전립선 발암 및 양성 전립선 비대증의 평가를위한 신장 캡슐 Xenografting 및 피하 펠렛 주입

요약

우리는 마우스로 압축 호르몬 펠렛의 제조뿐만 아니라, 피하 이식 수술에 대해 설명합니다. 이 전략은 호르몬 발암 및 양성 전립선 성장의 조절을 평가하기위한 비 흉선 누드 마우스의 신장 캡슐 밑에 세포 및 조직 이종 이식편의 성장과 조합 될 수있다.

초록

두 가지 일반적인 전립선 질환, 전립선 암 (PRCA) 및 양성 전립선 비대증 (BPH)에 대한 새로운 치료는 그들의 호르몬 조절을 평가 실험에 매우 의존한다. 성 스테로이드 호르몬 (특히 안드로겐과 에스트로겐) PRCA과 BPH에 중요하다, 우리는 압축 된 호르몬 알약을 사용하여 실험 생쥐 전립선의 성장과 발암 유도에서 각각의 역할을 조사. 호르몬 및 / 또는 약물 펠릿을 쉽게 펠렛 프레스로 제작하고, 수술 남성의 마우스 호스트의 피하 조직에 이식된다. 우리는 또한 면역 결핍 생쥐의 신장 캡슐 밑에 전립선 세포 재조합 xenografting로 피하 호르몬 펠릿 주입을 조합하여 호르몬 발암 평가 용 프로토콜을 설명한다. 또한, 피하 호르몬 펠릿 주입, BPH 조직의 신장 캡슐 xenografting와 함께, 더 나은 양성 프로스트의 호르몬 조절을 이해하는 데 유용합니다성장을 먹고, 성 스테로이드 호르몬의 경로를 대상으로 새로운 치료법을 테스트 할 수 있습니다.

서문

전립선 암 (PRCA) 양성 전립선 비대증 (BPH)은 건강에 큰 부담이다. PRCA 남성에서 두 번째로 가장 널리 고체 장기 암 사망 ¹ 관련 암의 주요 원인이다. BPH는 노인들 사이 매우 유행이다, 그것은 BPH의 임상 양상은, 하부 요로 증상 (LUTS), ^남성이 50-90 %에 영향을 미칠 것으로 추정된다. 안드로겐과 에스트로겐이, PRCA과 BPH에 중요한 것으로 알려져 있지만 암 발생과 성장에 기초가되는 호르몬의 메커니즘에 대한 우리의 이해는 ^3,4 불완전 남아있다. 간단하고 유 전적으로 다루기 쉬운 동물 모델은 전립선 연구에서 이러한 우선 순위를 제시 할 것입니다 연구를 뒷받침. 이러한 PRCA과 BPH, immunocomp에 격리 또는 신장 캡슐 xenografting와 함께 피하, 느린 방출 호르몬 알약의 사용, (한 종에서 다른 종의 세포, 조직 또는 기관의 이전)과 같은 호르몬 반응 질환romised 마우스 호스트, 성장과 발암의 호르몬 조절을 연구하기위한 간단하고 재현성있는 방법을 제공한다.

피하 호르몬 펠릿 주입은 발암 및 전립선 ^5의 양성 성장 호르몬 조절을 연구하는 간단하고 재생 가능한 기술이다. 25 밀리그램의 테스토스테론 (T)과 2.5 밀리그램의 17β-에스트라 디올 (E _2)를 가진 성인 남성 쥐의 피하 주입, 노화 남자 ^5,6의 동적 호르몬 환경을 재현, 혈청 E _2의 증가와 T의 점진적 감소가 발생합니다. 또한,이 모델은 BPH-LUTS의 ^5,7의 임상 적 특징의 많은 되풀이되었습니다. 호르몬 관리의 다른 방법은 경구 / 위관 투여 또는 복강 내 주사, 설치류에 고통을 일으키는 원인이 시간이 지남에 따라 약물의 동일한 금액을 제공하는 덜 일관하고 있습니다 포함 더 많은 노동 집약적 한 번 수술 주입보다. 시간에 대한 다른 피하 모드ormone 및 / 또는 약물 전달 실라 스틱 캡슐 ^{8 있습니다.} 우리는 또한 실라 스​​틱 캡슐의 사용 경험이 있지만, 압축 된 펠릿을 사용하고 재현성의 용이성에 대한 선호하고 있습니다. 또한, 압축 호르몬 알약의 방출 속도는 더 나은 노화 남자 ^5,7에서 관찰 된 동적 성 스테로이드 호르몬의 비율을 모방.

