Renale Capsule xenotrapianto e sottocutanea Pellet impianto per la valutazione di carcinogenesi della prostata e dell'iperplasia prostatica benigna

Riepilogo

Descriviamo la fabbricazione di pellet ormonali compressi, nonché sottocutanea impianto chirurgico in topi. Questa strategia può essere combinato con la crescita di cellule e tessuti xenotrapianti sotto la capsula renale di topi nudi atimici valutare cancerogenesi ormonale e regolazione della crescita prostatica benigna.

Abstract

Nuove terapie per due malattie comuni della prostata, il cancro alla prostata (PRCA) e iperplasia prostatica benigna (BPH), dipendono in modo critico sugli esperimenti che valutano la loro regolazione ormonale. Ormoni sessuali steroidei (in particolare androgeni ed estrogeni) sono importanti in PRCA e BPH, si sonda i loro rispettivi ruoli nell'indurre la crescita della prostata e carcinogenesi in topi con esperimenti usando pellet ormonali compressi. Ormonali e / o droga pellet sono facilmente realizzati con una pressa pellet, e chirurgicamente impiantati nel tessuto sottocutaneo dell'host topo maschio. Noi descriviamo anche un protocollo per la valutazione della carcinogenesi ormonale combinando sottocutanea dell'ormone pellet impianto con xenotrapianto di cellule ricombinanti prostata sotto la capsula renale di topi immunocompromessi. Inoltre, l'ormone sottocutanea pellet impianto, in combinazione con la capsula renale xenotrapianto di tessuto di BPH, è utile per capire meglio regolazione ormonale del prost benignamangiato la crescita, e per testare nuove terapie mirate sesso steroidi percorsi ormonali.

Introduzione

Il cancro della prostata (PRCA) e iperplasia prostatica benigna (BPH) sono significativi oneri sanitari. PRCA è il secondo tumore solido più frequente negli uomini ed una delle principali cause di cancro legate morte ^1. BPH è anche molto diffusa tra gli uomini più anziani, e si stima che la manifestazione clinica di BPH, sintomi delle basse vie urinarie (LUTS), interesserà 50-90% degli uomini ^2. Mentre androgeni ed estrogeni sono noti per essere importanti in PRCA e BPH, la nostra comprensione dei meccanismi ormonali che sono alla base della carcinogenesi e la crescita rimane incompleto ^3,4. Modelli animali semplici e geneticamente trattabili sono alla base degli studi che affronteranno tali priorità nella ricerca della prostata. In ormonali malattie reattive come PRCA e BPH, l'uso del sottocutaneo, pellets ormone di rilascio lento, isolatamente o in combinazione con capsula renale xenotrapianto (il trasferimento di cellule, tessuti o organi da una specie all'altra) nel immunocompospite del mouse romised, fornisce un metodo semplice e riproducibile per lo studio regolazione ormonale della crescita e carcinogenesi.

Sottocutanea ormone pellet impianto è una tecnica semplice e riproducibile per studiare regolazione ormonale della carcinogenesi e formazione benigna della prostata ^5. Impianto sottocutaneo di topi maschi adulti con 25 mg di testosterone (T) e 2,5 mg di 17β-estradiolo _(E2), causa un aumento nel siero E ₂ e graduale diminuzione della T, ricreando l'ambiente ormonale dinamico di uomini di invecchiamento ^5,6. Inoltre, questo modello riassume molte delle caratteristiche cliniche di BPH-LUTS ^5,7. Metodi alternativi di somministrazione di ormoni comprendono la somministrazione orale / sonda gastrica o iniezione intraperitoneale, che causare disagio al roditore, sono meno consistenti nel fornire la stessa quantità di farmaco nel tempo, e sono più di un impianto chirurgico di una volta intensità di lavoro. Altri modi sottocutanei per hOrmone e / o la somministrazione di farmaci includono capsule Silastic ^8. Mentre abbiamo anche l'esperienza con l'utilizzo di capsule Silastic, pellets compressi sono favoriti per la loro facilità d'uso e riproducibilità. Inoltre, i tassi di rilascio di pellet ormonali compressi meglio imitano gli ormoni steroidei sessuali rapporti dinamici osservati in uomini di invecchiamento ^5,7.

