정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인

요약

여기서 우리는 LACI 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 정제 조혈 세포의 작은 숫자에 대한 생체 내 돌연변이 분석에 대해 설명합니다. LACI 유전자는 DNA의 돌연변이의 빈도, 위치 및 유형 자발적으로 일어 나 genotoxins에 노출 된 후를 결정하기 위해 분리 할 수있다.

초록

최근, 그것은 게놈 불안정성 단단히 많은 발달 장애, 암, 노화 관련되어 있다는 것이 명백되고있다. 줄기 세포가 생활 전반에 걸쳐 조직의 항상성 및 수리를 보장하는 책임이 있음을 감안할 때, 그것은 줄기 세포 인구는 조직의 게놈 무결성을 보존하는 중요한 가설하는 것이 합리적이다. 따라서, 상당한 관심이 줄기 세포 기초 질환의 병인을 이해하는 것을 목표로, 게놈 줄기 세포의 무결성 및 그들의 자손에서 내인성 및 환경 적 요인의 영향을 평가 생겨났다.

LACI 형질 전환 마우스는 LACI 유전자가 돌연변이 기자 역할을하는 LACI 기자 시스템을 암호화하는 복구 λ 파지 벡터를 수행합니다. 돌연변이 LACI 유전자의 결과는 클리브 파란색으로 돌려 발색 기질을, β-갈 락토시다 아제의 생산이다. LACI 기자 시스템은 수행의 i줄기 / 전구 세포를 포함하고 쉽게 복구이어서 E. 감염하는 데 사용할 수있는 모든 셀에 N, 대장균. 감염된 E. 배양 한 후 정확한 기판을 포함 아가로 오스에 대장균, 패 득점 수 있으며, 맑은 플라크가 야생형 항구 파란색으로 플라크는 돌연변이 LACI 유전자를 나타냅니다. 플라크 (클리어 중) 블루의 주파수는 DNA가 추출 된 원래 세포 인구의 돌연변이 빈도를 나타냅니다. 돌연변이 LACI 유전자를 시퀀싱 유전자의 돌연변이의 위치와 돌연변이의 종류를 표시합니다.

LACI 유전자 변형 마우스 모델에서 생체 내 돌연변이 분석으로 잘 확립되어있다. 또한, 분석을위한 마우스 및 시약은 시판되고있다. 여기에서 우리는이 모델이 자발적으로 줄기 세포가 풍부한 린의 DNA 돌연변이 발생 빈도를 측정하기 위해 적용 할 수있는 방법을 자세히 설명 ^- IL7R ^- 무서-1 ⁺ CKIT ^{+ +} (LSK) 세포 및 조혈 시스템의 다른 부분 모집단.

서문

대부분의 조직에서 분화 된 세포는 제한된 수명이 있습니다. 기능적 무결성을 유지하기 위해, 수명이 긴, 조직 특이 적 줄기 세포는 지속적으로 차례로 특정 조직의 기능에 필요한 완전히 분화 된 세포에 야기 전구 세포를 생성한다. 줄기 세포는자가 재생 (self-renewal)이라는 과정을 통해 자신의 구획을 보충. 따라서, 줄기 세포들은 따라서 안으로있는 조직의 기능 무결성을 유지할 책임이 있으며, 그것은 그들이이 손상된 DNA를 감지하고 잠재적으로 복구하는 강력한 메커니즘을 갖추고 있습니다 것이 필수적입니다. 그렇지 않은 경우, 그들은 그들의 자손에 의해 상속 할 수있는 여러 게놈 (유해) 섭동을 획득 할 수있다. 줄기 세포는 유기체의 수명 동안 자신의 게놈을 안전 보호하는 방법을 이해하는 것은 중요한 문제이며, 게놈 불안정성은 암 ^(1,2 검토) 다른 연령과 관련된 질병에 링크 된 이유를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

줄기 세포 또는 초기 전구 세포 집단의 수준에서 조직의 게놈 무결성을 제어하는​​ / 세포의 죽음, 노화 또는 차별화를 통해 세포에 결함이 줄기 (또는 전구)를 제거하고, 하나 또는 효율적인 수리에 의해 달성 될 수있다 손상된 DNA. 최근의 연구는 이러한 희소 인구 ^3-6에서 직접 DNA 수리 및 특정 유형을 측정하는 것이 가능하다는 것을 증명하고있다. 그것은 예를 들어, 조혈 시스템, 이중 가닥의 DNA 나누기 (NHEJ), 후자는 낮은 충실도의 복구 프로세스 인 및 제조, 따라서 위험 증가에 합류 상동 재조합 (HR) 또는 비 동종 말까지 복구 할 수 있다는 것을 발견 오류. 모두가 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포) ^4,5에 활용되고있다, 그러나, 마우스에 초기 조상 세포가 HR ^4를 사용하는 반면이 조혈 모세포에서 주로 NHEJ 것 같다. 비슷한 관측 피부 ⁶ 줄기 세포를 위해 만들어졌습니다. 흥미롭게도, 인간의 조혈 모세포 HR에서,하지 NHEJ,이중 가닥 나누기 ^3에 대한 선택의 복구 메커니즘이 될 것으로 보인다. 두 종 사이의 기능적 차이가 실제 또는 단순히 기술이나 실험적인 차이를 나타내는 지 여부는두고 볼 일이다.

