Rénale Capsule xénogreffe sous-cutanée et Pellet implantation pour l'évaluation de la carcinogenèse prostatique et l'hyperplasie prostatique bénigne

Résumé

Nous décrivons la fabrication de pastilles comprimées d'hormones, ainsi que l'implantation chirurgicale sous-cutanée à des souris. Cette stratégie peut être combinée avec la croissance de xénogreffes de cellules et de tissus sous la capsule rénale de souris nudes athymiques pour évaluer la carcinogenèse hormonale et la régulation de la croissance bénigne de la prostate.

Résumé

Nouvelles thérapies pour les deux maladies courantes de la prostate, le cancer de la prostate (AEPA) et l'hyperplasie bénigne de la prostate (HBP), dépendent de façon critique sur les expériences évaluant leur régulation hormonale. Hormones stéroïdes sexe (notamment les androgènes et oestrogènes) sont importants dans érythroblastopénie et l'HBP; nous sondons leurs rôles respectifs dans l'induction de la croissance de la prostate et la cancérogenèse chez la souris avec des expériences à l'aide de pastilles d'hormones compressés. Hormones et / ou de drogues pastilles sont facilement fabriqués avec une presse à pellets, et chirurgicalement implantés dans le tissu sous-cutané de l'hôte chez les souris mâles. Nous décrivons également un protocole pour l'évaluation de la carcinogenèse hormonale sous-cutanée en combinaison avec l'hormone culot implantation de recombinants xénogreffe de cellules de la prostate sous la capsule rénale de souris immunodéprimées. En outre, l'hormone sous-cutanée culot implantation, en combinaison avec capsule rénale xénogreffe de tissu de BPH, est utile pour mieux comprendre la régulation hormonale de prost bénignemangé la croissance, et de tester de nouvelles thérapies ciblant sexe stéroïde voies hormonales.

Introduction

Cancer de la prostate (AEPA) et l'hyperplasie bénigne de la prostate (HBP) sont des fardeaux pour la santé. L'érythroblastopénie est le deuxième cancer d'organe solide la plus fréquente chez les hommes et une cause majeure de cancer liés mort ^1. L'HBP est également très fréquente chez les hommes plus âgés, et il est estimé que la manifestation clinique de l'HBP, la baisse des symptômes des voies urinaires (TUBA), aura une incidence sur 50-90% des hommes ^2. Alors que les androgènes et oestrogènes sont connus pour être important dans érythroblastopénie et BPH, notre compréhension des mécanismes hormonaux qui sous-tendent la carcinogenèse et la croissance reste incomplète ^3,4. Modèles animaux simples et dociles génétiquement sous-tendent les études qui permettront de répondre à ces priorités dans la recherche de la prostate. Dans hormones maladies sensibles tels que l'érythroblastopénie et l'HBP, l'utilisation de sous-cutanée, la lenteur des pastilles d'hormones de libération, isolément ou en combinaison avec capsule rénale xénogreffe (le transfert de cellules, de tissus ou d'organes d'une espèce à une autre) dans le immunocompSouris hôte romised, fournit un procédé simple et reproductible pour l'étude de la régulation hormonale de la croissance et de la cancérogenèse.

Sous-cutanée hormone culot implantation est une technique simple et reproductible pour étudier la régulation hormonale de la carcinogenèse et la croissance bénigne de la prostate ^5. Implantation sous-cutanée de souris mâles adultes avec 25 mg de testosterone (T) et 2,5 mg de 17β-estradiol (E _2), provoque une augmentation dans le sérum E ₂ et diminution progressive de la T, de recréer l'environnement hormonal dynamique de l'homme vieillissant ^5,6. En outre, ce modèle reprend la plupart des caractéristiques cliniques de l'HBP-TUBA ^5,7. D'autres méthodes d'administration d'hormones comprennent l'administration orale / de gavage ou par injection intrapéritonéale, qui causent une détresse à l'rongeur, sont moins cohérentes dans la prestation de la même quantité de médicament dans le temps, et sont plus de main-d'œuvre d'une implantation chirurgicale d'un temps. D'autres modes de sous-cutanées hormone et / ou l'administration de médicaments comprennent les capsules de Silastic ^8. Alors que nous avons aussi l'expérience avec l'utilisation de capsules de Silastic, granulés compressés sont favorisés pour leur facilité d'utilisation et la reproductibilité. En outre, les taux de pastilles d'hormones comprimé à libération mieux imiter les rapports dynamiques sexuelles stéroïdes hormonaux observés chez les hommes vieillissants ^5,7.