Poiché lo sviluppo di topi geneticamente immunocompromessi, numerosi sistemi modello in vivo dotati di tecniche xenotrapianto sono stati sviluppati per lo studio di una ampia varietà di tessuti normali e malati. Ci sono diverse categorie di base di xenotrapianto. Xenotrapianti tessuti costituiti da un piccolo pezzo di tessuto intatto, che può essere una struttura normale, tumore maligno, o formazione benigna. Szot et al. (2007) hanno recentemente illuminato capsula renale xenotrapianto di insule pancreatiche ^9. Aamdal et al. (1985) ha descritto capsula renale xenotrapianto di 27 linee cellulari tumorali umane in imMouse munocompromised ospita ^10. Innesti possono anche essere costituiti da una singola linea di cellule immortalizzate (cancerose o non-oncogeno), o possono essere costituiti da una linea di cellule immortalizzate combinata con cellule isolate dal mesenchima (cella innesto ricombinante).

Siamo favorevoli xenotrapianto di cellule ricombinanti per sondare i rispettivi ruoli di stroma ed epitelio nello sviluppo di PRCA e BPH. Cunha et al. (1980) fu il primo a riferire che quando adulto murino epitelio della vescica è combinato con mesenchima embrionale urogenitale sinusale (UGM) e eterotrapiantate sotto la capsula renale di topi maschi padroni di casa, il tessuto si sviluppa in strutture che assomigliano alla prostata acini ^11. Norman et al. (1986) ha mostrato che topo adulto prostatica duttale e UGM, se combinati in ricombinanti tessuti, subiscono la crescita duttale e la ramificazione morfogenesi ^12. Hayward et al. (1988) ha mostrato che epitelio prostatico umano risponde induttivo m fetaleesenchyme in modo simile ^13. Un modello ormonale della carcinogenesi della prostata, combinando la prostata umana immortalizzate linea cellulare epiteliale BPH-1 con UGM, è stata riportata da Wang et al. ¹⁴ (2001) ed è stato ampiamente utilizzato nel nostro laboratorio ^15. Questo modello è adatto per comprendere PRCA progressione perché benigna dell'epitelio prostatico si trasforma in malattia metastatica, modellazione avanzata PRCA negli esseri umani ^5. Poiché i componenti specifici possono essere geneticamente manipolati, cellule innesto ricombinante è particolarmente utile come approccio per valutare le interazioni stroma-epiteliale.

Altri siti idonei per xenotrapianto sono intradermica, sottocutanea e luoghi ortotopici ^16. A seconda del processo di tessuto e la malattia di interesse, questi possono essere approcci alternativi adatti. Per lo studio di carcinogenesi della prostata ormonale e regolazione della crescita benigna, scegliamo la capsula renalesito per xenotrapianto grazie alle sue innesto superiori prendere velocità, abbondante afflusso di sangue, e la capacità di impiantare un numero maggiore di xenotrapianti in un sito limitato ^{a 16.} Inoltre, la manipolazione ormonale del mouse host che provoca atrofia prostatica limita l'uso della prostata ortotopico innesto ^16.

Questo protocollo descrive le tecniche di produzione dell'ormone compressa / droga pellet e impianto chirurgico, così come capsula renale xenotrapianto di cellule della prostata e tessuti umani innesti. Insieme, queste tecniche forniscono un saggio sensibile per determinare se un topo geneticamente modificato è più suscettibile di PRCA e / o BPH iniziazione di ceppi di controllo. Xenotrapianto è una tecnica potente per la valutazione in vivo del potenziale delle cellule sperimentali per sviluppare istologiche e molecolari di malignità, nonché un saggio per strategie di trattamento innovativi per una vasta gamma di malattie benigne e maligne.