손상된 DNA를 복구하는 줄기 세포의 레퍼토리는 기본 절단 수리 (BER), 뉴클레오티드 절단 수리 (NER)과 불일치 수리 (MMR) 등의 DNA 복구 메커니즘을 포함 할 가능성이있다. DNA 손상 이러한 유형의 NHEJ 또는 HR 복구 할 수 없습니다 MMR 수정 기본베이스 불일치 및 삽입 / 삭제 루프 동안 BER과 NER는 단일 가닥 DNA에서 하나 또는 여러 개의 기본 쌍의 병변을 수리 할 책임이 있습니다. 이 개념을 지원하는 것은 HSC 구획 ^7-9에서 이러한 경로와 이상 중 하나에 변화 사이의 링크를 보여주는 조혈 시스템뿐만 아니라, 골수이 형성 증후군 ^10-16,에 발생한 질병을 개발의 증가 위험에서 여러 연구하다HSC는 그 질병이 진행됨에 따라 ^(17)을 게놈 불안정성을 증가와 연관된다. 아직 바와 같이, 직접 조혈 모세포의 BER, NER 및 MMR의 측정은보고되지 않았다.

기계론 수준에서 티슈 무결성을 제어하는 다양한 프로세스를 해명 외에도, 이러한 프로세스 중 하나의 수차의 영향은 유 전적으로 대 정상에서 예를 들면, 테스트 될 수 있도록, 돌연변이 DNA의 정도를 측정 할 수있는 것이 필수적이다 설계 줄기 세포 또는 젊은 대 이전에. 그러나, 중요한 분석의 발전 때문에 조직 특이 적 줄기 세포의 소수와 "stemness"를 유지 배양 조건의 부족으로 인해 곤란하다. 또한, 이러한 분석은 환경 및 유전 적 조작을 수정할 수있는 있어야한다. 이러한 제한 사항 및 요구 사항에 대한 해결 방안이 구체적으로 DNA의 돌연변이를 검출 할 수 있도록 설계되어 마우스 모델을 사용하는 것입니다.

MUL돌연변이 검출을위한 tiple 형질 전환 마우스 모델이 개발되었다. 예를 들어, LACI 형질 전환 마우스 ^(18)는 LACI 유전자가 락 연산자의 억제를 인코딩하고 돌연변이 기자 역할을하는 LACI 기자 시스템을 암호화하는 복구 λ 파지 벡터를 수행합니다. LACI 유전자의 돌연변이에, 락 운영자가 활성화되고, β-갈 락토시다 아제가 생성됩니다. β-갈 락토시다 클리브이 파란색으로 변 발색 기질의 X-GAL (5 - 브로 모 -4 - 클로로 - e-인돌 릴-β-D-갈 락토 피 라노 사이드). LACI 벡터 측면의 COS 사이트는 람다 파지의 단백질과 E. 이후의 감염에 의해 쉽게 복구 할 수 있습니다 대장균. 감염된 E. 배양 한 후 대장균은 X-GAL 기판을 포함 아가 로스에 패 득점 할 수있다. 분명 플라크가 아닌 돌연변이를 정박하는 동안 블루 플라크, 락-I는 파지를 들고 추정 돌연변이가 포함되어 있습니다. 일 사이에 블루 플라크의 주파수 (전자 명확한 것)는 DNA가 추출 된 원래 세포 인구의 돌연변이 빈도를 나타냅니다. 더욱이 LACI 타겟을 호스팅 λ 파지가 용이 비교적 높은 처리량 분석 PCR 기법을 사용하여 시퀀싱 될 수있다. 여러 돌연변이 LACI 유전자를 시퀀싱 차례로 특정 DNA 수리 경로에서 가능한 결함 또는 특정 유전 독성 이벤트를 가리킬 수 변이 스펙트럼에 대한 중요한 정보를 공개합니다. LACI 형질 전환 시스템은 여러 실험실 ^{19 일에} 걸쳐 표준화되어 시약은 상업적으로 사용할 수 있습니다. LACI 시스템의 하나의 주요 단점은 대형 삭제 또는 재 배열을 감지하는 능력이 제한적이며, 따라서 중기 확산에 다른 방법, 예를 들어, 멀티 컬러 FISH이 부족을 보완하기 위해 사용되어야합니다.

LACI 마우스 모델의 λ 파지 벡터 내에 훨씬 작은 유전자 CII있어돌연변이 분석에 사용할 수 있습니다. 크기와 돌연변이가 선택 될 수 있다는 사실이 LACI 유전자 분석보다 덜 노동 집약적 저렴 세이 ²⁰ 만든다. 발색 기질 ^22-25에 대한 표현형 반응을 발생 아미노산 잔기의 명확한 이해가되도록 그러나의 lacI 유전자가 더욱 광범위 돌연변이 ^(21)와 돌연변이 유전자의 감성 연구되고 잘 특징으로하고있다.

