Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein in-vivo-Mutagenese-Assay für eine kleine Anzahl von gereinigten hämatopoetischen Zellen unter Verwendung des lacI transgenen Mausmodell. Die LacI Gen isoliert, um die Häufigkeit, Ort und Art der DNA-Mutanten entstanden spontan oder nach der Exposition zu Genotoxinen bestimmen.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren hat es sich gezeigt, dass genomische Instabilität fest mit vielen Entwicklungsstörungen, Krebs und Alterung. Da die Stammzellen für die Gewährleistung Gewebshomöostase und Reparatur des gesamten Lebens verantwortlich sind, ist es vernünftig zu vermuten, dass die Stammzellpopulation ist für die Erhaltung der genomischen Integrität der Gewebe. Deshalb hat großes Interesse an der Beurteilung der Auswirkungen von endogenen und Umweltfaktoren auf die genomischen Integrität in Stammzellen und deren Nachkommen, mit dem Ziel, die Ätiologie der Stammzellen basierte Krankheiten zu verstehen entstanden.

LacI transgenen Mäuse tragen eine erzielbare λ-Phagenvektor lacI-Reportersystems, wobei das lacI-Gen dient als Reporter-Mutation kodiert. Das Ergebnis einer mutierten lacI-Gen ist die Herstellung von β-Galactosidase spaltet ein chromogenes Substrat, Drehen blau. Die LacI Reportersystem ist durch in alle Zellen, einschließlich Stammzellen / Vorläuferzellen und können problemlos wiederhergestellt und verwendet werden, um anschließend zu infizieren E. werden coli. Nach Inkubation infizierten E. coli auf Agarose, die das richtige Substrat enthält, können Plaques erzielt werden; blaue Plaques zeigen eine Mutante LacI Gen, während klare Plaques Hafen-Wildtyp. Die Häufigkeit von blau (unter klar) Plaques zeigt die Mutationsrate in der ursprünglichen Zellpopulation wurde die DNA extrahiert aus. Sequenzierung der mutierten lacI-Gen wird die Position der Mutationen in dem Gen, und die Art der Mutation anzuzeigen.

LacI transgenen Mausmodell wird als ein in vivo-Mutagenese-Assay etabliert. Außerdem werden die Mäuse und die Reagenzien für den Assay sind im Handel erhältlich. Hier beschreiben wir detailliert, wie dieses Modell geeignet ist, die Frequenz von spontan auftretenden DNA-Mutanten in Stammzell-angereichertem Lin messen ^- IL7R ^- Sca-1 ^{+ + +} cKit (LSK) Zellen und anderen Subpopulationen des hämatopoetischen Systems.

Einleitung

In den meisten Geweben, differenzierte Zellen haben eine begrenzte Lebensdauer. Um funktionale Integrität zu erhalten, langlebig, gewebespezifische Stammzellen kontinuierlich Vorläuferzellen, die wiederum führen zu den ausdifferenzierten Zellen, die für die Funktion des jeweiligen Gewebes erforderlich. Stammzellen ihre eigene Fach durch einen Prozess namens Selbsterneuerung auch wieder aufzufüllen. So, für die Aufrechterhaltung der Funktionsfähigkeit des Gewebes, sie wohnen in. Deshalb verantwortlich sind Stammzellen, ist es unerlässlich, dass sie mit robusten Mechanismen ausgestattet, um zu erfassen und möglicherweise reparieren beschädigte DNA. Wenn nicht, können sie mehrere genomische (potentiell schädlichen) Störungen, die durch ihre Nachkommen vererbt werden können, zu erwerben. Zu verstehen, wie Stammzellen si-chern ihr Genom während der Lebensdauer eines Organismus ist eine wichtige Frage und kann uns helfen zu verstehen, warum genomische Instabilität wird mit Krebs und einigen anderen altersbedingten Krankheiten (in ^1,2 bewertet) verbunden ist.

Controlling genomischen Integrität eines Gewebes auf der Ebene von Stammzellen und frühen Vorläuferzellpopulationen entweder durch Eliminierung defekter Stamm (oder Vorläufer-) Zellen durch Zelltod, Seneszenz oder Differenzierung und / oder Reparatur effizienter erreicht werden geschädigter DNA. Jüngste Studien haben gezeigt, dass es möglich ist, bestimmte Arten von DNA-Reparatur direkt in diesen seltenen Populationen ^3-6 messen. Es wurde gefunden, daß beispielsweise in den blutbildenden Systems, Doppelstrang-DNA-Brüche können durch homologe Rekombination (HR) oder nicht-homologen Ende repariert werden (NHEJ), wobei letztere eine Reparatur des unteren Treue und damit eine erhöhte Gefahr, dass Fehler. Beide werden in hämatopoetischen Stammzellen (HSC) ^4,5 verwendet, jedoch bei Mäusen scheint es überwiegend NHEJ in der Erwägung, dass HSCs frühen Vorläuferzellen nutzen HR ^4. Eine ähnliche Beobachtung wurde für die Stammzellen in der Haut ⁶ hergestellt. Interessant ist, dass in der menschlichen Blutstammzellen HR, NHEJ nicht,scheint der Reparaturmechanismus der Wahl für die Doppelstrangbrüche ³ sein. Ob diese funktionelle Unterschied zwischen den zwei Arten ist real oder nur eine technische oder experimentellen Unterschied, bleibt abzuwarten.

