель.
4. Использование микроволновой печи, тепловые восковые колодки до 5 мин (с шагом 1 мин, разминание восковую площадку для объединения расплавленные и нерасплавленные воск) на 70-80%, пока все воск не равномерно таял. На ощупь, обеспечить площадку не слишком жарко и место под пустую клетку восстановления грызунов.
5. Дон средства индивидуальной защиты для грызунов хирургических процедур, в том числе хирургической маской, капота, перчатки и платье.

6. Хирургическая процедура: Почечная капсула ксенотрансплантации

1. Все процедуры, связанные с научно-исследовательских животных следует проводить с одобрения институциональных уходу и использованию животных комитетов. До введения анестезии, наблюдать мышь, чтобы обеспечить здоровье и благополучие.
2. Место мыши в камеру для индукции изофлурановой анестезии на 3-5%. Когда животное перестал двигаться и частота дыхания уменьшилась, трансфер в носовой конус в положении лежа, и поддержания анестезии в 1-3%.
3. Если необходимо, используйте ножницы брить спину мыши. Это не требуется при использовании бестимусных голых (пи / пи) мышей.
4. Приложите усилие для лямки расширенной задней ноги, чтобы оценить адекватность анестезии. Если мышь реагирует на давление, требуется больше времени для анестезии вступили в силу. При необходимости отрегулируйте анестезии поток немного для достижения адекватной анестезии.
5. Когда мышь адекватно наркозом, дезинфицировать места операции с хирургическим йода раствор (Бетадин) с последующим70% спирта.
6. Дон стерильные перчатки и платье; применять стерильные шторы в хирургическое сайте. Поднимите заднюю кожу с парой зубчатых щипцов, и используя грубые ножницы сделать 2-3 см спинной средней линии разрез.
7. Использование тупые ножницы или зонд, отделить подлежащей дерме от стенки тела (по обе стороны от разреза двустороннего прививки или на одной стороне одностороннего прививки).
8. Измените мышь в боковом положении, и определить местоположение почки, просмотрев почечной профиля через мышечной стенки. Применяя нежный ручной давление с большим и указательным пальцами на животе может помочь с визуализации внутренних органов.
9. Использование тонких ножниц радужной оболочки глаза, и заботясь, чтобы избежать крупных сосудов и спинномозговых нервов, сделать 1 см разрез в стене параллельно тела к позвоночнику. Расширить этот разрез 1,5-2,0 см (чуть больше, чем длинной оси почки), осторожно открыв ножницы шире разместив их в начальной разрез.
10. Экстериоризироваться почку, слегка надавливая вне мышечной стенки по обе стороны от почки с помощью указательным и большим пальцем. Школьный кожа края ниже экстериоризированного почки, которая будет опираться на стенки тела. В то время как почки выводили, поддержания гидратации почечной капсулы, применяя стерильный физиологический раствор.
11. Использование тонких # 5 щипцы осторожно поднимите капсулу почки из паренхимы почки и с тонкой скальпелем, сделать мм разрез 2 -4 в капсуле. Размер разреза определяется размером трансплантата, но должно быть сведено к минимуму, чтобы поддерживать целостность капсулы.
12. Манипулирование стеклянной пипетки Пастера, что была составлена ​​тонкий и противопожарной полировка с закругленным закрытого конца капсулы в соответствии с касательной к поверхности почки. Аккуратно откройте небольшой карман капсулы для прививок, используя большую заботу, чтобы не повредить паренхимы почек.
13. Разрез край капсулы почки поднимается с тонким пинцетом, и трансплантат Iвставляете в карман под капсулой с помощью огневой полировкой стеклянной пипетки. Несколько трансплантаты могут быть помещены под почечную капсулу и равномерно распределены на поверхности почек.
14. Если в ходе трансплантации, капсула становится обезвоженной, она должна быть увлажнена с применением стерильного физиологического раствора.
15. При прививке завершена, осторожно поднимите боковые стороны мышц стенки разреза заменить почку обратно в полость тела. Заметим, что трансплантаты не выскользнуть из-под капсулы.
16. Закройте мышечной стенки с одним швом (4-0, FS-2 викрил шва). Хирургическая процедура может повторяться на противоположной почки путем перестановки мышь.
17. Когда прививки завершена, мышь может претерпевать подкожной имплантации гранул в течение того же хирургического вмешательства (см. Протокол шаг 7).
18. Использование зубчатых щипцов, совместите разрез кожи края и нанести 2-3 операционной раны клипы, чтобы закрыть разрез. Администрирование обезболивание (мы используем 5-10 мг / кг carprofан помощью подкожной инъекции) и поместите курсор в боковом лежачем положении в Восстановление клетке. Обеспечить поддержание температуры тела с теплом от лампы или грелку. Соблюдайте для полного восстановления мыши, которая должна произойти менее чем за 15 минут.
19. Мыши должны соблюдаться в течение следующего 24 часов на признаки послеоперационной боли, кровотечения и / или другие осложнения. Регулярно проверяйте хирургический разрез на наличие признаков инфекции.
20. Удалить раны клипы с хирургическим удалением рана клип устройства 7-14 дней после операции.