돌연변이 검출을위한 기타 마우스 모델 ΦX174 또는 LacZ를 트랜스 진의 사용을 포함한다. T → G : 원본과 ΦX174 형질 전환 마우스 모델, C의 복귀 돌연변이 시험 ²⁶ 또는 염기쌍 치환의 스펙트럼의 검출, LACI 모델보다 적은 비용으로 시스템을 나타냅니다 수있는 앞으로 돌연변이 시험 ^27. 그러나, 앞으로 분석에서 돌연변이 화면이 사소한 돌연변이 사양이 아닙니다ΦX174 전이 유전자의 TRUM은 같은 LACI의 같은 특성이 잘되지 않습니다. LacZ를의 형질 전환 유전자를 운반 마우스 모델에서 LacZ를 돌연변이 기자는 E.을 이용하여 복구 갈락토스와 갈락토스 ^(28)를 포함하는 매체에 민감한 대장균 숙주 세포. 이 시스템의 단점은 LacZ를 타겟의 회복 또한 E. 결찰 및 일렉트로이어서 제한 효소 분해를 수반한다는 것이다 대장균함으로써 어려운 세포의 수가 적은 시스템에 적응하고, 호스팅합니다. 이 줄기 / 전구 세포 집단 작업을위한 절대적인 요건 (하나는 항상 더 많은 쥐를 시작할 수)은 아니지만 세포의 큰 숫자 (예를 들어 수백만 이상) 필요한 경우, 신속하게 허무하고 엄청난 비용이 될 것입니다. 민감한 돌연변이 리포터를 제공하면서 또한, LacZ를 중에서 비교적 큰 크기, 복잡하고 DNA 서열 분석 및 determ 더 비싸다돌연변이 스펙트럼의 ination. 이 모델의 주요 이점은 있지만, 그것의 큰 삽입 및 결실을 검출 할 수있는 능력뿐만 아니라, 염색체 재 배열이다.

LACI, ΦX174 및 LacZ를 트랜스 제닉 마우스 모델에서 모든 셀은 리포터 시스템을 운반하기 때문에, 이러한 마우스 모델 중 어느 한 그들은 확실하게 수납 할 수 있기 때문에, 줄기 및 전구 세포를 포함하여, 그 어떠한 세포 유형에 돌연변이를 측정하기 위해 사용될 수있다 충분한 숫자. 우리가 LACI 마우스 모델과 LACI 돌연변이 분석과 광범위한 경험을 가지고 있기 때문에, 우리는 조혈 줄기 및 전구 인구에서 돌연변이 분석에 대한이 시스템을 추구하기로 결정했다.

조혈 조직은 린의 극히 드문 인구로 식별 장기를 다시 채우기 줄기 세포를 포함하여 개별 구성 요소의 세포 표면 표현형의 측면에서 잘 특징 ^- IL7R ^{- 무서-1 + CKIT + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - 세포 29. . 그것은 DNA의 수리를 공부에 관해서 세포가 여전히 조혈 모세포에 좋은 대표하고 가장 원시적 인 헌신 골수 전구 (CMP) 집단에서 유의 한 차이 - Mohrin 등 4 LSK/Flk2의 약간 큰 인구는 것을 보여 주었다. 또한, 경우 HSC - 농후 LSK (FLK-2 + 및 FLK-2 -) - IL7R - 셀 린 비교 하였다 무서 -1 - CKIT + + (LS-K 전구 세포)에있는 상당한 차이가 여전히 있었다 덜 순수한 사이 NHEJ 능력 5, 세포 농축 LSK 인구 및 전구 세포를 줄기. 이 셀의 수는 매우 어렵습니다, 우리는 적어도 2 × 10 5 세포가이 돌연변이 분석에 일관 신뢰할 수있는 결과에 필요한 것을 발견하기 때문에 세포 - 우리의 연구에서 우리는 LSK (FLK-2 + 및 FLK-2) HSC 강화 사용CD150 + CD48 인구 또는 LSK/Flk2 - - 인구 (마우스, 비용과 실용성 측면에서) 하나가 LSK/Flk2을 정렬 할 때 얻었다. 원래 콜러 등. (18)에 의해 개발 된 하나에 기초하여이 프로토콜은, 자발적인 DNA 돌연변이 빈도가 차별화 골수 세포의 집단뿐만 아니라 분리되지 않은 골수 및 비장 세포 LSK 세포 판단되고 정의 될 수있는 방법을 상세하게 설명한다.}

프로토콜

C57BL / 6 배경에 LACI 형질 전환 마우스에서 백혈구가 무서-1 (그림 1) 표현하지 않습니다. 무서-1 세포의 정화에 사용되는 마커 따라서,이 마우스는 무서-1의 발현을 얻을 수있는 적절한 긴장과 교차 할 필요가,이 프로토콜의 정규 C57BL / 6 (B6) 마우스 및 LACI 사이의 십자가의 F1 (C57BL / 6) 형질 전환 마우스 (LACI)는 (도 1)를 사용 하였다. 이 프로토콜에서 사용되는 세포 집단 중에서 LSKs 및 CMP한다은 골수의 작은 집단을 나타낸다. 만 뒷다리 또는 적어도 네 마우스에서 골수를 수확 할 때 최소 2 각 × 10 ⁵ / 종류, 약 10 생쥐에서 골수를 결합 정화하기 위해 경우에도 엉덩이, 앞 다리 -, 척추 뼈, 흉골이 사용됩니다.