Repertoire eine Stammzelle zur Reparatur beschädigter DNA ist wahrscheinlich andere DNA-Reparaturmechanismen, wie Basenexzisionsreparatur (BER), Nukleotidexzisionsreparatur (NER) und Mismatch-Reparatur (MMR) enthalten. BER und NER sind für die Reparatur von einem oder mehreren Basenpaar Läsionen in Einzelstrang-DNA verantwortlich, während MMR-Fixes Basen-Basen-Fehlpaarungen und Einfügen / Löschen Schleifen, diese Arten von DNA-Schäden kann nicht durch NHEJ oder HR repariert werden. Unterstützt wird dieser Begriff gibt mehrere Studien aus dem blutbildenden Systems, die einen Zusammenhang zwischen Veränderungen in einem dieser Wege und Anomalien in der HSC Fach ^7-9, sowie einem erhöhten Risiko der Entwicklung von myelodysplastischen Syndroms ^10-16, eine Krankheit, die im UrsprungHSC und dass mit zunehmender genomische Instabilität wie die Krankheit fort ¹⁷ zugeordnet. Bis jetzt wurden Messungen der BER, NER und MMR direkt in HSCs nicht berichtet.

Zusätzlich zur Verdeutlichung der verschiedenen Prozesse, die Gewebeintegrität in einem mechanistischen Pegel zu steuern, ist es unerlässlich, um das Ausmaß der mutierten DNA zu messen, so dass die Folgen von Aberrationen in einem dieser Verfahren kann getestet werden, z. B. in normalen gegenüber genetisch entwickelt, Stammzellen oder in alt gegen jung. Allerdings ist die Entwicklung einer entsprechenden Assay wegen des Mangels an gewebespezifische Stammzellen und das Fehlen von Kulturbedingungen, die "stemness" bewahrt schwierig. Darüber hinaus sollte ein solches Assay abänderbar, um umweltbedingte und genetische Manipulationen. Eine mögliche Lösung für diese Einschränkungen und Anforderungen ist die Verwendung von Maus-Modellen, die spezifisch entworfen sind, um DNA-Mutationen zu detektieren.

MulFach-transgene Mausmodelle für den Mutationsnachweis wurden entwickelt. Zum Beispiel LacI transgenen Mäusen ¹⁸ führen einen erzielbaren λ-Phagen-Vektor, der das LacI Reportersystem, in dem die LacI Gen kodiert für ein Suppressor der Lac-Operator und dient als Reporter Mutation kodiert. Nach Mutation des lacI-Gens, wird der lac-Operator aktiviert und β-Galaktosidase hergestellt wird. β-Galactosidase spaltet das chromogene Substrat X-Gal (5-Brom-4-chlor-e-indolyl-β-D-galactopyranosid), der es blau wird. Die cos-Stellen flankieren den LacI Vektor erlaubt die einfache Wiederherstellung von Lambda-Phagen-Proteine ​​und anschließende Infektion von E. coli. Nach Inkubation infizierten E. coli auf Agarose, die die X-gal-Substrat enthält, kann Plaques erzielt werden. Blaue Plaketten enthalten eine mutmaßliche Mutanten-Lac-I Durchführung Phagen, während klare Plaques Hafen nicht-Mutanten. Die Häufigkeit der blaue Plaques (unter the klar sind) gibt die Mutationsrate in der ursprünglichen Zellpopulation wurde die DNA extrahiert aus. Darüber hinaus kann die λ-Phagen-Hosting lacI Ziel leicht sequenziert werden unter Verwendung von PCR-Techniken für relativ hohe Durchsatzanalyse. Die Sequenzierung mehrere mutierte Gene LacI wichtige Informationen über das Mutationsspektrum, die wiederum auf mögliche Mängel in bestimmten DNA-Reparaturwegen oder auf bestimmte gentoxische Ereignisse zeigen offenbaren. LacI transgenen System über mehrere Laboratorien ¹⁹ standardisiert und die Reagenzien sind im Handel erhältlich. Ein Hauptnachteil des lacI-System ist die begrenzte Möglichkeit, große Deletionen oder Umordnungen nachzuweisen, weshalb andere Verfahren, z. B. Mehrfarben-FISH an Metaphasespreitungen müssen verwendet werden, um diesen Mangel zu ergänzen sein.

