La identificación de mutaciones del ADN en Purificada hematopoyéticas células madre / progenitoras

Resumen

Aquí se describe un ensayo in vivo mutagénesis por un pequeño número de células hematopoyéticas purificadas utilizando el modelo de ratón transgénico LacI. El gen LacI puede ser aislado para determinar la frecuencia, la ubicación y tipo de mutantes de ADN espontáneamente surgido o después de la exposición a genotoxinas.

Resumen

En los últimos años, se ha hecho evidente que la inestabilidad genómica está estrechamente relacionada con muchos trastornos del desarrollo, cáncer y envejecimiento. Dado que las células madre son responsables de asegurar la homeostasis del tejido y la reparación durante toda la vida, es razonable plantear la hipótesis de que la población de células madre es crítico para la preservación de la integridad genómica de tejidos. Por lo tanto, un interés significativo se ha producido en la evaluación del impacto de los factores endógenos y ambientales sobre la integridad genómica en las células madre y su progenie, con el objetivo de comprender la etiología de las enfermedades basados ​​en células madre.

Ratones transgénicos LacI llevan un vector de fago λ recuperable que codifica el sistema reportero de LacI, en el que el gen LacI sirve como reportero de la mutación. El resultado de un gen mutado LacI es la producción de β-galactosidasa que escinde un sustrato cromogénico, convirtiéndose azul. El sistema indicador LacI es i llevado an todas las células, incluyendo las células madre / progenitoras y pueden ser fácilmente recuperados y utilizados para infectar posteriormente E. coli. Después de la incubación de E. infectada coli en agarosa que contiene el sustrato correcto, las placas se puede marcar; placas azules indican un gen mutante LacI, mientras que las placas claras puerto de tipo salvaje. La frecuencia de azul (entre claras) placas indica la frecuencia de mutantes en la población original de células se extrajo el ADN de. La secuenciación del gen mutante LacI mostrará la ubicación de las mutaciones en el gen y el tipo de mutación.

El modelo de ratón transgénico LacI es bien conocido por ser un ensayo in vivo de mutagénesis in. Por otra parte, los ratones y los reactivos para el ensayo están disponibles comercialmente. A continuación se describe en detalle la forma en este modelo puede ser adaptado para medir la frecuencia de mutantes de ADN que ocurre de forma espontánea en el tallo enriquecida con células Lin ^- IL7R ^- Sca-1 ⁺ cKit ^{+ +} (LSCélulas K) y otras subpoblaciones del sistema hematopoyético.

Introducción

En la mayoría de los tejidos, las células diferenciadas tienen una vida útil limitada. Para mantener la integridad funcional,, las células madre específicas de tejido y de larga duración producen continuamente células progenitoras que a su vez dan lugar a las células completamente diferenciadas necesarios para la función de ese tejido particular. Las células madre también reponer su propio compartimento a través de un proceso llamado auto-renovación. Por lo tanto, las células madre son responsables de mantener la integridad funcional del tejido que residen pulg Por lo tanto, es imperativo que están equipadas con mecanismos robustos para detectar y potencialmente reparar el ADN dañado. Si no, se pueden adquirir múltiples perturbaciones genómicos (potencialmente nocivos), que pueden ser heredadas por sus descendientes. La comprensión de cómo las células madre salvaguardar su genoma durante el período de vida de un organismo es una pregunta importante y puede ayudar a entender por qué la inestabilidad genómica está vinculado con el cáncer y otras enfermedades relacionadas con la edad (revisado en ^1,2).

El control de la integridad genómica de un tejido en el nivel de células madre o poblaciones de células progenitoras tempranas se puede lograr ya sea por la eliminación de vástago defectuosa (o progenitor) células a través de la muerte celular, la senescencia o la diferenciación, y / o por la reparación eficiente ADN de dañado. Estudios recientes han demostrado que es posible medir ciertos tipos de reparación del ADN directamente en estas poblaciones raras ^3-6. Se encontró que, por ejemplo, en el sistema hematopoyético, roturas de doble cadena de ADN se pueden reparar mediante recombinación homóloga (HR) o de extremos no homólogos (NHEJ), siendo este último un proceso de reparación de baja fidelidad y por lo tanto un mayor riesgo de hacer errores. Ambos están siendo utilizados en las células madre hematopoyéticas (HSC) ^{de 4,5,} sin embargo, en ratones parece que es predominantemente de NHEJ en HSCs mientras que las células progenitoras tempranas utilizan HR ^4. Una observación similar se hizo para las células madre de la piel ^6. Curiosamente, en las CMH humano HR, no NHEJ,parece ser el mecanismo de reparación de la opción para la línea se rompe dobles ^3. Si esta diferencia funcional entre las dos especies es real o simplemente representa una diferencia tecnológico o experimental aún está por verse.