골수 및 비장에서 단일 세포 현탁액을 확인합니다. 골수의 작은 비율은 그대로, 대다수는 PUR하는데 사용된다 사용(FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 LSKs 차별화 된 골수 전구 세포, 즉 CMP한다과 과립 / 단핵 전구 세포 (GMP를)를 쓸어. 골수 세포의 분리 및이 인구의 FACS 정화 다른 곳에서 ^30-32 설명되어 있습니다. 약 6 독립적 인 종류는 인구 사이의 돌연변이 빈도에 큰 차이를 식별해야합니다.

정제 조혈 모집단의 자발적인 생체 돌연변이 주파수를 측정하는 다음과 같은 프로토콜은 콜러 등. ^{(18)로부터} 원래의 작업을 기반으로 여러 스트라 타진의 사용 설명서 ^33-35에서 적응 기존의 프로토콜 ^33-35이 프로토콜 사이의 가장 중요한 차이 세포의 상대적으로 작은 숫자를 사용할 때 필요한 시약의 양의 차이와 시간 및 단백질 분해 효소의 K 배양에 사용되는 온도 (가) 있습니다.

1. 샘플 저장

1 ㎖의 원심 분리 튜브에 원하는 세포 집단, 분취 량의 세포를 수집 한 후 (분취 액 당 세포 수에 대해, 표 1 참조). 4 ℃에서 7 분 266 XG에 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 대기음. 5 분 동안 액체 질소에 튜브를 넣고 다음 추가로 사용하기 위해 -80 ° C 냉동고로 전송. 샘플은 적어도 6 개월 이상 동안 저장 될 수있다.

2. 게놈 DNA의 분리

1. -80 ° C 냉동고에서 샘플을 채취. 샘플 튜브에 얼음처럼 차가운 DNA의 용해 버퍼 (표 3) 500 μl를 추가합니다. 소용돌이 중간 속도에 3 ~ 5 초와 10 분 동안 얼음에 튜브를 배치 튜브.
2. 12 분 동안 튜브, 4,000 XG, 4 ° C.를 원심 분리기 조심스럽게 ~ 상층 액 450 μl를 폐기합니다. 3 ~ 5 초 동안 튜브를 스핀 다운. 조심스럽게 상층 액의 나머지를 제거하기 위해 유리 모세관 튜브를 사용한다. T의 내부 벽을 자연 건조그는 관에는 방울 (~ 2 분) 더 이상 볼 수 없을 때까지.
3. DNA 소화 버퍼 (표 3) 100 μL에 RNace - 그건 리보 뉴 클레아 칵테일 2 μL와 1 M DTT의 10 μl를 추가합니다. 처리되는 샘플의 수에 따라 볼륨을 조정,이 DNA 소화 용액 20 ㎕는 샘플 당 요구된다. 세포 펠렛이 20 ㎕를 추가 한 후, 펠렛 부드럽게 손가락이나 펜으로 튜브를 눌러, 아래에서 자신을 분리하기 위해 시도합니다.
   참고 :이 때문에 낮은 세포 수의 펠렛을 확인하기 어려울 수 있습니다.
4. 아주 부드럽게 다시 튜브를 살짝 각 샘플에 20 ㎕의 단백질 분해 K 솔루션 * (표 3)를 추가합니다.
   *주의 : 테 K 용액을 50 ° C의 물 욕에서 예열되어야 2 분간 효소를 활성화하기 위해 사용 전에.
5. 50 ° C의 물을 욕조에 즉시 튜브를 놓습니다. 의 지침에 따라 샘플을 소화 표 1. 매 10 분 아주 부드럽게 튜브를 누릅니다.
   참고 : 세포의 숫자와 같은 작은, 수욕의 온도 및 분해 시간이 성공적 고품질 게놈 DNA를 얻기 위해 절대적으로 중요하다.
6. 추운 방에있는 DNA 투석 시스템 (그림 2)을 준비합니다. , 600 ㎖의 유리제 비커에 넣고 600 ㎖의 TE 완충액 (표 3)을 따르 버퍼 투석하는 동안 교반 할 수 있도록 작은 자기 교반 막대를 추가하고 (0.025 mM의 크기 기공) 막이 버퍼의 표면에 떠하자. 샘플 당 하나의 막; 1-4 막은 단일 투석 비이커에 사용될 수있다. 각 시료의 식별을 위해 가위로 막 여백에 표시를합니다.
7. 적절한 소화 시간 후, 지금은 매우 점성 게놈 DNA * 조심스럽게 떠있는 멤브레인의 중심에 (그림 2)를 추가합니다. 바로 알루미늄 호일로 비이커를 커버. ~ 16-20를 위해 4 ° C에서 게놈 DNA를 Dialyze시간은 부드럽게 버퍼를 저어.
   * 참고 : 점성 DNA 솔루션을 작업 할 때, 폭 넓은 개방과 피펫 팁을 사용합니다.
8. 다음 날은 깨끗한 유리 비커에 새로 제조 된 TE 버퍼 (표 3)의 600 ㎖에 넣고 아주 조심스럽게 숟가락으로 새로운 비커에 세포막을 전송하고, 호일로 비이커를 포함한다. 또 다른 2 시간 동안 Dialyze.
9. 숟가락을 사용하여 TE 버퍼와 비커에서 투석막을 제거하고 새, 멸균 1 ㎖ 튜브에 DNA의 솔루션의 가장 점성 "덩어리"를 전송합니다. 4 ° C에서 샘플을 보관 다음날 돌연변이 분석을 계속하거나 최대 1.5 개월 후. 정제 된 인구를 들어, 적어도 일주 기다립니다.