Innerhalb des λ-Phagenvektor des lacI-Mausmodell, gibt es eine viel kleinere Gen CII, Für die Mutationsanalyse zur Verfügung. Die Größe und die Tatsache, daß Mutanten können ausgewählt werden, macht dies zu einer weniger arbeitsintensiven und kostengünstiger als der Assay ²⁰ lacI-Gen-Analyse. Jedoch wird das lacI-Gen umfassender zur Mutagenese ²¹ und der Empfindlichkeit des Gen-Mutationen untersucht worden ist und dadurch, dass es eine klare Verständnis der Aminosäurereste, die eine phänotypische Reaktion auf ein chromogenes Substrat ^22-25 zu erzeugen.

Andere Maus-Modelle für den Mutationsnachweis umfassen die Verwendung der &PHgr; X174 oder das lacZ-Transgen. Die &PHgr; X174 transgenen Mausmodell, mit dem Original-A: T → G: C-Reversion-Mutationstest ²⁶ oder die Vorwärtsmutationstest ²⁷ die Erkennung von einem Spektrum von Basenpaar-Substitutionen, stellt eine weniger kostspielige System als die LacI Modells ermöglicht. Allerdings ist die Mutations Bildschirm in der Vorwärts Assay nicht trivial und die Mutation spectrum des &PHgr; X174 Transgen nicht wie die des LacI gut charakterisiert. In Maus-Modellen trägt LacZ Transgene wird die Mutations LacZ Reporter erholt Verwendung E. coli-Wirtszellen, die empfindlich auf Galaktose und Galaktose-Medium ²⁸ enthalten sind. Ein Nachteil dieses Systems ist, dass die Wiederherstellung des LacZ Ziel beinhaltet auch Restriktionsendonuklease-Verdau, gefolgt von Ligation und Elektroporation von E. coli-Wirte, wodurch es schwierig wird, das System für eine kleine Anzahl von Zellen anzupassen. Obwohl es nicht eine absolute Voraussetzung für die Arbeit mit Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen (kann man immer mit mehr Mäuse beginnen), wenn eine große Zahl von Zellen erforderlich sind (zB Millionen oder mehr) es wird schnell unpraktisch und kostspielig geworden. Auch die relativ großen Abmessungen von LacZ, während ein empfindlicher Mutations Reporter, ist umständlich und kostspielig für die DNA-Sequenzanalyse und determfung der Mutation Spektren. Ein Hauptvorteil dieses Modells ist jedoch seine Fähigkeit, große Deletionen und Insertionen zu detektieren, sowie chromosomale Rearrangements.

Da alle Zellen in lacI, &PHgr; X174 und LacZ transgenen Mausmodellen führen das Reportersystem kann jeder dieser Mausmodelle verwendet werden, um die Mutagenese in jedem Zelltyp von Interesse zu messen, einschließlich der Stamm-und Vorläuferzellen, solange sie zuverlässig entnommen werden können und in ausreichender Zahl. Weil wir umfangreiche Erfahrung mit der LacI Mausmodell und dem LacI Mutationstest, haben wir beschlossen, dieses System weiter für die Mutagenese-Analyse in hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferpopulationen zu verfolgen.

Die blutbildenden Gewebe ist gut charakterisiert hinsichtlich der Zelloberfläche Phänotyp der einzelnen Komponenten, einschließlich der langfristigen Bestandsauffüllung Stammzellen, die erkennbar der extrem seltenen Bevölkerung von Lin sind ^- IL7R ^{- Sca-1 + cKit + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - Zellen 29. . Mohrin et al 4 gezeigt, dass die Bevölkerung von etwas größer LSK/Flk2 - Zellen sind immer noch gute Vertreter für HSK und die erheblich von den primitivsten engagierte myeloischen Vorläufer (CMP) Bevölkerung, wenn es um das Studium der DNA-Reparatur kommt. Wenn darüber hinaus die HSC-angereicherten LSK (Flk-2 +-und Flk-2 -) - IL7R - Zellen wurden zum Vergleich Lin Sca-1-cKit + + (K LS-Vorläuferzellen), gab es immer noch einen signifikanten Unterschied in NHEJ Fähigkeit 5 zwischen der weniger rein, Stammzell-angereichertem LSK Bevölkerung und die Vorläuferzellen. In unserer Studie verwenden wir HSC angereicherte LSK (Flk-2 +-und Flk-2 -)-Zellen, weil wir festgestellt, dass mindestens 2 x 10 5 Zellen für konsistente, zuverlässige Ergebnisse in dieser Mutagenese-Assay erforderlich, das die Zellzahl ist äußerst schwierig,zu erhalten, wenn man die LSK/Flk2 sortiert - CD150 + CD48 Bevölkerung oder auch die LSK/Flk2 - Bevölkerung (in Form von Mäusen, Kosten und Praktikabilität). Dieses Protokoll basiert auf der ursprünglich von Kohler et 18 al. Entwickelt beschreibt im Detail, wie die spontane DNA-Mutantenfrequenz in LSK Zellen differenzierten Populationen von myeloischen Zellen sowie nicht getrennten Knochenmark und Milz-Zellen bestimmt und definiert werden.}