Depuis le développement des souris génétiquement immunodéprimé, de nombreux systèmes de modèle in vivo en incorporant des techniques de la xénogreffe ont été mis au point pour l'étude d'une grande variété de tissus normaux et malades. Il existe plusieurs catégories de base de la xénogreffe. xénogreffes de tissus sont constitués d'un petit morceau de tissu intact, ce qui peut être une structure normale, une tumeur maligne ou bénigne croissance. Szot et al. (2007) ont récemment éclairé rénale capsule xénogreffe d'îlots pancréatiques ^9. Aamdal et al. (1985) a décrit la capsule rénale xénogreffe de 27 lignées cellulaires de cancer humain en imsouris munocompromised accueille ^10. Greffons peuvent aussi être composés d'une seule lignée cellulaire immortalisée (cancéreuse ou non tumorigènes), ou peuvent être constitués d'une lignée cellulaire immortalisée combiné avec des cellules isolées à partir de mésenchyme (greffe de cellules recombinantes).

Nous privilégions la xénogreffe de recombinants de cellules de sonder les rôles respectifs de stroma et de l'épithélium dans le développement d'érythroblastopénie et BPH. Cunha et al. (1980) a été le premier à signaler que lorsque les adultes murin épithélium de la vessie est combiné avec embryonnaire mésenchyme urogénital des sinus (UGM) et xénogreffes sous la capsule rénale d'hôtes souris mâles, le tissu se développe en structures ressemblant prostate acini ^11. Norman et al. (1986) a montré que la souris adulte prostate canalaire épithélium et UGM, lorsqu'il est combiné à des recombinants de tissus, connaissent une croissance canalaire et la morphogenèse de ramification ^12. Hayward et al. (1988) a montré que l'épithélium de la prostate humain répond à inductifs m fœtaleesenchyme de la même façon ^13. Un modèle hormonal de la carcinogenèse de la prostate, en combinant la lignée de cellules épithéliales de prostate humaine immortalisée BPH-1 avec UGM, a d'abord été rapporté par Wang et al. ¹⁴ (2001) et a été largement utilisé dans notre laboratoire ^15. Ce modèle est bien adapté pour la compréhension de la progression érythroblastopénie parce épithélium bénigne de la prostate se transforme en maladie métastatique, la modélisation avancée érythroblastopénie chez l'homme ^5. Parce que les composants spécifiques peuvent être manipulées génétiquement, cellule greffe recombinant est particulièrement utile comme une approche pour évaluer les interactions stroma-épithéliales.

Autres sites appropriés pour la xénogreffe sont intradermique, sous-cutanée et lieux orthotopiques ^16. Selon le procédé de l'intérêt du tissu et de la maladie, ceux-ci peuvent être d'autres méthodes appropriées. Pour l'étude de la carcinogenèse hormonale de la prostate et de la réglementation de tumeur bénigne, nous choisissons la capsule rénalesite pour xénogreffe en raison de ses supérieurs greffe prenne taux, l'approvisionnement en sang en abondance, et la capacité à implanter un plus grand nombre de xénogreffes dans un seul site confiné ^16. De plus, la manipulation hormonale de la souris de l'hôte qui donne lieu à une atrophie de la prostate limite l'utilisation de la prostate greffe orthotopique ^16.

Ce protocole définit les techniques de fabrication comprimé hormone / médicament culot et l'implantation chirurgicale, de même que la capsule rénale xénogreffe de greffes de cellules et de tissus de la prostate humaine. Ensemble, ces techniques fournissent un dosage sensible pour déterminer si une souris génétiquement modifiée est plus sensible à l'érythroblastopénie et / ou à la BPH initiation de souches témoins. Xénogreffe est une technique puissante pour l'évaluation in vivo du potentiel des cellules expérimentales pour développer histologique et les caractéristiques moléculaires des tumeurs malignes, ainsi que d'un essai pour de nouvelles stratégies thérapeutiques pour une large variété de maladies bénignes et malignes.