유 전적으로 면역 결핍 생쥐의 개발 이후, xenografting 기법을 도입 한 다양한 생체 내 모델 시스템은 정상 및 병에 걸린 조직의 다양한 연구를 위해 개발되어왔다. xenografting의 몇 가지 기본 범주가 있습니다. 조직의 이종 이식은 정상적인 구조, 악성 종양, 양성과 성장이 될 수 있습니다 손상 조직의 작은 조각으로 구성되어 있습니다. Szot 등. (2007)는 최근 췌장 ^9의 신장 캡슐 xenografting을 조명했다. Aamdal 외. (1985)는 IM (27)에서 인간의 암 세포주의 신장 캡슐 xenografting 설명한munocompromised 마우스 ^(10)를 개최합니다. 이식도 (암 또는 비 발암) 하나의 불후의 세포 라인으로 구성 될 수 있으며, 중간 엽 (셀 재조합 이식)에서 분리 된 세포와 결합 불후의 세포 라인으로 구성 될 수 있습니다.

우리는 PRCA 및 BPH의 개발에 기질과 상피 세포의 각각의 역할을 조사하는 세포 재조합 xenografting을 선호. 쿠냐 등. (1980) 성인 쥐의 방광 상피 세포가 수컷 마우스 호스트의 신장 캡슐에서 배아 비뇨 생식기 동 중간 엽 (UGM) 및 이종 이식과 결합 될 때, 조직이 전립선 선포 세포 ^(11)를 닮은 구조로 개발하는 것을보고 처음. 노먼 등. (1986) 조직의 재조합에 결합 될 때 성인 마우스 전립선 유관 상피 세포와 UGM은, 유관 성장과 형태 형성 ^{12 분기를} 받아야 것으로 나타났다. 헤이워드 등. (1988)은 인간의 전립선 상피 세포가 태아 m 유도 형에 응답하는 것으로 나타났다비슷한 방식으로 ¹³ esenchyme. 결합하여 전립선에있는 발암 호르몬 모델, 불멸의 인간의 전립선 상피 세포주 BPH-1 UGM로는, 첫 번째 왕 등. ¹⁴ (2001)에 의해보고 된 우리의 실험실 ^(15)에 광범위하게 사용되어왔다. 양성 전립선 상피 세포가 인간 ⁵ 고급 PRCA 모델링, 전이성 질환으로 변환하기 때문에이 모델은 PRCA의 진행을 이해하는 데 매우 적합하다. 특정 구성 요소는 유 전적으로 조작 할 수 있기 때문에, 세포 재조합 이식은 각막 상피​​ 상호 작용을 평가하는 방법으로 특히 유용하다.

xenografting에 적합한 다른 사이트 피내, 피하 및 소성을 위치 ^{(16)입니다.} 관심의 조직과 질병 과정에 따라 이러한 적절한 대체 방법이 될 수있다. 전립선 호르몬 발암 양성 성장 규제의 연구를 위해, 우리는 신장 캡슐을 선택높기 때문에 이식에 xenografting에 대한 사이트는 속도, 풍부한 혈액 공급, 하나의 밀폐 된 사이트 ^(16)에 이종 이식의 큰 숫자를 이식 할 수있는 능력을 가지고. 또한, 전립선 위축 초래 호스트 마우스 호르몬 조작 전립선 동소 그라프 ^(16)의 사용을 제한한다.

이 프로토콜은 압축 호르몬 / 약 펠릿 제조 및 수술 주입뿐만 아니라, 인간의 전립선 세포 및 조직 이식의 신장 캡슐 xenografting의 기술을 설명합니다. 함께,이 기술은 유전자 변형 마우스 PRCA 및 / 또는 제어 계통에 비해 BPH 개시에 감염 여부를 확인하는 중요한 분석을 제공합니다. Xenografting는 생체 조직 학적 악성 종양의 분자 특징을 개발하는 실험 세포의 잠재력을 평가뿐만 아니라, 양성 및 악성 질병의 광범위한 새로운 치료 전략에 대한 분석을위한 강력한 기술이다.