Protocollo

1. Preparazione di Compressed ormone / Drug Pellet

1. Questa procedura deve essere eseguita in una cappa di sicurezza chimica mentre indossa un camice da laboratorio, guanti, mascherina, occhiali di sicurezza, e il cofano. Per evitare la contaminazione incrociata, è fondamentale che l'apparecchiatura che crea pellet è completamente pulito con etanolo al 70% prima e dopo la fabbricazione di ciascun tipo di pellet.
2. Utilizzando una bilancia analitica e pesare la carta, misurare quantità desiderata di polvere di ormone / droga. Circa il 5% di materiale in più si raccomanda di accogliere la perdita durante la pressatura.
3. Alcuni ormoni / farmaci richiedono un agente o un riempitivo di legame, che è mescolato prima di pellet fabbricazione. Ad esempio, la produzione di un 2,5 mg pellet di 17β-estradiolo, l'ormone combinare con 22,5 mg di colesterolo, che si traduce in un pellet 25 mg.
4. Trasferire attentamente insieme die, posto sotto la pressa e spingere la leva con decisione verso il basso per comprimere i pellet. Utilizzare una pressione costante per mantenere costante la superficie sonoun rapporto volume.
5. Successivo inverse portastampi e abbassare la leva per rilasciare il pellet.
6. Ispezionare pellet per l'integrità e determinare se la massa finale è nel raggio desiderato. Un intervallo accettabile una differenza ± 5% in massa finale (ad esempio, un intervallo accettabile per un pellet di 25 mg è 23,8-26,3 mg).
7. I pellet possono essere fatte prima dell'intervento e conservati (condizioni e la durata dello stoccaggio dipende dalla stabilità del ormonale o farmaco usato nella produzione di pellet). Pellets ormonali possono essere acquistati come alternativa a pellet produzione. L'acquisto pellet evita l'uso di farmaci di qualità non farmaceutici dal momento che verranno formulate e aggravati.

2. Preparazione di cellule ricombinanti Xenotrapianti

1. Harvest e la cultura principale del mouse mesenchima urogenitale (UGM), le cellule stromali per meno di 4 settimane prima di essere raccolti per il conteggio.
2. Cultura immortalato prostata linee cellulari epiteliali nel solito fashion e raccogliere per il conteggio. Per questo esempio, preparare cellulari innesti ricombinanti mescolando 100.000 cellule BPH-1 epiteliali per innesto con 250.000 UGM cellule stromali per innesto in sospensione.
3. Cellule pellet insieme e risospendere in abbastanza collagene di tipo 1 neutralizzato ratto coda per numero desiderato di innesti, ciascuna in un volume di 25 pl a 50 pl.
4. Impostare innesti ricombinanti a 37 ° C per 15 minuti e poi coprire con terreno di coltura per la conservazione a 37 ° C per 48 ore prima di innesto.

3. Preparazione del tessuto Xenotrapianti

1. Mantenere le precauzioni universali per via ematica patogeni durante approvvigionamento dei tessuti e la procedura chirurgica. Dopo l'approvazione comitato di revisione istituzionale e il consenso informato, avere tessuto prostatico fresco di resezione chirurgica. Per gli studi di crescita BPH, tessuti possono essere raccolte da resezione transuretrale della prostata o semplici procedure prostatectomia. Xenotrapianti primarie di PRCA o prost benignatessuto mangiato può essere ottenuto da campioni di prostatectomia radicale.
2. Conservare tessuto raccolto in mezzi cellule isotonica tamponata salina normale o su ghiaccio. A seconda delle condizioni dei tessuti e di stoccaggio, i campioni possono essere conservati per un massimo 24 ore prima della preparazione di innesti di tessuto. Pratica comune è di dividere il campione in tre pezzi, con una sezione fissato in formalina ed ordinariamente trattati per istologia, un pezzo scatto congelato per l'analisi molecolare e un pezzo ulteriormente suddivisa in xenotrapianti di tessuto (1-3 mm di dimensioni).