Protocole

Une. Préparation de comprimé d'hormone / Drug Pellet

1. Cette procédure doit être effectuée sous une hotte de sécurité chimique tout en portant une blouse de laboratoire, des gants, un masque, des lunettes de sécurité, et le chapeau. Pour éviter toute contamination croisée, il est essentiel que l'équipement de fabrication de granulés est nettoyé à fond avec de l'éthanol 70% avant et après la fabrication de chaque type de pastille.
2. En utilisant une échelle d'analyse et de peser papier, mesurer la quantité désirée de poudre d'hormone / médicament. Environ 5% de matière supplémentaire est recommandé pour accueillir perte pendant le pressage.
3. Certains médicaments nécessitent des hormones / un agent de liaison ou agent de remplissage, qui est mélangé avant d'un culot fabrication. Par exemple, pour la fabrication d'une pastille de 2,5 mg de 17β-estradiol, l'hormone combiner avec 22,5 mg de cholestérol, ce qui résulte en une pastille de 25 mg.
4. Soigneusement transférer en jeu de matrices, lieu dans la presse et poussez le levier fermement pour comprimer culot. Utilisez une pression constante pour maintenir constante la surface sontà un rapport en volume.
5. Suivant inverser le porte-matrice et pousser le levier vers le bas à nouveau pour libérer le culot.
6. Inspectez culot de l'intégrité et de déterminer si la masse finale est à portée souhaitée. Une plage acceptable est une différence de ± 5% de la masse finale (par exemple, une plage acceptable pour une pastille de 25 mg est de 23,8 à 26,3 mg).
7. Pellets peuvent être faites avant la chirurgie et stockés (conditions et la durée de stockage dépend de la stabilité de l'hormone ou médicament utilisé dans la fabrication de granulés). pastilles d'hormones peuvent être achetés comme une alternative à la fabrication culot. Achat granulés évite l'utilisation de médicaments de qualité inférieure pharmaceutiques car ils seront formulées et aggravés.

2. Préparation de cellules recombinantes xénogreffes

1. Récolte et culture primaire souris mésenchyme urogénital (UGM) des cellules stromales de moins de 4 semaines avant d'être recueilli pour le comptage.
2. Culture des lignées cellulaires immortalisées épithéliale de la prostate dans le fash habituelion et de recueillir pour le comptage. Pour cet exemple, la préparation de greffons cellulaires recombinantes par mélange de 100 000 cellules HPB-1 épithéliales par greffage avec 250 000 cellules stromales UGM par greffage en suspension.
3. cellules à granules ensemble et re-suspendre suffisamment Type neutralisé une queue de rat collagène pour faire nombre désiré de greffons, chacun dans un volume de 25 pi à 50 pi.
4. Réglez greffes recombinants à 37 ° C pendant 15 minutes et puis couvrir avec un milieu de croissance pour le stockage à 37 ° C pendant jusqu'à 48 heures avant la greffe.

3. Préparation de xénogreffes de tissus

1. Maintenir les précautions universelles pour pathogènes à diffusion hématogène pendant l'obtention de tissus et de la procédure chirurgicale. Après l'approbation du comité d'examen institutionnel et consentement éclairé, obtenir des tissus de la prostate frais de résection chirurgicale. Pour les études de la croissance de la BPH, les tissus peuvent être récoltées à partir de la résection transurétrale de la prostate ou de prostatectomie procédures simples. Xénogreffes primaires d'érythroblastopénie ou prost bénignemangé tissu peut être obtenue à partir d'échantillons de prostatectomie radicale.
2. Magasin récolté tissu dans les médias de cellules tamponnées isotoniques ou une solution saline normale sur la glace. En fonction des conditions de tissus et de stockage, les échantillons peuvent être stockés pendant jusqu'à 24 heures avant la préparation de greffons tissulaires. La pratique courante consiste à diviser l'échantillon en trois morceaux, avec une partie fixe dans le formol et systématiquement traités pour l'histologie, une pièce congelé instantanément pour l'analyse moléculaire et une pièce divisée en xénogreffes de tissus (1-3 mm en taille).