Un repertorio de células madre para reparar el ADN dañado es probable que incluya otros mecanismos de reparación del ADN, como la reparación por escisión de base (BER), la reparación por escisión de nucleótidos (NER) y desajuste de reparación (MMR). BER y NER son responsables de la reparación de lesiones únicas o múltiples de pares de bases en el ADN de una sola hebra, mientras que los desajustes correcciones MMR de base-base y los bucles de inserción / deleción; este tipo de daños en el ADN no pueden ser reparados por NHEJ o HR. En apoyo de esta noción son varios estudios del sistema hematopoyético que demuestra una relación entre las alteraciones en una de estas vías y anormalidades en el compartimiento HSC ^7-9, así como un mayor riesgo de desarrollar el síndrome mielodisplásico ^10-16, una enfermedad que se origina en laHSC y que se asocia con el aumento de la inestabilidad genómica conforme avanza la enfermedad ^17. Hasta el momento, no se han reportado mediciones de BER, TNE y MMR directamente en las CMH.

Además de la aclaración de los diversos procesos que controlan la integridad del tejido a un nivel mecanicista, es imperativo que ser capaz de medir la extensión de ADN mutado, de modo que las consecuencias de las aberraciones en uno de estos procesos se pueden probar, por ejemplo, en normal frente genéticamente células madre genéticamente o en viejo y joven. Sin embargo, el desarrollo de un ensayo relevante es difícil debido a la escasez de células madre específicas de tejido y la falta de condiciones de cultivo que conserva "stemness". Además, un ensayo de este tipo debe ser modificable a las manipulaciones ambientales y genéticos. Una posible solución a estas limitaciones y requisitos es el uso de modelos de ratón que se han diseñado específicamente para detectar mutaciones en el ADN.

MulSe han desarrollado modelos de ratones transgénicos ples para la detección de mutaciones. Por ejemplo, LacI ratones transgénicos ¹⁸ llevar un vector de fago λ recuperable que codifica el sistema reportero de LacI, en el que el gen LacI codifica un supresor del operador lac y sirve como reportero de la mutación. Tras la mutación del gen LacI, el operador lac se activa y se produce β-galactosidasa. escinde β-galactosidasa del sustrato cromogénico X-gal (5-bromo-4-cloro-E-indolil-β-D-galactopiranósido), lo que la convierte azul. Los sitios cos que flanquean el vector LacI permite una fácil recuperación de proteínas del fago lambda y la posterior infección de E. coli. Después de la incubación de E. infectada coli en agarosa que contiene el sustrato X-gal, las placas se puede puntuar. Las placas azules contienen un mutante putativo fago Lac-Me realización, mientras que las placas claras albergan los no mutantes. La frecuencia de placas azules (entre ªe las claras) indica la frecuencia de mutantes en la población original de células se extrajo el ADN de. Por otra parte, el fago λ que aloja el objetivo LacI se puede secuenciar fácilmente usando técnicas de PCR para el análisis de relativamente alto rendimiento. La secuenciación de múltiples genes mutantes LacI revelará información importante sobre el espectro de mutaciones, que a su vez puede señalar posibles deficiencias en las vías específicas de reparación del ADN o para eventos genotóxicos específicos. El sistema transgénico LacI se ha estandarizado a través de múltiples laboratorios ¹⁹ y los reactivos están disponibles comercialmente. Una desventaja importante del sistema de LacI es la capacidad limitada para detectar grandes deleciones o reordenamientos, por lo tanto, otros métodos, por ejemplo, peces de múltiples colores en metafase para untar necesitan ser utilizado para complementar esta deficiencia.

Dentro del vector de fago λ del modelo de ratón LacI, hay un gen mucho más pequeño, CII, Disponible para el análisis de mutaciones. Su tamaño y el hecho de que los mutantes se pueden seleccionar hacen de este un ensayo de mano de obra intensiva y más barato menos ²⁰ que el análisis del gen LacI. Sin embargo, el gen LacI se estudia más ampliamente para la mutagénesis ²¹ y la sensibilidad del gen de mutaciones ha sido bien caracterizado de modo que haya una clara comprensión de los residuos de aminoácidos que generan una respuesta fenotípica en un sustrato cromogénico ^22-25.