프로토콜

1. 압축 호르몬 / 의약품 펠렛의 제조

1. 실험실 코트, 장갑, 마스크, 보호 안경 및 모자를 착용하는 동안이 절차는 화학 물질 안전성 후드에서 수행해야합니다. 교차 오염을 방지하기 위해, 펠렛 생산 용 장비는 철저하게 사전에 70 %의 에탄올과 펠릿의 각 유형의 제조 후 청소하는 것이 중요합니다.
2. 분석 규모를 사용하면, 종이의 무게 호르몬 / 마약 분말을 원하는 양을 측정합니다. 약 5 %의 추가 재료가 눌러 발생한 손실을 수용하는 것이 좋습니다.
3. 일부 호르몬 / 의약품 제조 펠렛 이전에 혼합 결합제 또는 필러가 필요합니다. 예를 들어, 17β-에스트라 디올의 2.5 밀리그램의 펠렛을 제조, 25 밀리그램의 펠렛 결과 콜레스테롤 22.5 ㎎,와 호르몬을 결합한다.
4. 조심스럽게 언론에서 다이 세트, 장소에 전송하고 펠렛을 압축하기 위해 단단히 레버를 누릅니다. 이다 일정한 표면을 유지하기 위해 일관된 압력을 사용부피비.
5. 다음 다이 홀더를 뒤집어 펠렛을 해제하려면 다시 레버를 누릅니다.
6. 무결성 펠렛을 점검하고 최종 질량이 원하는 범위 내에 있는지 확인합니다. 허용 가능한 범위 (예를 들어, 25 mg의 펠렛에 대한 허용 범위는 23.8-26.3 밀리그램이다) 최종 질량 ± 5 %의 차이이다.
7. 펠렛은 수술 전에 만든 (조건 및 저장의 길이가 펠릿 제조에 사용되는 호르몬이나 약물의 안정성에 따라 다름) 저장 될 수 있습니다. 호르몬 펠릿 제조 펠릿에 대한 대안으로 구입할 수 있습니다. 알약을 구매하는 것은 그들이 공식화와 혼합되기 때문에 비 제약 학년 약물의 사용을 피한다.

2. 휴대 재조합 이종 이식의 준비

1. 수확 및 문화 기본 마우스 비뇨 생식기 중간 엽 (UGM) 계산을 위해 수집되기 전에 4 주 이하에 대한 기질 세포를.
2. 문화는 보통의 괴로움에서 전립선 상피 세포 라인을 불후이온 세기에 수집합니다. 이 예를 들어, 서스펜션에 접목 250,000 UGM의 기질 세포와 함께 이식 100,000 BPH-1 상피 세포를 혼합하여 세포 재조합 이식을 준비하고 있습니다.
3. 펠렛 세포 함께 50 μL에 25 μL의 부피에 이식 원하는 수의 각을 할 수있을 정도로 충분한 중화 1 형 쥐의 꼬리 콜라겐에 다시 일시 중지합니다.
4. 15 분 동안 37 ° C에서 재조합 이식을 설정하고 이식하기 전에 최대 48 시간 동안 37 ° C에서 저장을위한 성장 매체 커버.

3. 조직 이종 이식의 준비

1. 조직의 조달 및 수술 중에 혈액을 매개로 병원균에 대한 보편적 인 예방 조치를 유지한다. 기관 검토위원회의 승인과 동의에 따라, 수술 적 절제에서 신선한 전립선 조직을 구하십시오. BPH의 성장 연구를 위해, 조직은 전립선이나 전립선 간단한 절차 경 요도 절제술에서 수확 할 수있다. PRCA 또는 양성 프로스트의 기본 이종 이식먹은 조직은 과격한 전립선 절제 표본에서 얻을 수 있습니다.
2. 스토어 등장 버퍼 세포 미디어 또는 얼음에 생리 식염수에 조직을 수확. 조직 및 보관 조건에 따라 표본 전에 조직 이식의 준비 24까지 시간 동안 저장 될 수있다. 일반적인 방법은 포르말린에 고정하고 일상적으로 조직 검사를 위해 처리 한 부분으로, 3 세트로 표본을 분할하는 것입니다, 한 조각은 분자 분석을 위해 냉동 한 장 더 조직 이종 이식 (크기 1 ~ 3 ㎜)로 나누어 스냅.