4. Préparation du feu poli verre pipette

1. Le port de gants résistants aux lunettes de protection, blouse de laboratoire et de la chaleur, le lieu verre Pasteur pointe de la pipette dans le bec Bunsen flamme à un angle d'environ 60 ° pour commencer.
2. Gardez un, léger mouvement constant à la pipette de manière à éviter les points chauds.
3. Dessiner la pointe fine et feu-polissez l'objectif étant une fin légèrement incurvé avec une forme arrondie, fermée pointe.

5. Préparation des instruments et bloc opératoire

1. Autoclave tous les instruments. Avant la chirurgie, inspecter tous les instruments, en prenant soin de maintenir un champ stérile.
2. Mettre en place la zone chirurgicale stérile avec des coussins absorbants, dissection étendue, nez anesthésie cône, des instruments chirurgicaux et lampe de chauffage dirigé vers la zone de travail. Pour stériliser dans des outils entre les souris, préchauffer stérilisateur à billes.
3. Assembler et appareils d'anesthésie d'essai; peser évacuation de gaz.
4. En utilisant les micro-ondes, tampons de cire de chaleur pour un maximum de 5 min (par incréments de 1 min, le pétrissage de la plaquette de cire afin de combiner fondu et fondue de cire) à 70-80% de la puissance, jusqu'à ce que toute la cire est uniformément fondu. Par le toucher, assurer le pad n'est pas trop chaud et de lieu dans le vide récupération de rongeur cage.
5. Don équipement de protection individuelle pour les interventions chirurgicales, y compris les rongeurs masque chirurgical, bonnet, gants et blouse.