3. E. 용 트레이의 준비 대장균 / 파지 문화 (1 일)

각 트레이는 두 개의 서로 다른 층을 포함하는 것이다 바닥에 한천 층과 X-GAL을 포함하는 상단의 아가로 오스 층. E.콜라이 / 파지 액은 후자에 첨가 될 것이다. 고립 된 세포의 수와 유형이 필요합니다 얼마나 많은 트레이를 결정합니다. 필요한 트레이와 프로토콜의이 부분에 대한 솔루션의 후속 양의 수를 계산하는 표 1을 참조하십시오. 다음은 ~ 한 경험이 풍부한 사람이 쉽게 처리 할 수​​ 있습니다 (60) 트레이를 생성합니다.

1. 다음 미디어를 준비합니다
   1. 아래 층에 각각 DDH ₂ 1,600 ml의 O를 포함하는 6 × 2 L 플라스크를 준비 NZY 분말 (21g / L) 및 한천 (15g / L)를 추가, 잘 섞는다.
   2. 꼭대기 층에 각각 800 밀리리터 DDH ₂ O를 포함하는 4 x 1 L 플라스크를 준비 NZY 분말 (21g / L)와 아가로 오스 (7.2 g / L)를 추가, 잘 섞는다.
   3. E.을 배양 대장균은, 2 × 250 ml의 플라스크에 각각 NZY 분말 2.5 g을 추가하고 DDH ₂ O와 함께 100 ㎖로 부피를 가지고;
   4. 8 단계에서 사용 확인 트레이, NZY 분말 8.4 g 및 아가의 6g을 추가R 1 L 플라스크 및 DDH ₂ O. 400 ML에 볼륨을 일정하게
2. 알루미늄 호일로 플라스크의 오프닝을 커버. 잘 섞어 121 ° C, 30 분 15 PSI에 그들을 압력솥.
3. 오토 클레이브에서 (아주 뜨거운!) 플라스크를 제거합니다. 조심스럽게 한천을 혼합 플라스크 소용돌이와 아가로 오스, 후 50 ° C의 물을 욕조에 넣습니다. 물 목욕은 다시 50 ° C에 도달하면, ~ 2 L 플라스크 (3.1.1 단계)에서 각 트레이 (바닥 층)에서 NZY 한천 150 ㎖를 붓는다.
4. 다음 반전과 트레이를 열고 한천은 적어도 2 시간 동안 실온에서 응고 할 수 있습니다. 뚜껑에 트레이의 바닥을 놓고, 45 (그림 3) 센터를 °와 30 분 동안 건조시켜주십시오. 용지함을 닫고 실온에서 O / N 두십시오.
5. 한편, SCS-8 E. 준비 다음날 대장균 문화. 두 개의 250 ㎖의 플라스크 중 하나 * (3.1.3 단계), 5 ㎖ NZY 국물 (표 3)을 가지고 멸균 14m로 전송L 관. 62.5 토스 / _망초 솔루션의 μL 및 SCS-8 E의 10 μl를 추가로 보충 대장균 글리세롤 주식. 250 ~ 300 rpm에서 진탕하면서 3 ~ 4 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다. 진탕 배양기 (250 ~ 300 RPM)에서 37 ° C에서, (250 ML 사이드 암 플라스크에) 문화 O / N을 NZY 국물 95 ㎖를 접종이 문화의 15 μl를 사용합니다.
   * 참고 : 다른 250 ㎖의 플라스크가 필요한 경우 (단계 4.1) 문화의 OD를 조정 나중에 사용할 수 있습니다
6. 한천 (단계 3.1.4)를 1 L 플라스크를 가지고, (이 8 단계에 필요한 ~ 50 요리에 대한 충분합니다) 60mm 요리 NZY 한천 ~ 6-7 ML을 붓는다. 한천 (~ 10 분)을 강화하려면, 다음 반전 및 플라스틱 포장. 이 요리는 한 달에 최대 4 ℃로 유지 될 수있다.

4. E. 용 트레이의 준비 대장균 / 파지 문화 (2 일)

1. SCS-8 E.의 OD를 확인 분광 광도계에 대장균 문화 (3.5 단계).NZY 국물 (표 3) (단계 3.1.3)과 0.6 OD _(600)를 조정하고 성장을 중지하고 사용 준비가 될 때까지 얼음에 유지하기 위해 얼음에 플라스크를 배치합니다. 이 단계 6.3 및 8.2에 사용됩니다. 이 문화는 4 ℃에서 5 일 동안 유지 될 수있다
2. 항공권 모든 분석 트레이를 건조 ~ 5 시간 (그림 3)에 (전날 부).