Otros modelos de ratón para la detección de mutaciones incluyen el uso de la ΦX174 o los transgenes LacZ. El modelo de ratón transgénico ΦX174, con el original: T → G: mutación de reversión C de ensayo ²⁶ o el ensayo de mutación hacia adelante ²⁷ que permite la detección de un espectro de sustituciones de pares de bases, representa un sistema menos costoso que el modelo de LacI. Sin embargo, la pantalla de mutaciones en el ensayo directo no es trivial, y la especificación de la mutaciónTRUM del transgén ΦX174 no está tan bien caracteriza-como la de la LacI. En modelos de ratones que llevan transgenes LacZ, el reportero LacZ mutacional se recupera utilizando E. células huésped de E. coli que son sensibles a la galactosa y medio que contiene galactosa ^28. Un inconveniente de este sistema es que la recuperación de la diana LacZ también implica digestión con endonucleasas de restricción seguido por ligamiento y la electroporación de E. coli acoge, lo que dificulta la adaptación del sistema para un pequeño número de células. Aunque no es un requisito absoluto para el trabajo con poblaciones de células madre / progenitoras (siempre se puede empezar con más ratones), si se requieren grandes cantidades de células (por ejemplo, millones o más) se convertirá rápidamente poco práctico y un costo prohibitivo. Además, el tamaño relativamente grande de LacZ, mientras que proporciona un reportero mutacional sensible, es engorroso y más costoso para el análisis de secuencia de ADN y determminación de los espectros de mutación. Una ventaja importante de este modelo sin embargo, es su capacidad para detectar grandes deleciones e inserciones, así como reordenamientos cromosómicos.

Dado que todas las células en los modelos de ratones transgénicos LacI, LacZ ΦX174 y llevan el sistema reportero, cualquiera de estos modelos de ratón se puede utilizar para medir la mutagénesis en cualquier tipo de célula de interés, incluyendo las células madre y progenitoras, mientras que puedan ser cosechadas de forma fiable y en número suficiente. Porque tuvimos una gran experiencia con el modelo de ratón LacI y el ensayo de mutación LacI, hemos decidido llevar a cabo este sistema aún más para el análisis de mutagénesis en madre hematopoyéticas y las poblaciones progenitoras.

El tejido hematopoyético es bien caracterizado en términos de fenotipo de la superficie celular de sus componentes individuales, incluyendo las células madre de repoblación a largo plazo, que son identificables como la población extremadamente rara de Lin ^- IL7R ^{- Sca-1 + cKit + + (TSI) / Flk2 - CD150 + CD48 - células 29. . Mohrin et al 4 demostraron que la población ligeramente más grande de LSK/Flk2 - células son todavía buenos representantes de las HSC y significativamente diferente de las más primitivas progenitoras mieloides comprometidos población (CMP) cuando se trata de estudiar la reparación del ADN. Por otra parte, cuando el TSI enriquecido-HSC (Flk-2 + y Flk-2 -) las células se compararon con los Lin - IL7R - Sca-1-cKit + + (células progenitoras LS-K), todavía había una diferencia significativa en NHEJ capacidad 5 entre el menos puro, tallo población TSI enriquecida con células y las células progenitoras. En nuestro estudio utilizamos HSC enriquecido LSK (Flk-2 Flk-2 + y -) de las células, ya que encontramos que se requieren al menos 2 x 10 5 células para obtener resultados consistentes y confiables en este ensayo de mutagénesis, lo que el número de células es extremadamente difícilobtener cuando uno ordena la LSK/Flk2 - población CD150 + CD48 o incluso el LSK/Flk2 - población (en términos de los ratones, los costos y practicidad). Este protocolo, basada en la que originalmente desarrollada por Kohler et al. 18 describe en detalle cómo la frecuencia de mutantes de ADN espontánea puede ser determinada en células LSK y poblaciones de células mieloides diferenciadas, así como células de la médula ósea y del bazo no separada definida.}

Protocolo

Los leucocitos de LacI ratones transgénicos en un fondo C57BL / 6 no expresan Sca-1 (Figura 1). Por lo tanto, si Sca-1 es un marcador utilizado para la purificación de células, estos ratones tienen que ser cruzado con una cepa apropiada para ganar Sca-1 de expresión, en este protocolo de la F1 de un cruzamiento entre C57BL / 6 (B6) ratones normales y LacI (C57BL / 6) ratones transgénicos (LacI) se utiliza (Figura 1). De las poblaciones de células utilizadas en este protocolo, LSKs y CMP representan las poblaciones más pequeñas de la médula ósea. Con el fin de purificar al menos 2 x 10 ⁵ de cada / tipo, combinar la médula ósea de aproximadamente diez ratones cuando la recolección de la médula ósea de las patas traseras o sólo a partir de al menos cuatro ratones cuando también la cadera-,-piernas delanteras, los huesos de la columna vertebral, y se utilizan esternón.