Protokoll

Leukozyten aus LacI transgenen Mäuse auf einer C57BL / 6 Hintergrund nicht exprimieren Sca-1 (Abbildung 1). Deshalb, wenn Sca-1 ist ein Marker für Zellreinigung verwendet wird, müssen diese Mäuse mit einer entsprechenden Belastung für Sca-1-Expression zu gewinnen gekreuzt werden, in diesem Protokoll die F1 einer Kreuzung zwischen normalen C57BL / 6 (B6) Mäuse und LacI (C57BL / 6)-transgenen Mäusen (lacI) verwendet wurde (Fig. 1). Von den Zellpopulationen in diesem Protokoll verwendet, und LSKS CMPs stellen die kleinsten Populationen im Knochenmark. Um zu reinigen, mindestens 2 x 10 je ⁵ / Art, kombinieren das Mark aus etwa zehn Mäusen bei der Ernte nur das Mark aus den Hinterbeinen oder aus mindestens vier Mäuse, wenn auch die Hip-, Front-Beine, Wirbelsäule Knochen, und Brustbein verwendet.

Machen Einzelzellsuspensionen aus dem Knochenmark und Milz. Ein kleiner Anteil des Knochenmarks wird verwendet, wie es ist, wird verwendet, um die Mehrheit purIfy LSKS und differenzierten myeloiden Vorläuferzellen, dh CMPs und Granulocyten / Monozyten-Progenitoren (GMP) durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Die Isolierung von Knochenmarkszellen und FACS-Reinigung dieser Populationen anderswo ^30-32 beschrieben. Etwa sechs unabhängige Arten sind erforderlich, um signifikante Unterschiede in der Mutationshäufigkeiten zwischen den Populationen zu identifizieren.

Das folgende Protokoll für die Messung der spontanen Mutationsrate in vivo in gereinigtem hämatopoetischen Subpopulationen aus mehreren Stratagene Bedienungsanleitungen ^33-35, basierend auf Originalarbeit von ¹⁸ Kohler et al. Angepasst Die wichtigsten Unterschiede zwischen den bestehenden Protokollen ^33-35 und dieses Protokoll bei Verwendung relativ kleine Anzahl von Zellen erforderlich ist, sind Unterschiede in Volumina von Reagenzien und die Zeiten und Temperaturen für die Proteinase K-Inkubation verwendet.

1 ist. Probenlagerung

Nach dem Sammeln der gewünschten Zellpopulationen Aliquot Zellen in 1-ml-Zentrifugenröhrchen (für die Zellzahl pro Aliquot, siehe Tabelle 1). Zentrifuge bei 266 × g für 7 min bei 4 ° C. Saugen Sie den Überstand vorsichtig. Setzen Sie die Röhrchen in flüssigem Stickstoff für 5 min und dann übertragen Sie sie auf einem -80 ° C Gefrierschrank zur weiteren Verwendung. Die Proben für mindestens 6 Monate gelagert werden.