4. 화재의 준비 유리 피펫에게 닦았다

1. 착용 눈 보호, 실험실 코트와 내열성 장갑, 약 분젠 버너의 불꽃을 시작하는 60 ° 각도로 장소 유리 파스퇴르 피펫 팁.
2. 핫 스폿을 피하도록 피펫으로 일정한, 약간의 움직임을 유지한다.
3. 목표는 둥근와 약간 굴곡이 종료되는과 얇은 팁과 불 닦으 그리기, 팁 폐쇄.

5. 악기의 준비 및 외과 스위트 룸

1. 모든 악기를 압력솥. 수술 전, 무균 영역을 유지하기 위해주의하면서, 모든 악기를 검사합니다.
2. 흡수 패드, 해부 범위, 마취 코 콘, 수술 도구와 작업 영역을 향하는 가열 램프와 불임 수술 영역을 설정합니다. 마우스, prewarm 비드 살균기 사이의 도구를 소독합니다.
3. 조립 및 테스트 마취 장치, 가스 제거제를 무게.
4. 다양한 왁스가 균일하게 용융 될 때까지 70 ~ 80 % 전력에서 (용융 및 용융되지 않은 왁스를 결합하기 위해 왁스 패드 혼련 1 분 단위로) 최대 5 분 동안 마이크로파 가열 왁스 패드 사용. 터치 패드는 빈 설치류 복구 케이지에서 너무 뜨거운 장소가 아닙니다 확인하십시오.
5. 수술 마스크, 모자, 장갑, 가운 등의 설치류 수술을위한 돈 개인 보호 장비.