5. 게놈 DNA의 포장 (2 일, 계속)

1. 오렌지 Transpack 필요한 수를 가지고 밖으로 튜브 -80 ° C의 냉동고 및 사용을위한 준비가 될 때까지 드라이 아이스에 배치, 수행 할 각 포장 반응 한 오렌지 Transpack 관을. 적절하게 각 튜브 레이블을 지정합니다. 얼음에 준비 게놈 DNA 샘플 (단계 2.9)가있다.
2. 이 단계는 한번에 하나의 튜브를 수행해야한다. 다음 DNA 샘플로 이동하기 전에 완료 단계를 마칩니다. 빨리 한 오렌지 관 * ^{주 1} 해동 : 그것의 대부분이 해동 될 때까지 손가락을 사용하고 넣어얼음 에다가요. 해당 게놈 DNA 샘플을 즉시 오렌지 튜브 8-12 μL 샘플 * ^{주 2,3를} 전송합니다. 부드럽게 피펫 팅 아래 배를,뿐만 아니라 부드럽게 손가락으로 튜브를 눌러하여 내용을 섞는다. 믹싱 할 때 거품을 소개하지보십시오. 90 분 동안 30 ° C의 물을 욕조에 튜브를 놓습니다.
   * 주 1 : 마이크로 원심의 빠른 스핀 내벽의 모든 내용과 모자를 수집 할 필요가있다.
   * 주 2 :; 1.0 × 10 ⁶ 세포 샘플, 8 μL의 10 μL 2.0-5.0 × 10 ⁵ 세포로부터 제조 된 샘플의 11 ~ 12 μL : 추가 샘플의 부피는 그 샘플을 생성하는 데 사용되는 셀의 수에 따라 달라집니다 1.5 × 10 ⁶ 세포 샘플의.
   * 주 3 : DNA는 여전히 매우 점성이며, DNA를 꺼내 샘플 튜브의 바닥에 피펫 팁을 밀어 조심스럽게 튜브의 내부 벽에 주위에 끝을 트위스트.
3. 1 또는 2 블루 Transpack TU을BES는 -80 ° C의 냉동고를 * 추가​​로 사용할 때까지 드라이 아이스에 배치. 빨리 해동 및 오렌지 튜브에 각각 12 μl를 전송합니다. 부드럽게 피펫 팅 아래 3 배 솔루션을 섞는다. 다음 더 혼합을위한 손가락으로 튜브를 누르고 즉시 또 다른 90 분 동안 30 ° C의 물을 욕조에 제출, 2 ~ 3 초 동안 아래로 튜브를 스핀.
   * 참고 : 10-12 반응 5-6 반응과 2 블루 튜브를 사용하여 1 파란색 튜브.
4. 90 분 후, 5 초 동안 중간 속도에 대한 반응과 소용돌이를 정지 970 μL의 SM 버퍼 * (표 3) 각 반응을 희석. 추가 사용까지 얼음에 튜브를 넣어.
   *주의 : 세포 수가 ≤ 5 ^× 105 인 경우, 반응을 정지 500 μL의 SM 완충액 (표 3)을 사용하여, (동일 샘플)이 튜브 (단계 6.4) 나중에 결합 될 수있다.