4. Preparazione del fuoco lucido pipetta di vetro

1. Guanti resistenti indossare occhiali protettivi, camice da laboratorio e di calore, posto vetro pipetta Pasteur punta nel becco Bunsen fiamma ad un angolo di circa 60 ° per iniziare.
2. Mantenere una costante, lieve movimento alla pipetta in modo da evitare punti caldi.
3. Disegna la punta sottile e fuoco lucidare con l'obiettivo di essere un finale leggermente curva con una rotonda, chiuso punta.

5. Preparazione di strumenti chirurgici e Suite

1. Sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti. Prima dell'intervento, ispezionare tutti gli strumenti, avendo cura di mantenere il campo sterile.
2. Impostare area chirurgica sterile con tamponi assorbenti, portata dissezione, anestesia naso a cono, strumenti chirurgici e la lampada di riscaldamento diretto verso l'area di lavoro. Per sterilizzare gli strumenti tra topi, Preriscaldare tallone sterilizzatore.
3. Montare ed apparecchi di anestesia prova; pesare scavenger gas.
4. Utilizzando le microonde, pastiglie cera calore per 5 minuti (in incrementi di 1 min, impastare il pad cera per coniugare fuso e unmelted cera) all'accensione 70-80%, fino a quando tutta la cera è uniformemente sciolto. Al tatto, assicura il pad non è troppo caldo e posto sotto la gabbia di recupero roditori vuoto.
5. Don dispositivi di protezione individuale per le procedure chirurgiche di roditori, tra cui mascherina chirurgica, cappellino, guanti e camice.

6. Procedura chirurgica: renale Capsule xenotrapianto

1. Tutte le procedure che coinvolgono gli animali di ricerca devono essere eseguite con l'approvazione dei comitati per la cura degli animali istituzionale e di utilizzo. Prima dell'induzione dell'anestesia, osservare il mouse per garantire la salute e il benessere.
2. Posizionare il mouse nella camera di induzione di anestesia isoflurano al 3-5%. Quando l'animale ha smesso di muoversi e la frequenza respiratoria è diminuito, trasferimento a cono in posizione prona, e mantenere l'anestesia al 1-3%.
3. Se necessario, utilizzare tagliatori di radere la parte posteriore del mouse. Questo non è necessario quando si utilizza atimici nudi (nu / nu) topi.
4. Applicare una pressione decisa per la tessitura del piede posteriore esteso per valutare l'adeguatezza dell'anestesia. Se il mouse risponde alla pressione, è necessario più tempo per l'anestesia abbia effetto. Se necessario, regolare il flusso di anestesia leggermente per raggiungere l'anestesia adeguata.
5. Quando il mouse viene adeguatamente anestetizzato, disinfettare il sito chirurgico con iodio soluzione chirurgica (Betadine), seguita da70% di alcol.
6. Don guanti sterili e camice, applica teleria sterile al sito chirurgico. Sollevare la pelle torna con un paio di pinze dentate, e utilizzando le forbici grossolani fanno un cm dorsale mediana incisione 2-3.
7. Utilizzando forbici smussate o una sonda, separare il derma sottostante dalla parete del corpo (su entrambi i lati dell'incisione per l'innesto bilaterale o su un lato per l'innesto unilaterale).
8. Riposizionare il mouse in posizione laterale, e identificare la posizione del rene visualizzando il profilo renale attraverso la parete muscolare. Applicare una leggera pressione manuale con il pollice e l'indice sull'addome può aiutare con la visualizzazione organi interni.
9. Usando sottili forbici iris, e avendo cura di evitare grandi vasi e nervi spinali, fare un 1 centimetro incisione nella parete del corpo parallelo alla colonna vertebrale. Amplia questa incisione di 1,5-2,0 cm (leggermente più lungo l'asse longitudinale del rene) aprendo delicatamente le forbici ampia dopo inserendoli nella incisione iniziale.
10. Esteriorizzare il rene applicando una leggera pressione all'esterno della parete muscolare su entrambi i lati del rene con il dito indice e pollice. Tuck pelle bordi sotto del rene esteriorizzato, che si regga sulla parete del corpo. Mentre il rene è esteriorizzato, mantenere l'idratazione della capsula renale applicando salina sterile.
11. Utilizzando belle # 5 pinze sollevare delicatamente la capsula renale dal parenchima del rene e con la multa bisturi, fare una incisione mm 2 -4 nella capsula. La dimensione della incisione è determinata dalle dimensioni della protesi, ma dovrebbe essere minimizzato per mantenere l'integrità della capsula.
12. Manipolare una pipetta Pasteur di vetro che è stata disegnata sottile e incendio lucidato con un'estremità chiusa arrotondata sotto la capsula tangente alla superficie del rene. Aprire delicatamente una piccola capsula tasca per gli innesti, con grande attenzione a non danneggiare il parenchima renale.
13. Il bordo di taglio della capsula renale viene sollevato con le pinza sottile, e l'i innestos inserita nella tasca sotto la capsula utilizzando il vetro pipetta lucidati a fuoco. Diversi innesti possono essere posizionati sotto la capsula renale e distribuiti uniformemente sulla superficie del rene.
14. Se, nel corso di un innesto, la capsula diventa disidratato, dovrebbe essere inumidito applicando salina sterile.
15. Quando l'innesto è completa, sollevare delicatamente i lati dell'incisione parete muscolare per sostituire il rene indietro nella cavità del corpo. Si osservi che gli innesti non scivolare fuori da sotto la capsula.
16. Chiudere la parete muscolare con una sola sutura (4-0, FS-2 Vicryl sutura). La procedura chirurgica può essere ripetuta sul rene controlaterale riposizionando il mouse.
17. Quando l'innesto è completa, il mouse potrebbe subire sottocutanea pellet impianto nel corso della stessa procedura chirurgica (Vedi protocollo punto 7).
18. Utilizzando pinze dentate, allineare i bordi incisione della pelle e applicare 2-3 clip ferita chirurgica per chiudere l'incisione. Somministrare analgesia (usiamo 5-10 mg / kg carprofen mediante iniezione sottocutanea) e posizionare il mouse in decubito laterale nella gabbia recupero. Assicurare il mantenimento della temperatura corporea con calore da una lampada o piastra elettrica. Osservare per il pieno recupero del mouse, che dovrebbe avvenire in meno di 15 minuti.
19. I topi devono essere osservati per la prossima 24 ore per i segni di dolore post-operatorio, sanguinamento e / o altre complicazioni. Controllare regolarmente incisione chirurgica per segni di infezione.
20. Rimuovere clip ferita con dispositivo chirurgico di rimozione della clip ferita 7-14 giorni dopo l'intervento chirurgico.