6. 수술 : 신장 캡슐 Xenografting

1. 연구 동물을 포함한 모든 절차는 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 수행해야합니다. 이전 마취의 유도로, 건강과 웰빙을 위해 마우스를 관찰합니다.
2. 3 ~ 5 %에​​서 이소 플루 란 마취 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. 동물이 이동 중지하고 호흡이 감소되면, 발생하기 쉬운 위치에 코 콘을 전송하고, 3 %로 마취를 유지한다.
3. 필요한 경우, 마우스의 뒷면 면도 가위를 사용합니다. 흉선 누드 (뉴 / 뉴) 마우스를 사용하는 경우이 작업은 필요하지 않습니다.
4. 마취의 적절성을 평가하기 위해 확장 뒷발의 가죽 끈에 확고한 압력을 적용합니다. 마우스가 압력에 응답하는 경우, 더 많은 시간을 적용하는 마취 필요합니다. 필요한 경우, 적절한 마취를 달성하기 위해 약간 마취 흐름을 조정합니다.
5. 마우스가 적절히 마취되면, 다음 수술 요오드 (베타 딘) 용액으로 수술 부위를 소독70 % 알코올.
6. 돈 멸균 장갑과 가운,​​ 수술 부위에 멸균 커튼을 적용합니다. 이빨 포셉 한 쌍을 가진 뒤 피부를 들어 올려 거친 가위를 사용은 2 ~ 3 센티미터 지느러미 중간 선 절개를합니다.
7. 무딘 가위 나 프로브를 이용하여, (양자 그라프위한 절개의 양쪽 또는 한쪽을위한 그 래프팅 한쪽) 체벽으로부터 내부 진피를 분리.
8. 측면 위치에 마우스를 위치를 조정하고, 근육 벽을 통해 신장 프로필을 보면 신장의 위치를​​ 식별합니다. 복부의 엄지와 검지 손가락으로 부드러운 수동 압력을 적용하면 내부 장기를 시각화에 도움이 있습니다.
9. 미세 홍채 가위를 사용하고, 척추 체벽 평행 1cm의 절개를, 주요 혈관 및 척추 신경을 피하기 위해 돌보는. 부드럽게 초기 절개에 배치 한 후 가위 넓게 열어 (신장의 긴 축보다 약간 이상) 1.5 ~ 2.0 cm이 절개를 넓 힙니다.
10. 엄지와 검지를 사용 신장의 양쪽의 근육 벽 밖에 온화한 압력을인가하여 신장을 외면 화하다. 정력 피부는 몸의 벽에 휴식 할, exteriorized 신장 아래 가장자리. 신장이 exteriorized 동안 멸균 식염수를 적용하여 신장 캅셀의 수분을 유지한다.
11. 잘 # 5 집게를 사용하면 부드럽게 신장의 실질에서 신장 캡슐을 들어 올려 벌금 메스, 캡슐 2 -4 mm 절개를합니다. 절개의 크기는 이식편의 크기에 의해 결정되어 있지만, 캡슐의 무결성을 유지하기 위해 최소화되어야한다.
12. 신장의 표면에 접선 캡슐에서 반올림 폐쇄 단부와 얇은 화재 광택 그려져 유리 파스퇴르 피펫을 조작 할 수 있습니다. 부드럽게 신장 실질 조직을 손상하지 않도록 신중을 사용하여 이식을위한 작은 캡슐 포켓을 엽니 다.
13. 신장 캡슐의 절단 에지는 그래프트 I에게 미세 집게로 상승하고,불 연마 유리 피펫을 사용하여 캡슐에서 포켓에 삽입들. 몇몇 이식은 신장 캡슐 밑에 배치 균일 신장 표면 상에 이격 될 수있다.
14. 그라프의 과정 동안, 캡슐 탈수되어, 경우 멸균 식염수를 적용하여 축축한다.
15. 그 래프팅이 완료되면, 조심스럽게 체강 내에 신장을 대체하는 근육 벽 절개면을 들어 올려. 이식이 캡슐 아래에서 미끄러지지 않는 것을 관찰한다.
16. 하나의 봉합사 (4-0, FS-2 vicryl 봉합)와 근육 벽을 닫습니다. 수술 절차는 마우스 위치를 바꾸 반대측 신장에 반복 할 수 있습니다.
17. 그 래프팅이 완료되면, 마우스 (프로토콜 단계 7 참조) 같은 수술 중에 펠렛 피하 주입을 거칠 수있다.
18. 이빨 집게를 사용하면, 피부 절개의 가장자리를 정렬하고 절개를 닫 2-3 수술 상처 클립을 적용 할 수 있습니다. 진통제를 관리 (우리가 사용하는 5 ~ 10 ㎎ / ㎏ carprof피하 주사)를 사용하여 EN과은 복구 케이지의 측면 누운 위치에 마우스를 놓습니다. 램프 나 가열 패드에서 열을 체온의 유지 보수를 보장합니다. 15 분 미만에서 발생한다 마우스의 전체 복구를 관찰한다.
19. 마우스는 출혈 및 / 또는 기타 합병증, 수술 후 고통의 흔적이 다음 24 시간 동안 관찰해야한다. 정기적으로 감염의 징후를 수술 절개를 검사합니다.
20. 7~14일 수술 후 수술 상처 클립 제거 장치와 상처 클립을 제거합니다.

7. 수술 : 피하 펠렛 주입

1. 반복 수술을 xenografting 신장 캡슐에서 6.1-6.5 단계를 반복합니다.
2. 피부 포셉 한 쌍의와 함께 다시 피부를 들어 올려 거친 가위를 사용는 1-2 센티미터 지느러미 중간 선 절개를합니다.
3. 무딘 가위 나 프로브를 이용하여, 뇌 방향 체벽으로부터 내부 진피를 분리.
4. 피부 집게를 사용하여,부드럽게 피부 절개의 두개골 측면을 들어 올려 똑바로, 톱니 모양의 집게로 조심스럽게 호르몬 펠렛을 들고, 펠렛을 삽입하고 무딘 프로브로 만든 주머니에, 목덜미에 놓습니다.
5. 반복 수술을 xenografting 신장 캡슐에서 6.18-6.20 단계를 반복합니다. 피하 펠릿 주입을 수행하는 경우에만, 수술 절개를 닫 1 수술 상처 클립을 사용합니다.

결과

테스트되어야하는 가설에 따라, 조직 또는 세포 재조합 체의 신장 캡슐 xenografting 고립화, 또는 피하 호르몬 펠릿 주입과 결합하여 수행 될 수있다. 피하 호르몬 펠릿 주입으로 신장 캡슐 xenografting 실험을 조합 한 가상 실험의 도식은도 1에 도시되어있다. 분말 및 / 또는 결정 성 물질의 다양한 펠릿 프레스로 압축 펠릿의 제조에 사용될 수있다.도 2는 25 ㎎, 12 밀리그램...