2. Isolierung genomischer DNA

1. Nehmen Sie die Proben aus dem -80 ° C Gefrierschrank. Hinzufügen von 500 &mgr; l eiskaltem Lysepuffer DNA (Tabelle 3) in das Probenröhrchen. Vortex die Rohre für 3-5 Sekunden auf mittlerer Geschwindigkeit und legen Sie die Röhrchen auf Eis für 10 min.
2. Zentrifugieren der Röhrchen für 12 min, 4000 × g, 4 ° C Sorgfältig verwerfen ~ 450 ul des Überstands. Spin in die Röhre für 3-5 sek. Verwenden Sie eine Glaskapillare, um vorsichtig den Rest des Überstandes. Luft trocknen die Innenwände von ter Rohr, bis keine Tropfen mehr sichtbar sind (ca. 2 min).
3. Add 2 ul RNace Es Ribonuklease-Cocktail und 10 ul 1 M DTT und 100 ul der DNA-Verdauungspuffer (Tabelle 3). Einstellen der Volumina nach der Anzahl der Proben, die verarbeitet werden; pro Probe 20 &mgr; l dieser DNA-Verdauungslösung erforderlich. Nach Zugabe von 20 ul dies dem Zellpellet, versuchen, das Pellet lösen sich von der Unterseite, durch leichtes Antippen des Röhrchens mit dem Finger oder einem Stift.
   Hinweis: es schwierig sein kann, um das Pellet wegen der niedrigen Zellzahlen zu sehen.
4. In 20 ul Proteinase-K-Lösung * (Tabelle 3) zu jeder Probe, sehr vorsichtig auf Rohr wieder.
   * Anmerkung: Die Proteinase-K-Lösung sollte in einem 50 ° C-Wasserbad erwärmt, 2 Minuten vor, um das Enzym zu aktivieren verwenden.
5. Das Röhrchen sofort in einem 50 ° C Wasserbad. Digest die Probe nach den Richtlinien in Tabelle 1. Tippen Sie auf das Rohr ganz sanft alle 10 min.
   Hinweis: Bei so kleinen Anzahl von Zellen, die Temperatur des Wasserbades und die Aufschlusszeiten sind für qualitativ hochwertige genomische DNA erfolgreich Erhalt absolut entscheidend.
6. Bereiten Sie die DNA-Dialysesystem im Kühlraum (Abbildung 2). Gießen 600 ml TE-Puffer (Tabelle 3) in einem 600 ml Becherglas, einen kleinen magnetischen Rührstab, so dass der Puffer während der Dialyse gerührt werden und lassen die 0,025 mm (Porengröße) Membranen schwimmen auf der Oberfläche des Puffers. Eine Membran pro Probe; 1-4 Membranen können in einem Becherglas Dialyse verwendet werden. Machen Sie eine Markierung am Rand der Membran mit einer Schere zur Identifizierung jeder Probe.
7. Nach der entsprechenden Verdauungszeit, fügen Sie das jetzt sehr zähflüssig genomische DNA * vorsichtig in die Mitte der schwimmenden Membran (Abbildung 2). Das Becherglas sofort mit Aluminiumfolie. Dialysieren der genomischen DNA bei 4 ° C für ~ 16-20hr, rühren den Puffer sanft.
   * Hinweis: Bei der Arbeit mit viskosen DNA-Lösungen verwenden Pipettenspitzen mit einer breiten Öffnung.
8. Am nächsten Tag gießen Sie 600 ml frisch zubereitet TE-Puffer (Tabelle 3) auf ein sauberes Becherglas und übertragen die Membranen auf die neue Becherglas mit einem Löffel vorsichtig und decken das Becherglas mit Folie. Dialyse für weitere 2 Stunden.
9. Entfernen Sie die Dialysemembran aus dem Becher mit dem TE-Puffer mit einem Löffel und übertragen nur den viskosen "Klumpen" der DNA-Lösung zu einer neuen, sterilen 1-ml-Tube. Die Probe bei 4 ° C Weiterhin die Mutagenese-Assay am nächsten Tag oder bis zu 1,5 Monate später. Für den gereinigten Populationen, warten Sie mindestens 1 Woche.

3. Herstellung von Tabletts für die E. coli / Phagen-Kultur (Tag 1)

Jedes Fach wird zwei verschiedene Schichten enthalten; eine Agar-Schicht an der Unterseite und eine Agarose-Schicht an der Oberseite, die X-gal enthält. Die E.coli / Phagenlösung wird zu dieser zugegeben werden. Die Anzahl und Art von Zellen isoliert wird bestimmen, wie viele Fächer erforderlich. Informationen in Tabelle 1, die Anzahl von Schalen erforderlich und anschließende Mengen von Lösungen für diesen Teil des Protokolls zu berechnen. Im Folgenden wird zu generieren ~ 60 Böden, die eine erfahrene Person kann leicht zu verarbeiten.