Hacer suspensiones de células individuales de la médula ósea y el bazo. Una pequeña proporción de la médula ósea se utiliza como está, la mayoría se utiliza para purcificar LSKs y células progenitoras mieloides diferenciadas, es decir, CMP y granulocíticos progenitores / monocitos (BPF) por fluorescencia de células activadas por la clasificación (FACS). El aislamiento de células de médula ósea y FACS-purificación de estas poblaciones se describen en otra parte ^30-32. Se requieren aproximadamente seis clases independientes para identificar diferencias significativas en las frecuencias de mutación entre las poblaciones.

El siguiente protocolo para medir la in vivo la frecuencia de mutantes espontáneos en subpoblaciones hematopoyéticas purificadas es una adaptación de varios manuales de instrucciones Stratagene ^33-35, basados ​​en un trabajo original de Kohler et al. ¹⁸ Las diferencias más críticas entre los protocolos existentes ^33-35 y este protocolo , se requiere cuando se utiliza un número relativamente pequeño de células, incluir diferencias en los volúmenes de reactivos y los tiempos y temperaturas usados ​​para la incubación con proteinasa K.

1. Almacenamiento de muestras

Después de recoger las poblaciones de células, las células deseadas alícuotas en tubos de centrifugación de 1 ml (para el número de células por alícuota, véase la Tabla 1). Se centrifuga a 266 g durante 7 min, a 4 º C. Aspirar el sobrenadante cuidadosamente. Poner los tubos en nitrógeno líquido durante 5 minutos y luego transferirlas a un congelador de -80 ° C para uso posterior. Las muestras se pueden almacenar durante al menos 6 meses.

2. Aislamiento de ADN genómico

1. Tomar las muestras desde el -80 ° C congelador. Añadir 500 l de tampón de lisis de ADN enfriado con hielo (Tabla 3) para el tubo de muestra. Vortex los tubos durante 3-5 segundos a velocidad media y colocar los tubos en hielo durante 10 min.
2. Centrifugar los tubos durante 12 min, 4000 xg, 4 ° C. Desechar cuidadosamente ~ 450 l del sobrenadante. Centrifugar el tubo durante 3-5 segundos. Use un tubo capilar de vidrio para eliminar cuidadosamente el resto del sobrenadante. Aire secar las paredes interiores del tque el tubo hasta que no haya gotas son visibles más (~ 2 min).
3. Añadir 2 l de Rnace-Se cóctel de ribonucleasa y 10 l de 1 M DTT a 100 l de tampón de digestión de la ADN (Tabla 3). Ajuste los volúmenes de acuerdo con el número de muestras que se van a procesar; se requiere 20 l de esta solución de digestión de ADN por muestra. Después de la adición de 20 l de esta al sedimento celular, trate de que el diábolo se alejen de la parte inferior, golpeando suavemente el tubo con el dedo o con un lápiz.
   Nota: puede ser difícil de ver la pastilla debido a los números de células bajos.
4. Añadir 20 l solución de proteinasa K * (Tabla 3) a cada muestra, muy golpear suavemente el tubo de nuevo.
   * Nota: la solución de proteinasa K debe ser calentada en un baño de agua 50 ° C, 2 min antes de su uso con el fin de activar la enzima.
5. Coloque el tubo inmediatamente en un 50 ° C baño de agua. Digerir la muestra de acuerdo con las directrices de Tabla 1. Toque en el tubo muy suavemente cada 10 min.
   Nota: Con este tipo de pequeñas cantidades de células, la temperatura del baño de agua y los tiempos de digestión son absolutamente críticos para obtener con éxito el ADN genómico de alta calidad.
6. Preparar el sistema de diálisis de ADN en el cuarto frío (Figura 2). Verter 600 ml de tampón TE (Tabla 3) en un vaso de precipitados de 600 ml de vidrio, añadir una pequeña barra de agitación magnética de manera que el tampón se puede agitó durante la diálisis y dejar que los 0,025 mm (tamaño de poro) membranas flotan en la superficie del tampón. Una membrana por muestra; 1-4 membranas se pueden utilizar en un solo vaso de precipitados de diálisis. Haga una marca en el margen de la membrana con unas tijeras para la identificación de cada muestra.
7. Después de que el tiempo de digestión apropiada, añadir el ADN genómico ahora muy viscoso * cuidadosamente para el centro de la membrana flotante (Figura 2). Cubrir el vaso inmediatamente con papel de aluminio. Dializar el ADN genómico a 4 ° C durante ~ 16-20hr, revuelva suavemente el tampón.
   * Nota: Cuando se trabaja con soluciones de ADN viscosos, utilice puntas de pipeta con una amplia apertura.
8. El día siguiente verter 600 ml de tampón TE recién preparado (Tabla 3) a un vaso de precipitados de vidrio limpio y transferir las membranas para el nuevo vaso de precipitados con una cuchara muy cuidadosamente, y cubre el vaso de precipitados con papel de aluminio. Se dializa durante otras 2 horas.
9. Retire la membrana de diálisis desde el vaso de precipitados con el tampón TE usando una cuchara y transferir sólo el "grupo" más viscosa de la solución de ADN a un nuevo tubo 1 ml, estéril. Conservar la muestra a 4 ° C. Continuar el ensayo de mutagénesis al día siguiente o hasta 1,5 meses más tarde. Para las poblaciones purificadas, espere por lo menos 1 semana.