7. Procedura chirurgica: sottocutaneo Pellet impianto

1. Ripetere i passaggi 6,1-6,5 dalla capsula renale xenotrapianto procedura chirurgica.
2. Sollevare la pelle torna con un paio di pinze pelle, e utilizzando le forbici grossolani fanno un cm dorsale mediana incisione 1-2.
3. Utilizzando forbici smussate o una sonda, separare il derma sottostante dalla parete del corpo in direzione craniale.
4. Utilizzando pinze pelle,sollevare delicatamente l'aspetto craniale dell'incisione cutanea, e tenendo premuto il pellet ormone delicatamente con rette, pinze dentellate, inserire il pellet e rilasciare alla collottola, in tasca si è creato con la sonda smussato.
5. Ripetere i passaggi da 6,18-6,20 capsula renale xenotrapianto procedura chirurgica. Se si esegue per via sottocutanea pellet impianto solo, usare 1 clip ferita chirurgica per chiudere l'incisione chirurgica.

Risultati

A seconda ipotesi da testare, capsula renale xenotrapianto di tessuti o cellule ricombinanti può essere eseguita isolatamente o in combinazione con l'impianto sottocutaneo ormone pellet. Uno schema di un esperimento ipotetica che unisce esperimento capsula xenotrapianto renale con ormone sottocutanea pellet impianto è illustrato in Figura 1. Una varietà di sostanze in polvere e / o cristallini possono essere utilizzati nella fabbricazione di pellet compressi con la stampa pellet. Fi...