1. Bereiten Sie die folgenden Medien:
   1. für die Bodenschicht, bereiten 6 x 2 L Flaschen mit jeweils 1600 ml ddH ₂ O enthält, In NZY Pulver (21 g / L) und Agar (15 g / l), gut mischen.
   2. für die Deckschicht, bereiten 4 x 1 l-Flaschen mit jeweils 800 ml ddH ₂ O enthält, In NZY Pulver (21 g / L) und Agarose (7,2 g / L), gut mischen.
   3. für die Kultivierung von E. coli, füge 2,5 g NZY Pulver jeweils 2 x 250 ml-Kolben und bringe das Volumen auf 100 ml mit ddH ₂ O;
   4. zur Bestätigung Tabletts bei Schritt 8 verwendet, fügen Sie 8,4 g NZY Pulver und 6 g agar in einen 1-l-Kolben und bringe das Volumen auf 400 ml mit ddH ₂ O.
2. Decken Sie die Öffnung der Flaschen mit Aluminiumfolie. Gut mischen und autoklavieren bei 121 ° C, 15 bar für 30 min.
3. Entfernen Sie die Flaschen (SEHR HEISS!) Aus dem Autoklaven. Vorsichtig schwenken die Flaschen, die Agar mischen und Agarose, dann legen Sie sie in einem 50 ° C Wasserbad. Wenn das Wasserbad von 50 ° C wieder erreicht, gießen aus den 2 L-Kolben (Schritt 3.1.1) ~ 150 ml NZY Agar in jedem Fach (untere Schicht).
4. Lassen Sie das Agar bei RT für mindestens 2 Stunden fest werden, dann wandeln und öffnen Sie die Fächer. Legen Sie den Boden der Schalen auf dem Deckel, 45 ° von der Mitte (Abbildung 3) und trocknen lassen für 30 min. Schließen Sie die Fächer und lassen O / N bei RT.
5. Unterdessen bereiten die SCS-8 E. coli-Kultur für den nächsten Tag. Von einem der zwei 250-ml-Kolben * (Schritt 3.1.3), nehmen 5 ml Brühe NZY (Tabelle 3) und Transfer zu einem sterilen 14 ml Röhre. Supplement mit 62,5 ul von Maltose / MgSO _4-Lösung und fügen Sie 10 ul der SCS-8 E. coli Glycerin Lager. Inkubieren bei 37 ° C für 3-4 Stunden unter Schütteln bei 250-300 UpM. Verwenden 15 ul dieser Kultur zu 95 ml NZY-Brühe bei 37 º C zu impfen (in einem 250 ml-Seitenarm-Kolben), Kultur O / N in einem Schüttelinkubator (250-300 rpm).
   * Hinweis: Die anderen 250-ml-Kolben kann später verwendet werden, um die OD der Kultur, wenn erforderlich (Schritt 4.1)
6. Nehmen Sie die 1-Liter-Kolben mit Agar (Schritt 3.1.4), und gießen ~ 6-7 ml NZY Agar in 60 mm Schalen (das reicht für ~ 50 Gerichte zum Schritt 8 erforderlich sein). Lassen Agar zu verhärten (~ 10 min), dann invertieren und wickeln in Kunststoff. Diese Gerichte können bei 4 ° C bis zu einem Monat aufbewahrt werden.

4. Herstellung von Tabletts für die E. coli / Phagen-Kultur (Tag 2)

1. Überprüfen Sie die OD der SCS-8 E. coli-Kultur (Schritt 3.5) auf dem Spektralphotometer.Stellen Sie die OD ₆₀₀ bis 0,6 mit NZY Brühe (Tabelle 3) (Schritt 3.1.3), und legen Sie die Flasche auf Eis, um das Wachstum zu stoppen und halten auf dem Eis bis zum Gebrauch. Dies wird für die Schritte 6.3 und 8.2 eingesetzt werden. Diese Kultur kann für 5 Tage bei 4 ° C aufbewahrt werden
2. Alle Air-Assay Schalen trocknen (goss den Vortag) für ca. 5 Stunden (Abbildung 3).