7. Хирургическая процедура: Подкожный Пелле Имплантация

1. Повторите шаги 6.1-6.5 от почечной капсулы ксенотрансплантации хирургическую процедуру.
2. Поднимите заднюю кожу парой щипцов кожи, и используя грубые ножницы сделать 1-2 см спинной средней линии разрез.
3. Использование тупые ножницы или зонд, отделить основные дермы от стенки тела в краниальном направлении.
4. Использование щипцов кожи,осторожно поднимите черепной аспект разрез кожи, и проведение гормон осадок осторожно с прямыми, зубчатыми щипцами, вставьте шарик и выпустить на шиворот, в кармане, созданной с тупым зондом.
5. Повторите шаги 6.18-6.20 от почечной капсулы ксенотрансплантации хирургическую процедуру. При выполнении подкожной гранул имплантации только, использовать 1 хирургическое клип раны, чтобы закрыть хирургический разрез.

Результаты

В зависимости от проверяемой гипотезы, почечной капсулы ксенотрансплантации ткани или клеток рекомбинантов могут быть выполнены по отдельности, либо в сочетании с подкожной имплантации гранул гормон. Схема гипотетического эксперимента, сочетающей почечную капсулу эксперимент к?...

Обсуждение

Эта статья и протокол изложил здесь описать производство сжатого гормона и / или гранул наркотиков и хирургическую процедуру для подкожного гранул имплантации мышей. В зависимости от вопроса исследования должны быть рассмотрены, эта методика может быть выполнена отдельно, или в сочет...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
			EQUIPMENT & MATERIALS
Pellet press	PARR Industries	2815	3mm Punch & Die set
Analytical Balance	Ohaus	1918302	Voyager or other
Bunsen burner	Fisher Scientific	03-962Q
Dissecting microscope	Leica	L2
Deltaphase Pad Kit (reheatable wax)	Braintree Scientific	39DP	Alternative to an electric heating pad
Hot Bead sterilizer	F.S.T.	18000-45
Isoflurane Vaporizer	Supera Anesthesia Innov	VAP3000
Induction Chamber	Supera Anesthesia Innov	RES644
F/AIR Canister	Supera Anesthesia Innov	80120
4 port Manifold	Supera Anesthesia Innov	RES536
Rebreathing Circuits	Supera Anesthesia Innov	CIR529
Inlet/Outlet Fittings	Supera Anesthesia Innov	VAP203/4
Pressure Reg/Gauge	Supera Anesthesia Innov	OXY508
Oxygen Flowmeter	Supera Anesthesia Innov	OXY660
21mm Clear Tubing	Supera Anesthesia Innov	301-150
Small Mice Nose Cone	Supera Anesthesia Innov	ACC526
Sterile surgical gown	Midwest Vet Supply	350.79866.2
Surgical mask	Midwest Vet Supply	350.50111.2	2-ply w/ earloops
Sterile gauze	Midwest Vet Supply	001.14100.2	2 x 2 inches
Sterile Gloves	Kimberly Clark	55092
Bouffant	Midwest Vet Supply	001.27100.2
Cotton Tip Applicator	Midwest Vet Supply	001.06220.2
Surgical Scrub Wash	Midwest Vet Supply	733.80010.3
Sterile Fields (Fenestrated)	General Econopak, Inc	88VCSTF
			REAGENTS
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-3292
Testosterone Proprionate	Sigma-Aldrich	T-1875
17β-estradiol	Sigma-Aldrich	E-2758
Isoflurane	Midwest Vet Supply	193.33161.3
Carprofen	Midwest Vet Supply	193.70200.3	Injectable (Rimadyl)
Betadine	Webster Veterinary	07-836-3379
Sterile saline	Midwest Vet Supply	193.74504.3	NaCl 0.9%, Injectable
			SURGICAL INSTRUMENTS
Straight Sharp/Blunt Scissors	Fine Scientific Tools (F.S.T.)	14054-13
Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved)	F.S.T.	11055-10
Fine Iris scissors	F.S.T.	14090-09
Graefe Scalpel	F.S.T.	10071-12
Dumont #5 forceps	F.S.T.	11251-20
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	S67050	5" length
Graefe forceps (Serrated, Curved)	F.S.T.	11052-10
Graefe forceps (Serrated, Straight)	F.S.T.	11050-10
Vicryl Suture	Midwest Vet Supply	295-92100.2	4-0, FS-2, Absorbable
Needle Holder w/ scissor action	F.S.T.	12002012
Wound Clips	Braintree Scientific	ACS CS	May use 7mm or 9mm clips
Reflex Wound Clipper	F.S.T.	12031-09	Correspond w/ wound clip size
Would Clip Remover	F.S.T.	12033-00	Universal
Sterilization Container	F.S.T.	20810-01	Any autoclavable container will do
Syringe w/ needle	BD	148292C	1cc, 25Gx1
Ear Tag Applicator	National Band & Tag Co.	1005s1	Alternative to ear notching
Small Animal Ear Tags	National Band & Tag Co.	1005-1