3. Preparación de bandejas para la E. coli / Phage Cultura (Día 1)

Cada bandeja contiene dos capas diferentes, una capa de agar en la parte inferior y una capa de agarosa en la parte superior que contiene X-gal. La E.solución coli / fago se añadirá a este último. El número y tipo de células aisladas determinará cuántos bandejas se requiere. Consulte la Tabla 1 para calcular el número de bandejas necesarios y cantidades posteriores de soluciones para esta parte del protocolo. A continuación se generará ~ 60 bandejas, que una persona con experiencia puede procesar fácilmente.

1. Prepare los siguientes medios:
   1. para la capa inferior, preparar matraces de 6 x 2 L con cada uno que contiene 1600 ml de ddH ₂ O. Agregue el polvo NZY (21 g / l) y agar (15 g / L) y mezcle bien.
   2. para la capa superior, preparar frascos 4 x 1 L con cada uno conteniendo 800 ml ddH ₂ O. Añadir NZY en polvo (21 g / L) y agarosa (7,2 g / L) y mezcle bien.
   3. para el cultivo de E. coli, añadir 2,5 g de polvo de NZY a cada uno de 2 x 250 ml frascos y llevar el volumen a 100 ml con _ddH2O;
   4. para las bandejas de confirmación que se utilizan en el paso 8, añadir 8,4 g de polvo de NZY y 6 g de agaR a un matraz de 1 L y llevar el volumen a 400 ml con ddH ₂ O.
2. Cubra la apertura de los matraces con papel de aluminio. Mezclar bien y autoclave ellos a 121 ° C, 15 psi durante 30 min.
3. Retire los frascos (Muy caliente!) De la autoclave. Agitar con cuidado los frascos para mezclar el agar y agarosa, luego colocarlos en un 50 ° C baño de agua. Cuando el baño de agua ha llegado a 50 ° C de nuevo, vierta de los frascos de L 2 (paso 3.1.1) ~ 150 ml de agar NZY en cada bandeja (capa inferior).
4. Permitir que el agar se solidifique a temperatura ambiente durante al menos 2 h, a continuación invertir y abrir las bandejas. Coloque la parte inferior de las bandejas en la tapa, 45 ° fuera del centro (Figura 3) y dejar secar durante 30 minutos. Cierre las bandejas y dejar O / N a temperatura ambiente.
5. Mientras tanto, preparar el SCS-8 E. cultivo de E. coli para el día siguiente. Desde una de las dos matraces de 250 ml * (paso 3.1.3), tomar 5 ml de caldo NZY (Tabla 3) y transferir a un estéril 14 mtubo l. Suplemento con 62,5 l de / _MgSO4 solución de maltosa y añadir 10 l de la SCS-8 E. glicerol coli valores. Incubar a 37 ° C durante 3-4 horas con agitación a 250-300 rpm. Utilice 15 l de este cultivo para inocular 95 ml de caldo NZY (en un matraz de brazo lateral 250 ml), cultivo O / N a 37 ° C en una incubadora de agitación (250-300 rpm).
   * Nota: el otro matraz de 250 ml se puede utilizar más adelante para ajustar el diámetro exterior de la cultura, si es necesario (paso 4.1)
6. Tome el frasco de 1 L con agar (paso 3.1.4), y vierta ~ 6-7 ml de agar NZY en placas de 60 mm (esto será suficiente para ~ 50 platos, necesarios para el paso 8). Permita que se endurezca el agar (~ 10 min), a continuación, invertir y envolver en plástico. Estos platos se pueden mantener a 4 º C durante hasta un mes.