토론

이 종이에 설명 된 프로토콜은 여기에 압축 호르몬 및 / 또는 약물 펠렛의 제조와 마우스의 피하 펠릿 주입 수술에 대해 설명합니다. 해결되어야 연구 문제에 따라,이 기술은 단독으로 또는 광범위 전립선 연구 ^17-19에서 사용 된 기술이다 전립선 세포 재조합 이식 또는 전립선 조직의 이종 이식의 신장 캡슐 xenografting와 조합하여 수행 될 수있다. 이와 함께, 이러한 기술은 호르몬 발암 인간...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
			EQUIPMENT & MATERIALS
Pellet press	PARR Industries	2815	3mm Punch & Die set
Analytical Balance	Ohaus	1918302	Voyager or other
Bunsen burner	Fisher Scientific	03-962Q
Dissecting microscope	Leica	L2
Deltaphase Pad Kit (reheatable wax)	Braintree Scientific	39DP	Alternative to an electric heating pad
Hot Bead sterilizer	F.S.T.	18000-45
Isoflurane Vaporizer	Supera Anesthesia Innov	VAP3000
Induction Chamber	Supera Anesthesia Innov	RES644
F/AIR Canister	Supera Anesthesia Innov	80120
4 port Manifold	Supera Anesthesia Innov	RES536
Rebreathing Circuits	Supera Anesthesia Innov	CIR529
Inlet/Outlet Fittings	Supera Anesthesia Innov	VAP203/4
Pressure Reg/Gauge	Supera Anesthesia Innov	OXY508
Oxygen Flowmeter	Supera Anesthesia Innov	OXY660
21mm Clear Tubing	Supera Anesthesia Innov	301-150
Small Mice Nose Cone	Supera Anesthesia Innov	ACC526
Sterile surgical gown	Midwest Vet Supply	350.79866.2
Surgical mask	Midwest Vet Supply	350.50111.2	2-ply w/ earloops
Sterile gauze	Midwest Vet Supply	001.14100.2	2 x 2 inches
Sterile Gloves	Kimberly Clark	55092
Bouffant	Midwest Vet Supply	001.27100.2
Cotton Tip Applicator	Midwest Vet Supply	001.06220.2
Surgical Scrub Wash	Midwest Vet Supply	733.80010.3
Sterile Fields (Fenestrated)	General Econopak, Inc	88VCSTF
			REAGENTS
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-3292
Testosterone Proprionate	Sigma-Aldrich	T-1875
17β-estradiol	Sigma-Aldrich	E-2758
Isoflurane	Midwest Vet Supply	193.33161.3
Carprofen	Midwest Vet Supply	193.70200.3	Injectable (Rimadyl)
Betadine	Webster Veterinary	07-836-3379
Sterile saline	Midwest Vet Supply	193.74504.3	NaCl 0.9%, Injectable
			SURGICAL INSTRUMENTS
Straight Sharp/Blunt Scissors	Fine Scientific Tools (F.S.T.)	14054-13
Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved)	F.S.T.	11055-10
Fine Iris scissors	F.S.T.	14090-09
Graefe Scalpel	F.S.T.	10071-12
Dumont #5 forceps	F.S.T.	11251-20
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	S67050	5" length
Graefe forceps (Serrated, Curved)	F.S.T.	11052-10
Graefe forceps (Serrated, Straight)	F.S.T.	11050-10
Vicryl Suture	Midwest Vet Supply	295-92100.2	4-0, FS-2, Absorbable
Needle Holder w/ scissor action	F.S.T.	12002012
Wound Clips	Braintree Scientific	ACS CS	May use 7mm or 9mm clips
Reflex Wound Clipper	F.S.T.	12031-09	Correspond w/ wound clip size
Would Clip Remover	F.S.T.	12033-00	Universal
Sterilization Container	F.S.T.	20810-01	Any autoclavable container will do
Syringe w/ needle	BD	148292C	1cc, 25Gx1
Ear Tag Applicator	National Band & Tag Co.	1005s1	Alternative to ear notching
Small Animal Ear Tags	National Band & Tag Co.	1005-1