Discussione

Questo documento e il protocollo descritto nel presente documento descrivono la produzione di ormone compressa e / o pellets droga, e la procedura chirurgica per l'impianto sottocutaneo pellet di topi. A seconda della domanda di ricerca da affrontare, questa tecnica può essere eseguita singolarmente, o in combinazione con capsula renale xenotrapianto di cellule della prostata innesti ricombinanti o xenotrapianti tessuto della prostata, che sono tecniche ampiamente utilizzate nella ricerca prostata ^17-19....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			EQUIPMENT & MATERIALS
Pellet press	PARR Industries	2815	3mm Punch & Die set
Analytical Balance	Ohaus	1918302	Voyager or other
Bunsen burner	Fisher Scientific	03-962Q
Dissecting microscope	Leica	L2
Deltaphase Pad Kit (reheatable wax)	Braintree Scientific	39DP	Alternative to an electric heating pad
Hot Bead sterilizer	F.S.T.	18000-45
Isoflurane Vaporizer	Supera Anesthesia Innov	VAP3000
Induction Chamber	Supera Anesthesia Innov	RES644
F/AIR Canister	Supera Anesthesia Innov	80120
4 port Manifold	Supera Anesthesia Innov	RES536
Rebreathing Circuits	Supera Anesthesia Innov	CIR529
Inlet/Outlet Fittings	Supera Anesthesia Innov	VAP203/4
Pressure Reg/Gauge	Supera Anesthesia Innov	OXY508
Oxygen Flowmeter	Supera Anesthesia Innov	OXY660
21mm Clear Tubing	Supera Anesthesia Innov	301-150
Small Mice Nose Cone	Supera Anesthesia Innov	ACC526
Sterile surgical gown	Midwest Vet Supply	350.79866.2
Surgical mask	Midwest Vet Supply	350.50111.2	2-ply w/ earloops
Sterile gauze	Midwest Vet Supply	001.14100.2	2 x 2 inches
Sterile Gloves	Kimberly Clark	55092
Bouffant	Midwest Vet Supply	001.27100.2
Cotton Tip Applicator	Midwest Vet Supply	001.06220.2
Surgical Scrub Wash	Midwest Vet Supply	733.80010.3
Sterile Fields (Fenestrated)	General Econopak, Inc	88VCSTF
			REAGENTS
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-3292
Testosterone Proprionate	Sigma-Aldrich	T-1875
17β-estradiol	Sigma-Aldrich	E-2758
Isoflurane	Midwest Vet Supply	193.33161.3
Carprofen	Midwest Vet Supply	193.70200.3	Injectable (Rimadyl)
Betadine	Webster Veterinary	07-836-3379
Sterile saline	Midwest Vet Supply	193.74504.3	NaCl 0.9%, Injectable
			SURGICAL INSTRUMENTS
Straight Sharp/Blunt Scissors	Fine Scientific Tools (F.S.T.)	14054-13
Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved)	F.S.T.	11055-10
Fine Iris scissors	F.S.T.	14090-09
Graefe Scalpel	F.S.T.	10071-12
Dumont #5 forceps	F.S.T.	11251-20
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	S67050	5" length
Graefe forceps (Serrated, Curved)	F.S.T.	11052-10
Graefe forceps (Serrated, Straight)	F.S.T.	11050-10
Vicryl Suture	Midwest Vet Supply	295-92100.2	4-0, FS-2, Absorbable
Needle Holder w/ scissor action	F.S.T.	12002012
Wound Clips	Braintree Scientific	ACS CS	May use 7mm or 9mm clips
Reflex Wound Clipper	F.S.T.	12031-09	Correspond w/ wound clip size
Would Clip Remover	F.S.T.	12033-00	Universal
Sterilization Container	F.S.T.	20810-01	Any autoclavable container will do
Syringe w/ needle	BD	148292C	1cc, 25Gx1
Ear Tag Applicator	National Band & Tag Co.	1005s1	Alternative to ear notching
Small Animal Ear Tags	National Band & Tag Co.	1005-1