4. Preparación de bandejas para la E. coli / Phage Cultura (Día 2)

1. Compruebe el diámetro exterior de la SCS-8 E. cultivo de E. coli (paso 3.5) en el espectrofotómetro.Ajuste el OD ₆₀₀ a 0,6 con NZY caldo (Tabla 3) (paso 3.1.3), y colocar el matraz en hielo para detener el crecimiento y mantener en hielo hasta que esté listo para su uso. Esto se utilizará para los pasos 6.3 y 8.2. Esta cultura se puede mantener durante 5 días a 4 ° C.
2. Aire secar todas las bandejas de ensayo (derramado el día anterior) durante ~ 5 horas (Figura 3).

5. Empaquetamiento del ADN genómico (Día 2; Continuación)

1. Tome el número requerido de naranja Transpack los tubos a -80 ° C congelador y colocarlos en hielo seco hasta que esté listo para su uso, tome un tubo Transpack naranja para cada reacción de embalaje a realizar. Etiquete cada tubo adecuadamente. Tener las muestras de ADN genómico (paso 2.9) listo en hielo.
2. Este paso se debe realizar un tubo en el momento. Termina el paso completo antes de pasar a la siguiente muestra de ADN. Descongelar un tubo naranja * ^{1 nota} rápida: usar los dedos hasta que la mayor parte se descongelaron, a continuación, poneren hielo. Tomar la muestra de ADN genómico correspondiente y transferir inmediatamente 8-12 muestra l * ^{nota 2,3} en el tubo de color naranja. Mezcle el contenido con la pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo de 3x, así como golpeando suavemente el tubo con el dedo. Trate de no introducir burbujas al mezclar. Coloque el tubo en un 30 ° C baño de agua durante 90 min.
   * Nota 1: una vuelta rápida en una microcentrífuga puede ser necesario reunir todos los contenidos de las paredes interiores y el tapón.
   * Nota 2: volumen de muestra añadido depende del número de células utilizado para generar esa muestra: 11-12 l de las muestras preparadas 2,0 a 5,0 x 10 células ^5; 10 l de 1,0 x 10 ⁶ células-muestras, y 8 l de 1,5 x 10 ⁶ células-muestras.
   * Nota 3: El ADN es todavía muy viscoso; para tomar el ADN a cabo, empuje la punta de la pipeta a la parte inferior del tubo de muestra y cuidadosamente gire alrededor de la punta contra la pared interior del tubo.
3. Tomar 1 o 2 azul Transpack mabes * el -80 ° C congelador y colocarlos en hielo seco hasta su uso posterior. Descongelar rápidamente y la transferencia de 12 l a cada uno de los tubos de color naranja. Mezcle la solución suavemente pipeteando arriba y abajo 3 veces. Haga girar el tubo hacia abajo durante 2-3 segundos y después en el tubo con el dedo para obtener más mezcla y volver inmediatamente a la 30 ° C baño de agua durante otros 90 min.
   * Nota: Use 1 tubo azul por 5-6 reacciones y 2 tubos azules de 10-12 reacciones.
4. Después de 90 min, se diluye cada reacción de 970 l con tampón SM * (Tabla 3) para detener la reacción y agitar a velocidad media durante 5 seg. Poner los tubos en hielo hasta su utilización posterior.
   * Nota: si el número de células es ≤ 5 x 10 ^5, utilizar 500 l de tampón SM (Tabla 3) para detener la reacción; 2 tubos (de la misma muestra) a continuación, se pueden combinar más adelante (paso 6.4).