6. Intervention chirurgicale: Capsule rénale xénogreffe

1. Toutes les procédures impliquant des animaux de recherche doivent être effectuées avec l'approbation des comités de protection des animaux dans les institutions et l'utilisation. Avant l'induction de l'anesthésie, observer la souris pour assurer la santé et le bien-être.
2. Placez la souris dans la chambre pour l'induction de l'anesthésie isoflurane à 3-5%. Lorsque l'animal a cessé de bouger et la fréquence respiratoire a diminué, transfert à cône en position couchée, et maintenir une anesthésie à 1-3%.
3. Si nécessaire, utilisez une tondeuse pour raser le dos de la souris. Ce n'est pas nécessaire lors de l'utilisation des souris athymiques nude (nu / nu).
4. Appliquer une pression ferme sur la sangle de la patte arrière élargie pour évaluer l'adéquation de l'anesthésie. Si la souris répond à la pression, plus de temps est nécessaire pour l'anesthésie de prendre effet. Si nécessaire, ajuster le débit anesthésie légèrement pour atteindre une anesthésie adéquate.
5. Lorsque la souris est anesthésiée manière adéquate, à désinfecter le site opératoire chirurgical avec de l'iode (Bétadine) en solution suivie d'70% d'alcool.
6. Don Les gants et une blouse stérile; appliquer des champs stériles sur le site chirurgical. Soulevez la peau du dos avec une paire de pince à griffes, et en utilisant les ciseaux grossiers faire une incision médiane dorsale cm 2-3.
7. Utilisation de ciseaux mousses ou une sonde, séparer le derme sous-jacent à partir de la paroi du corps (des deux côtés de l'incision pour le greffage ou bilatérale sur une face pour le greffage unilatéral).
8. Repositionner la souris en position latérale, et identifier l'emplacement du rein par la visualisation du profil rénal à travers la paroi musculaire. En appliquant une pression manuelle douce avec le pouce et l'index sur l'abdomen peut aider à visualiser les organes internes.
9. En utilisant des ciseaux fins de l'iris, et en prenant soin d'éviter les gros vaisseaux et les nerfs de la colonne vertébrale, faire une incision de 1 cm dans le mur corps parallèle à la colonne vertébrale. Élargir cette incision de 1,5-2,0 cm (un peu plus long que le grand axe du rein) en ouvrant doucement les ciseaux plus large après les plaçant dans l'incision initiale.
10. Extérioriser le rein en appliquant une légère pression à l'extérieur de la paroi du muscle de part et d'autre du rein à l'aide de l'index et du pouce. Tuck bords de la peau au-dessous du rein extériorisé, qui repose sur la paroi du corps. Alors que le rein est extériorisé, maintenir l'hydratation de la capsule rénale en appliquant une solution saline stérile.
11. Utilisation fines # 5 forceps soulevez doucement la capsule rénale de parenchyme du rein et avec un scalpel fin, faire une incision mm 2 -4 dans la capsule. La taille de l'incision est déterminée par la taille de la greffe, mais doit être minimisée afin de maintenir l'intégrité de la capsule.
12. Manipuler une pipette Pasteur en verre qui a été établi mince et poli-feu avec une extrémité fermée arrondie sous la capsule tangentielle à la surface du rein. Ouvrez doucement une petite poche de la capsule pour les greffes, en utilisant le plus grand soin de ne pas endommager le parenchyme rénal.
13. L'arête de coupe de la capsule du rein est soulevé avec les fines pinces, et le greffon is insérée dans la poche sous la capsule en utilisant la pipette en verre poli au feu. Plusieurs greffons peuvent être placés sous la capsule rénale et uniformément espacés sur la surface du rein.
14. Si, au cours du greffage, la capsule se déshydrate, il doit être humidifiée par l'application d'une solution saline stérile.
15. Lorsque le greffage est terminée, soulever légèrement les côtés de l'incision de la paroi musculaire de remplacer le rein en arrière dans la cavité du corps. Observez que les greffes ne glissent pas de sous la capsule.
16. Fermez la paroi musculaire avec une seule suture (4-0, FS-2 vicryl suture). L'intervention chirurgicale peut être répété sur le rein controlatéral par le repositionnement de la souris.
17. Lorsque le greffage est terminée, la souris peut subir sous-cutanée culot implantation au cours de la même intervention chirurgicale (Voir Protocole étape 7).
18. En utilisant une pince à griffes, alignez les bords de l'incision de la peau et appliquer 2-3 des agrafes chirurgicales pour fermer l'incision. Administrer l'analgésie (nous utilisons 5-10 mg / kg carprofen utilisant une injection sous-cutanée) et placez la souris dans la position couchée sur le côté dans la cage de récupération. Assurer le maintien de la température du corps avec de la chaleur provenant d'une lampe ou un coussin chauffant. Observer pour une restauration complète de la souris, ce qui devrait se produire en moins de 15 minutes.
19. Souris devraient être observés pour le 24 heures suivant les signes de la douleur post-opératoire, le saignement et / ou d'autres complications. Inspectez régulièrement incision chirurgicale des signes d'infection.
20. Retirer des agrafes avec dispositif d'attache de la plaie de l'ablation chirurgicale 7-14 jours après la chirurgie.

7. Intervention chirurgicale: sous-cutanée Pellet Implantation

1. Répétez les étapes 6.1-6.5 de capsule rénale xénogreffes intervention chirurgicale.
2. Soulevez la peau du dos avec une paire de pinces de la peau, et en utilisant les ciseaux grossiers faire une incision médiane dorsale cm 1-2.
3. Avec des ciseaux émoussés ou une sonde, séparer le derme sous-jacentes de la paroi du corps dans une direction crânienne.
4. En utilisant des pinces de la peau,soulevez doucement l'aspect crânienne de l'incision de la peau, et tenant le culot de l'hormone doucement avec droites, pinces dentelées, insérer le culot et libérer à la peau du cou, dans la poche que vous avez créé avec la sonde émoussée.
5. Répétez les étapes 6.18 à 6.20 de la capsule rénale xénogreffes intervention chirurgicale. Si vous effectuez sous-cutanée culot implantation uniquement, utilisez une pince chirurgicale plaie à refermer l'incision chirurgicale.

Résultats

En fonction de l'hypothèse à tester, capsule rénale xénogreffe de recombinants de tissus ou de cellules peut être effectuée en vase clos ou sous-cutanée en combinaison avec l'hormone culot implantation. Un schéma d'une expérience hypothétique combinant rénale expérience capsule de xénogreffe sous-cutanée de l'hormone culot implantation est illustrée sur la figure 1. Une variété de substances pulvérulentes et / ou cristallins peut être utilisé dans la fabrication...