5. Verpackung von genomischer DNA (Tag 2, Fortsetzung)

1. Nehmen Sie die erforderliche Anzahl von Orange Trans Rohre aus dem -80 ° C Gefrierschrank und legen Sie sie auf Trockeneis bis zum Gebrauch, nehmen Sie eine Orange Transrohr für jede Verpackungsreaktion durchgeführt werden. Beschriften Sie jedes Rohr entsprechend. Haben die genomischen DNA-Proben (Schritt 2.9) bereit, auf Eis.
2. Dieser Schritt sollte ein Rohr zu dem Zeitpunkt durchgeführt werden. Beenden Sie die komplette Schritt, bevor Sie mit der nächsten DNA-Probe. Auftauen orange Rohr * ^{Anmerkung 1} schnell: mit den Fingern, bis der größte Teil davon wird aufgetaut, dann legteauf Eis. Nehmen Sie die entsprechenden genomischen DNA-Probe und sofort übertragen 8-12 ul-Probe * ^{Note 2,3} auf die orange Rohr. Mischen Sie den Inhalt durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren 3x, als auch durch leichtes Antippen des Röhrchens mit dem Finger. Versuchen Sie nicht, Blasen einzuführen beim Mischen. Das Röhrchen wird in ein 30 º C Wasserbad für 90 min.
   * Hinweis 1: eine schnelle Runde in einer Mikro kann notwendig sein, alle Inhalte von den Innenwänden und den Deckel zu sammeln.
   * Anmerkung 2: Volumen der zugegebenen Probe hängt von der Anzahl von Zellen verwendet, um das Sample zu erzeugen: 11-12 ul Proben von 2,0 bis 5,0 x 10 ⁵ Zellen präpariert, 10 &mgr; l von 1,0 × 10 ^{6-Zellen-Muster,} und 8 ul von 1,5 x 10 ⁶ Zellen-Proben.
   * Anmerkung 3: Die DNA ist immer noch sehr zähflüssig, um die DNA zu nehmen, drücken Sie die Pipettenspitze auf den Boden des Probenröhrchens und vorsichtig drehen die Spitze um gegen die Innenwand des Rohres.
3. Nehmen Sie 1 oder 2 blaue Trans tubes * die -80 ° C-Gefrierschrank und legen Sie sie auf Trockeneis bis zur weiteren Verwendung. Thaw sie schnell und über 12 ul zu jedem der Orange Röhren. Mischen Sie die Lösung durch vorsichtiges Pipettieren es nach oben und unten 3 mal. Drehen Sie das Rohr nach unten für 2-3 sec, tippen Sie dann auf das Rohr mit dem Finger für weitere Misch-und sofort wieder an die 30 ° C Wasserbad für weitere 90 min.
   * Hinweis: Verwenden Sie ein blaue Röhre für 5-6 Reaktionen und 2 blaue Rohre für 10-12 Reaktionen.
4. Nach 90 min, verdünnen jede Reaktion mit 970 ul SM-Puffer * (Tabelle 3), um die Reaktion und Wirbel auf mittlerer Geschwindigkeit für 5 Sekunden stoppen. Setzen Röhrchen auf Eis bis zur weiteren Verwendung.
   * Hinweis: Wenn die Anzahl der Zellen ist ≤ 5 x 10 ^5, verwendet 500 &mgr; l SM-Puffer (Tabelle 3), um die Reaktion zu stoppen; 2 Röhren (der gleichen Probe) kann dann später (Schritt 6.4) kombiniert werden.

6. Galvanik Verpackt Genomische DNA (Tag 2, Fortsetzung)

1. Schließen Sie den umgekehrten Agar tStrahlen, die zum Trocknen in den Morgen geöffnet wurden. Beschriften Sie die Fächer für jede Probe.
2. Man löst 4,8 g X-Gal in 16,8 ml N, N-Dimethylformamid (für Schritt 6.5 erforderlich). Rühren Sie sofort und legte auf einem Schüttler-Plattform. Schutz vor Licht. Lösung sollte in 20-30 Minuten klar sein.
3. Aliquoter Teil, der SCS-8 E. coli-Zellen. Für jede Gruppe von Schalen * Verwenden Sie eine 50 ml konischen Röhrchen. Das Röhrchen mit dem Namen der verpackten DNA-Probe. 2 ml E. coli-Suspension für jedes Fach.
   * Hinweis: Zum Beispiel 3 x 10 ⁵ GVP erfordert eine Reihe von 8 Böden (siehe Tabelle 1). Somit werden zwei Aliquote, erfordern 8 x 2 = 16 Böden. Halten Sie die Teilmengen zu trennen und so bereiten zwei 50-ml-Röhrchen mit je 8 x 2 = 16 ml E. coli-Suspension.
4. Fügen Sie die 1 ml * von verpackten DNA-Probe (aus Schritt 5.4) in die entsprechende 50-ml-Röhrchen mit dem SCS-8 E. coli aliquoten und gut mischen. Inkubieren diesem E. coli / Phagen-Gemisch in einem Schütteln incuBator (250-300 rpm) bei 37 ° C für 23 min.
   * Hinweis: Die DNA wurde von ≤ 5 x 10 ⁵ Zellen extrahiert wurden 500 ul SM-Puffer verwendet, um die Reaktion (Schritt 5,4) zu stoppen. Bei diesem Schritt können die Röhrchen vereinigt und auf einem 50 ml konischen Röhrchen zugegeben werden.
5. Wenn das E. coli / Phagen-Gemisch inkubiert, beginnen die Vorbereitungen für die Top-Agarose-Schicht. 5 ml X-gal / N, N-Dimethylformamid-Lösung (Schritt 6.2), um pro 800 ml-Kolben, der Deckschicht Agarose-Lösung (aus Schritt 3.1.2; bei 50 ° C gehalten). Endkonzentration von X-gal wird 1,5 mg / ml. Die X-Gal vielleicht ein wenig zu fällen, wenn sie der Agarose aufgenommen. Wirbel um die X-gal zu lösen und stellte die Flasche zurück in den 50 ° C warmen Wasserbad.
6. Nehmen Sie die E. coli / Phagen-Gemisch aus dem Brutschrank (Schritt 6.4). Jede Probe erfordert mehrere Fächer, jedes Fach, erfordert 50 ml X-gal/agarose Lösung (Schritt 6.5). Gießen Sie das erforderliche Volumen der X-gal/agarose für jede Probe (dh 50 ml xAnzahl der Böden) in einem größeren sterilen Plastikflasche und fügen Sie die entsprechende E. coli / Phagen-Gemisch. Schwenken Sie die Flasche zu mischen. Teilen Sie die Mischung in Aliquots von 45-50 ml in 50 ml konischen Röhrchen. Die Anzahl der Rohre sollte die gleiche wie die Anzahl der Fächer für die Probe erforderlich ist.
   Hinweis: Die übrig gebliebenen X-gal/agarose Lösung wird in Schritt 8.3 verwendet werden. Die Lösung kann in einem 50 ° C Wasserbad bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.
7. Gießen Sie die 50 ml Top-Agarose-Gemisch in der unteren Hälfte des Assays Fach. Verbreitete sich schnell die Agarose durch Kippen des Testmagazin leicht in eine Richtung.
   Hinweis: Die Agarose wird sehr schnell abkühlen und wird es unmöglich, über den Boden verteilt. Daher muss dieser Schritt relativ schnell und mit Agarose, die bei 50 ° C gehalten wurde, durchgeführt werden
8. Ermöglichen die Top-Agarose für mindestens 15 min zu härten. Dann umdrehen und öffnen Sie die Assay-Schalen, um sie an der Luft trocknen für 30 min (Abbildung 3) zu lassen.
9. Schließen Sie die Fächer, Inkubation der Testschalen umgekehrt (unten Agar Schichtseite nach oben) bei 37 ° C für 15-16 Std. Stapeln Sie nicht mehr als 5 Fächer.