6. Plating Packaged ADN genómico (Día 2; Continuación)

1. Cierre el agar invertida tLos rayos que se abrieron para el secado de la mañana. Etiquetar las bandejas para cada muestra.
2. Disolver 4,8 g de X-gal en 16,8 ml de N, N-dimetilformamida (necesaria para el paso 6.5). Agitar inmediatamente y se puso una plataforma de agitación. Protéjase de la luz. Solución debe ser transparente en 20-30 min.
3. Alícuota del SCS-8 E. células de E. coli. Para cada conjunto de bandejas *, utilizar un tubo cónico de 50 ml. Etiquetar el tubo con el nombre de la muestra de ADN empaquetado. Añadir 2 ml de E. coli suspensión para cada bandeja.
   * Nota: Por ejemplo 3 x 10 ⁵ BPM requiere un conjunto de 8 bandejas (ver Tabla 1). Por lo tanto, dos alícuotas, requieren 8 x 2 = 16 bandejas. Mantener las alícuotas separadas y por lo tanto se preparan dos tubos de 50 ml, con cada 8 x 2 = 16 ml E. suspensión coli.
4. Agregue los 1 ml * de muestra de ADN empaquetado (del paso 5.4) en el tubo de 50 ml apropiada que contiene el SCS-8 E. alícuota coli y mezclar bien. Incubar la E. coli / mezcla de fagos en una incu sacudiendoBator (250-300 rpm), a 37 º C durante 23 min.
   * Nota: Si el ADN se extrajo de ≤ 5 x 10 ⁵ células, se utilizó 500 l de tampón SM para detener la reacción (paso 5.4). En este paso, los tubos se pueden combinar y se añadieron a un tubo cónico de 50 ml.
5. Cuando la E. mezcla coli / fago está incubando, iniciar los preparativos para la capa de agarosa superior. Añadir 5 ml de X-gal / solución de N, N-dimetilformamida (paso 6,2) a cada matraz 800 ml de solución de agarosa capa superior (de la etapa 3.1.2; mantuvo a 50 ° C). La concentración final de X-gal será de 1,5 mg / ml. El X-gal puede precipitar un poco cuando se añade a la agarosa. Agite para disolver el X-gal y poner la botella en el baño de agua a 50 ° C.
6. Tome la E. mezcla coli / fago de la incubadora (paso 6.4). Cada muestra requiere de múltiples bandejas, cada bandeja, requiere 50 ml de solución X-gal/agarose (paso 6.5). Verter el volumen requerido de X-gal/agarose para cada muestra (es decir, 50 ml xnúmero de bandejas) en una botella de plástico estéril más grande y añadir el E. apropiada coli / mezcla de fagos. Agite la botella para mezclar. Divida la mezcla en alícuotas de 45-50 ml en tubos de 50 ml cónicos. El número de tubos debería ser el mismo que el número de bandejas necesarios para esa muestra.
   Nota: La solución X-gal/agarose restante se usarán en el paso 8.3. La solución puede ser almacenada en un 50 ° C baño de agua hasta su uso posterior.
7. Vierta los 50 ml de la mezcla de agarosa superior a través de la mitad inferior de la bandeja de ensayo. Difundir rápidamente la agarosa por la inclinación de la bandeja ensayo ligeramente en una dirección.
   Nota: la agarosa se enfriará muy rápidamente y será imposible para extenderse sobre la bandeja. Por lo tanto, este paso debe realizarse relativamente rápido y con agarosa que se ha mantenido a 50 ° C.
8. Deje que la parte superior de agarosa se endurezca durante al menos 15 min. Entonces, invertir y abrir las bandejas de ensayo para dejarlos secar al aire durante 30 minutos (Figura 3).
9. Cierre las bandejas, se incuban las bandejas de ensayo invertidos (lado de la capa de agar inferior en la parte superior) a 37 ° C durante 15-16 horas. No apile más de 5 bandejas.

7. La determinación de una frecuencia putativos Mutant (Día 3)

1. Retire las bandejas de la 37 ° C incubadora y dejar enfriar. Cuenta las unidades formadoras de placas translúcidas (UFP) en cada bandeja, seleccionar al azar 2 sitios en las bandejas, dibujar un cuadrado * de 2.5 x 2.5 cm ² o 5 x 5 cm ² y contar toda la UFP en cada cuadrado con un contador de células marca (Figura 4A, B).
   * Nota: Para dibujar el uso plaza un dispositivo como se muestra en la figura 5. Si el número de contado PFUs es ≥ 40, utilice el cuadrado más pequeño, de lo contrario usar el más grande.
2. Tomar la media de los cuadrados contados y se multiplica por 96 si al contar con un cuadrado más pequeño, o multiplicar este número por 24 si al contar con la grande. Sume el número de UFP contado para todas las bandejas de la same muestra. Este es el número total de UFP generado para esa muestra.
3. Siguiente, contar las placas mutantes en cada bandeja. Las bandejas se han enfriado, lo que ayudará a localizar las placas mutantes. Para facilitar aún más la detección de las placas azules, mover la bandeja sobre una superficie de color rojo y / o blanco; hojas de papel rojo y blanco funcionar bien. Circule cualquier placa azul con un rotulador. Registre la forma y la intensidad del color azul de cada mutante (por ejemplo, completo, círculo, sector, Figura 4C) ^36,37.
4. Determinar la frecuencia mutante putativo para cada muestra dividiendo el número de mutante UFP (paso 7.3) por el número total de UFP (paso 7.2).