Discussion

Ce document et le protocole décrit ici décrivent la fabrication de l'hormone comprimé et / ou granulés de drogue, et la procédure chirurgicale pour sous-cutanée culot implantation de souris. Selon la question de recherche à traiter, cette technique peut être réalisée individuellement ou en combinaison avec capsule rénale xénogreffe de cellules de la prostate greffes recombinantes ou des xénogreffes de tissus de la prostate, qui sont des techniques largement utilisées dans la recherche de la prostate

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
			EQUIPMENT & MATERIALS
Pellet press	PARR Industries	2815	3mm Punch & Die set
Analytical Balance	Ohaus	1918302	Voyager or other
Bunsen burner	Fisher Scientific	03-962Q
Dissecting microscope	Leica	L2
Deltaphase Pad Kit (reheatable wax)	Braintree Scientific	39DP	Alternative to an electric heating pad
Hot Bead sterilizer	F.S.T.	18000-45
Isoflurane Vaporizer	Supera Anesthesia Innov	VAP3000
Induction Chamber	Supera Anesthesia Innov	RES644
F/AIR Canister	Supera Anesthesia Innov	80120
4 port Manifold	Supera Anesthesia Innov	RES536
Rebreathing Circuits	Supera Anesthesia Innov	CIR529
Inlet/Outlet Fittings	Supera Anesthesia Innov	VAP203/4
Pressure Reg/Gauge	Supera Anesthesia Innov	OXY508
Oxygen Flowmeter	Supera Anesthesia Innov	OXY660
21mm Clear Tubing	Supera Anesthesia Innov	301-150
Small Mice Nose Cone	Supera Anesthesia Innov	ACC526
Sterile surgical gown	Midwest Vet Supply	350.79866.2
Surgical mask	Midwest Vet Supply	350.50111.2	2-ply w/ earloops
Sterile gauze	Midwest Vet Supply	001.14100.2	2 x 2 inches
Sterile Gloves	Kimberly Clark	55092
Bouffant	Midwest Vet Supply	001.27100.2
Cotton Tip Applicator	Midwest Vet Supply	001.06220.2
Surgical Scrub Wash	Midwest Vet Supply	733.80010.3
Sterile Fields (Fenestrated)	General Econopak, Inc	88VCSTF
			REAGENTS
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-3292
Testosterone Proprionate	Sigma-Aldrich	T-1875
17β-estradiol	Sigma-Aldrich	E-2758
Isoflurane	Midwest Vet Supply	193.33161.3
Carprofen	Midwest Vet Supply	193.70200.3	Injectable (Rimadyl)
Betadine	Webster Veterinary	07-836-3379
Sterile saline	Midwest Vet Supply	193.74504.3	NaCl 0.9%, Injectable
			SURGICAL INSTRUMENTS
Straight Sharp/Blunt Scissors	Fine Scientific Tools (F.S.T.)	14054-13
Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved)	F.S.T.	11055-10
Fine Iris scissors	F.S.T.	14090-09
Graefe Scalpel	F.S.T.	10071-12
Dumont #5 forceps	F.S.T.	11251-20
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	S67050	5" length
Graefe forceps (Serrated, Curved)	F.S.T.	11052-10
Graefe forceps (Serrated, Straight)	F.S.T.	11050-10
Vicryl Suture	Midwest Vet Supply	295-92100.2	4-0, FS-2, Absorbable
Needle Holder w/ scissor action	F.S.T.	12002012
Wound Clips	Braintree Scientific	ACS CS	May use 7mm or 9mm clips
Reflex Wound Clipper	F.S.T.	12031-09	Correspond w/ wound clip size
Would Clip Remover	F.S.T.	12033-00	Universal
Sterilization Container	F.S.T.	20810-01	Any autoclavable container will do
Syringe w/ needle	BD	148292C	1cc, 25Gx1
Ear Tag Applicator	National Band & Tag Co.	1005s1	Alternative to ear notching
Small Animal Ear Tags	National Band & Tag Co.	1005-1