6. 게놈 DNA (; 계속 일 2) 포장 도금

1. 반전 한천 t을 닫습니다아침에 건조 열렸다 광선. 각 샘플에 대한 용지함의 레이블을 지정합니다.
2. N의 16.8 ㎖에 X-gal을 4.8 g을 녹이고, N-디메틸 포름 아미드 (단계 6.5에 필요한). 즉시 저어 흔드는 플랫폼에 넣어. 빛으로부터 보호합니다. 해결 방법은 20 ~ 30 분에 명확해야한다.
3. SCS-8 E.에게 나누어지는 대장균 세포. 트레이의 각 세트의 경우 *, 한 50 ML 원뿔 튜브를 사용합니다. 포장 된 DNA 샘플의 이름으로 관 레이블을 지정합니다. E. 2 ㎖를 추가 각 용지함의 대장균 현탁액.
   * 참고 : 예를 들어 3 × 10 ⁵ GMP를 8 트레이 세트 (표 1 참조)이 필요합니다. 따라서, 두 분취, 8 × 2 = 16 트레이를 필요로합니다. 분주 각 = 16 ㎖의 8 × 2 E.으로, 두 개의 50 ㎖ 튜브를 분리하여 준비하십시오 대장균 정지.
4. SCS-8 E. 함유 적절한 50 ㎖ 튜브에 (단계 5.4) 패키지 된 DNA 시료를 1 ㎖ * 추가 대장균 나누어지는 잘 섞는다. 이 E.에게 품다 흔들리는 인큐에서 대장균 / 파지 혼합물울란바토르 (250-300 분당 회전 수), 23 분 동안 37 ° C에서.
   * 참고 : DNA가 ≤ 5 × 10 ⁵ 세포에서 추출 된 경우, SM 버퍼 500 μL는 반응 (단계 5.4)를 중지하는 데 사용되었다. 이 단계에서, 튜브는 결합 될 수 있고, 한 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 첨가.
5. 때 E. 대장균 / 파지 혼합물 상단 아가 계층에 대한 준비를 시작, 배양된다. X-걸 / N의 5 ML을 추가, 상위 레이어의 아가로 오스 솔루션의 각 800 ㎖의 플라스크에 N-디메틸 포름 아미드 용액 (6.2 단계) (단계 3.1.2에서가, 50 ° C로 유지). X-gal을 최종 농도가 1.5 ㎎ / ㎖가 될 것입니다. 아가로 오스에 추가 할 때 X-GAL 조금 침전하는 경우가 있습니다. X-GAL을 녹여 다시 50 ° C의 물을 욕조에 병을 넣어 소용돌이.
6. E. 취 인큐베이터 중 대장균 / 파지 혼합물 (6.4 단계). 각 샘플은 여러 트레이를 요구, 각 트레이는 50 ㎖ X-gal/agarose 솔루션 (단계 6.5)가 필요합니다. (즉, 50 ㎖의 X 각 샘플에 대한 X-gal/agarose의 필요한 양을 붓고트레이의 수) 큰 멸균 플라스틱 병에 적절한 E. 추가 대장균 / 파지 혼합물. 혼합하는 병을 소용돌이 친다. 50 ML 원뿔 튜브에 45 ~ 50 ㎖를 분취 량의 혼합물을 나눈다. 튜브의 수는 해당 샘플에 필요한 트레이의 수와 동일해야한다.
   참고 : 남은 X-gal/agarose 솔루션 단계 8.3에서 사용됩니다. 용액을 추가로 사용할 때까지 50 ° C의 물 중탕에 저장 될 수있다.
7. 분석 트레이의 하단에서 상단 아가로 오스의 혼합물 50 ㎖를 붓는다. 빨리 한 방향으로 약간 분석 트레이를 기울여 아가로 오스를 확산.
   참고 : 아가로 오스는 매우 빠르게 냉각되고 트레이에 분산하는 것이 불가능하게 될 것이다. 따라서이 단계는 비교적 빠르고 50 ℃로 유지 된 아가 로스로 수행 될 필요가
8. 상단 아가로 오스가 적어도 15 분 동안 강화 할 수 있습니다. 그런 다음, 반전하고 공기 건조 30 분 (그림 3)에 대한 수 있도록 분석 트레이를 엽니 다.
9. , 트레이를 닫고 15 ~ 16 시간 동안 37 ° C에서 (아래 한천 층 측 상단에) 반전 분석 트레이를 품어. 5 개 이상의 트레이를 쌓아 두지 마십시오.

7. 상상 속 돌연변이 주파수의 결정 (3 일)

1. 37 ° C의 배양기에서 트레이를 제거하고 온도가 충분히 내려가 보자. 각 트레이에 반투명 플라크 형성 단위 (PFU)를 계산, 무작위, 트레이에 2 사이트를 선택 2.5 × 2.5 cm ² 또는 5 × 5cm ^2의 사각형 *를 그리고 마킹 셀 카운터와 각 사각형의 모든 PFUs를 계산 (그림 4A, B).
   * 참고 : 그림 5와 같이 사각형을 사용에게 장치를 그립니다. 계산 PFUs의 수는 40 ≥ 경우, 그렇지 않으면 더 큰을 사용, 작은 사각형을 사용합니다.
2. 계산 사각형의 평균을 가지고 작은 사각형으로 계산하면 96를 곱하거나, 큰 하나를 계산하는 경우 (24)에 의해이 숫자를 곱합니다. PFUs의 수는 SA​​의 모든 트레이에 계산 추가나 샘플. 이것은 그 샘플에 대해 생성 PFUs의 총 수입니다.
3. 다음으로, 각 트레이에있는 돌연변이 패를 계산합니다. 트레이는 이제 돌연변이 패를 찾기 위해 도움이됩니다, 냉각있다. 또한, 블루 플라크를 탐지 용이 빨간색 및 / 또는 흰색 표면 트레이를 이동하려면, 빨간색과 흰색 종이의 시트는 잘 작동합니다. 마커 펜으로 모든 블루 플라크를 동그라미. ^{36, 37,} 각 돌연변이의 블루 컬러의 모양과 강도 (그림 4C 예를 들어 전체, 원, 부문)을 기록한다.
4. PFUs의 총 수 (단계 7.2)에 의해 돌연변이 PFUs의 수 (단계 7.3)로 나누어 각 샘플에 대한 추정 돌연변이 주파수를 결정합니다.