8. Verificación de Presuntos Mutant placas (día 3-5)

1. Utilizando una pipeta Pasteur, núcleo de cada mutante (azul) UFP y transferir el enchufe en 250 l de tampón SM estéril (Tabla 3). Añadir 25 l de cloroformo y agitar durante 5 segundos unad almacena a 4 º C para continuar al día siguiente o dejar durante 2 horas a temperatura ambiente antes de continuar con el siguiente paso, para verificar que el mutante PFU es de hecho un mutante. Las muestras se pueden almacenar a 4 ° C durante al menos 1 año.
2. Marque uno 1 ml y un tubo estéril de 4 ml para cada mutante que estaba enchufado. En el nuevo tubo de 1 ml, diluir el fago se resuspendió liberado del tapón de agar (paso 8.1) 1:50 en tampón SM estéril (2 l de muestra en 100 l de tampón SM (Tabla 3)), agitar brevemente, a un lado. A los 4 ml tubo estéril añadir 200 l SCS-8 E. cultivo de E. coli (del paso 4.1) y 2 l de fago diluido a partir del correspondiente tubo de 1 ml, se incuba a 37 ° C durante 5-10 min.
3. Añadir 2,5 ml de la agarosa superior que contiene X-gal (-sobre la izquierda desde el paso 6,6) a cada tubo 4 ml, tubo de turbulencia para mezclar y verter sobre una placa de agar de 60 mm de NZY previamente vertido (paso 3.6). Dejar durante 10 minutos (para permitir que tque la parte superior de agarosa solidifique), invertir la placa e incubar O / N a 37 ° C.
4. A la mañana siguiente, retire el plato de la incubadora y determinar la proporción de azul PFUs en cada plato (Figura 6). Cuando el 70% o más de la UFP son de color azul, un mutante se considera confirmado ^38,39. Núcleo de la placa mutante del plato y poner en un 1,5 ml con tapón roscado de tubo, que contiene 250 l de tampón SM (Tabla 3) y 25 l de cloroformo, sino que ahora está listo para la secuenciación.
5. Cuando el 50% o menos de la UFP es azul, no se considera un verdadero ^38,39 mutante. Cuando la frecuencia de azul PFUs está entre el 60-70%, comprobar de nuevo en las notas sobre la forma de la placa, y si la forma de la UFP estaba "llena", continúe con la secuenciación.

9. Secuenciación de mutaciones en el LacI T eno

1. Configure las reacciones de PCR en un volumen de reacción de 25 l, incluyendo 1,5 μ; L de sobrenadante de placa (plantilla, paso 8.4), el cebador directo SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3 ') y el SR2 cebador inverso (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3'). Utilice el kit de polimerasa de Taq PCR extensor de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las condiciones de ciclación son las siguientes: 94 ° C durante 2 min, luego 35 ciclos de 94 ° C durante 20 seg, 60 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 2 min, seguido por un paso final de 72 º C durante 5 min .
2. Tomar una parte alícuota de 5 l de cada reacción y se ejecutan en un gel de agarosa al 0,8%, para confirmar la amplificación.
3. Limpie las reacciones de PCR utilizando el kit de limpieza Augencourt acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. Cuantificar el ADN molde.
5. Utilice ~ 100 ng de producto de PCR como ADN molde para la secuenciación. Amplicones secuencia en ambas direcciones usando los mismos cebadores de PCR como cebadores de secuenciación (véase más arriba).
6. Montar y alinear secuencias con la secuencia de referencia LacI ⁴⁰ para detectar Mutations.

Resultados

El ensayo in vivo de la mutagénesis in mide un evento raro (UFP mutante) entre muchos eventos (todo UFP). Al realizar el ensayo con pequeño número de células, es posible que el resultado está influido considerablemente por los resultados falsos positivos y falsos negativos. Para solucionar este problema se realiza un experimento de dilución en serie con las células de la médula ósea no fraccionadas, cosechado de tres animales diferentes. Se midió la frecuencia de mutantes en la médula ...

Discusión

El ensayo in vivo de mutagénesis in descrito en el presente documento se basa en el modelo de ratón transgénico LacI originalmente generada por Kohler et al. ¹⁸ Este modelo utiliza un vector de fago λ que lleva un gen reportero lacI. Los dos sitios cos que flanquean el vector permite una recuperación relativamente simple y envasado posterior en partículas de fago infecciosas, utilizados para infectar E. coli. Una placa azul será generado po...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
LacI transgenic mice	BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail	Agilent Technologies (Stratagene)	720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli	Agilent Technologies (Stratagene)	200221
DNA size standards – lambda ladder	Bio Rad	170-3635
0.025 mM pore size membranes	Fisher (Millipore)	VSWP 025 00
245 mm2 bioassay dishes (trays)	Fisher (Corning)	07-200-600
NZY broth (powder)	Fisher (Teknova)	N1144
Agar	Fisher	BP1423-500
Agarose	Fisher	E-3120-500
N, N-dimethylformamide	Fisher	AC34843-5000
X-gal	Research Products Intl Corp (RPI)	B71800-10.0
Proteinase K	Roche	3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit	5 PRIME	2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit	Beckman/coulter	A63880