8. 상상 속 돌연변이 패 (일 3-5)의 검증

1. 파스퇴르 피펫, 코어 각 돌연변이 (파란색) PFU를 사용하여 250 ㎕의 멸균 SM 버퍼 (표 3)에 플러그를 전송합니다. 5 초에 클로로포름, 소용돌이의 25 μl를 추가합니다4 ° C에서 D 저장소는 다음 날 계속하거나 돌연변이 PFU 참으로 돌연변이가 있는지 확인하기 위해 다음 단계를 진행하기 전에 실온에서 2 시간 방치한다. 샘플은 1 년 이상 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. 한 1 ㎖와 연결 된 각 돌연변이에 대해 하나의 4 ML 멸균 튜브 레이블을 지정합니다. 새로운 1 ㎖ 튜브에, 한천 플러그 간단히 살균 SM 버퍼 (단계 8.1) 1시 50분 (100 μL의 SM 버퍼 (표 3)에 샘플 2 μL), 소용돌이, 따로 설정에서 발표 재현 탁 파지를 희석. 4 ML 멸균 튜브 SCS-8 E. 200 μl를 추가 대장균 (단계 4.1) 문화와 대응하는 1 ML 튜브에서 희석 된 파지의 2 μL은 5 ~ 10 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
3. 60 mm NZY 한천 접시에 섞어 부어 각 4 ML 튜브, 소용돌이 관 (단계 6.6에서 왼쪽 이상), X-gal을 포함하고있는 상위 아가로 오스의 2.5 ML을 추가 이전 (단계 3.6)을 부었다. 10 분 동안 둡니다 (하게하는 t그는 최고 아가로 오스) 응고, 접시를 반전하고 37 ℃에서 O / N을 품어
4. 다음 날 아침, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 각각의 접시에 푸른 PFUs의 비율 (그림 6)를 결정합니다. PFUs의 70 % 이상이 푸른 경우, 돌연변이 ^{(38, 39)을} 확인 간주됩니다. 핵심은 돌연변이 요리에서 플라크와 1.5 ㎖에 넣어 250 μL의 SM 버퍼 (표 3)과 25 ㎕의 클로로포름을 포함, 톱 튜브 나사, 지금 시퀀싱에 대한 준비가되어 있습니다.
5. PFU의 50 % 이하가 청색 인 경우, 그것이 진짜 돌연변이 ^38,39 간주되지 않는다. , PFU의 모양은 "전체"인 경우 순서를 진행, 블루 PFUs의 빈도가 60 % ~ 70 % 사이에있을 때, 플라크의 형태에 대한 정보에서 다시 확인.

9. LACI G 엔의 돌연변이에 대한 시퀀싱

1. 1.5 μ를 포함, 25 μL 반응 볼륨에서 PCR 반응을 설정; 플라크 상층 액 (템플릿, 단계 8.4)의 L, 앞으로 프라이머 SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3 ') 및 역방향 프라이머 SR2 (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3'). 제조업체의 지시에 따라 PCR 증량제의 Taq 폴리머 라제 키트를 사용한다. 다음과 같이 순환 조건은 다음과 같습니다 : 94 ° C 2 분 후 20 초 동안 94 ° C의 35주기, 20 초, 60 ° C, 2 분 72 ° C는 5 분 동안 72 ° C의 마지막 단계 다음에 .
2. 각 반응의 5 μL 나누어지는을 가지고 0.8 % 아가로 오스 겔에서 실행 증폭을 확인합니다.
3. 제조업체의 지시에 따라 Augencourt 정리 키트를 사용하여 PCR 반응을 정리.
4. 템플릿 DNA를 정량.
5. 시퀀싱 템플릿 DNA로 PCR 제품의 ~ 100 NG를 사용합니다. (상기 참조) 시퀀싱 프라이머와 같은 PCR 프라이머를 사용하여 양 방향으로 서열 증폭 물.
6. 시퀀스를 조립하고 mutati를 검색 할 LACI 참조 시퀀스 ^(40)와 맞 춥니 다기능.

결과

생체 내 돌연변이 분석은 드문 경우 많은 이벤트들 (돌연변이 PFUs) (모든 PFUs)를 측정한다. 세포의 소수로 분석을 수행하여, 그 결과가 상당히 긍정적 거짓 및 위음성 결과에 좌우되는 것이 가능하다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 3 가지 동물로부터 수확 된 분획 골수 세포와 일련의 희석 실험을 수행 하였다. 우리는, 1.4 × ^106, 7.0 × ^105을 사용하여 이들 동물의 골수에?...

토론

본 명세서에 기재된 생체 내 돌연변이 유발 분석은 원래 콜러 등. ^18이 모델의 lacI 리포터 유전자를 운반하는 λ 파지 벡터를 이용하여 생성 LACI 트랜스 제닉 마우스 모델에 기초한다. 벡터 전염성 파지 입자로 상대적으로 단순 복구 이후의 포장을 허용 측면에서는 두 COS 사이트, E.를 감염하는 데 사용 대장균. 블루 플라크는 파지에 감염된 E.에

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
LacI transgenic mice	BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail	Agilent Technologies (Stratagene)	720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli	Agilent Technologies (Stratagene)	200221
DNA size standards – lambda ladder	Bio Rad	170-3635
0.025 mM pore size membranes	Fisher (Millipore)	VSWP 025 00
245 mm2 bioassay dishes (trays)	Fisher (Corning)	07-200-600
NZY broth (powder)	Fisher (Teknova)	N1144
Agar	Fisher	BP1423-500
Agarose	Fisher	E-3120-500
N, N-dimethylformamide	Fisher	AC34843-5000
X-gal	Research Products Intl Corp (RPI)	B71800-10.0
Proteinase K	Roche	3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit	5 PRIME	2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit	Beckman/coulter	A63880