7. Die Bestimmung einer mutmaßlichen Mutant Frequenz (Tag 3)

1. Entfernen Sie die Schalen von der 37 ° C-Inkubator und lassen Sie sie abkühlen. Zählen Sie die schein Plaque-bildenden Einheiten (PFU) auf jedem Boden, zufällig auswählen 2 Seiten auf den Böden, zeichnen Sie ein Quadrat * von 2,5 x 2,5 cm ² oder 5 x 5 cm ² und zählen Sie die PFUs in jedem Quadrat mit einer Markierung Zellzähler (4A, B).
   * Hinweis: Zu zeichnen ist das Quadrat Verwendung einer Vorrichtung, wie in Abbildung 5 dargestellt. Wenn die Anzahl der gezählten PFUs ≥ 40 ist, verwenden Sie den kleineren Platz, ansonsten verwenden Sie die größere.
2. Der Mittelwert der Quadrate gezählt und multiplizieren mit 96 zu zählen, wenn mit einem kleineren Quadrat, oder multiplizieren Sie diese Zahl mit 24, wenn Zählung mit der großen. Fügen Sie die Anzahl der gezählten PFUs für alle Fächer von der samich probieren. Dies ist die Gesamtzahl der PFU für diese Probe erzeugt.
3. Weiter zählen die mutierten Plaques in jedem Fach. Die Schalen haben nun abgekühlt, die dabei helfen, die mutierten Plaques finden wird. Um weiter zu erleichtern das Auffinden des blauen Plaques, bewegen Sie das Tablett über einen roten und / oder weißen Oberfläche, Blätter von roten und weißen Papier gut funktionieren. Kreisen Sie jede blaue Plakette mit einem Marker-Stift. Nehmen Sie die Form und die Intensität der blauen Farbe der jede Mutante (zB Voll-, Kreis-, Sektor-, 4C) ^36,37.
4. Bestimmung der mutmaßlichen Mutationsrate für jede Probe durch Dividieren der Anzahl der Mutanten PFU (Schritt 7.3) von der Gesamtzahl der PFU (Schritt 7.2).

8. Überprüfung der mutmaßlichen Mutant Plaques (Tag 3-5)

1. Mit einer Pasteurpipette Kern jeder Mutante (blau) PFU und übertragen Sie den Stecker in 250 ul sterilem SM-Puffer (Tabelle 3). In 25 ul Chloroform, Vortex für 5 Sekunden eind bei 4 ° C bis am nächsten Tag fortzusetzen oder für 2 h bei RT, bevor Sie mit dem nächsten Schritt, um sicherzustellen, dass die Mutante PFU ist in der Tat eine Mutante. Die Proben können bei 4 ° C für mindestens 1 Jahr gelagert werden.
2. Beschriften Sie ein 1 ml und 4 ml einer sterilen Röhrchen für jede Mutante, die eingesteckt wurde. In der neuen 1-ml-Tube, verdünnen das resuspendiert Phagen aus dem Agar-Stecker (Schritt 8.1) 01.50 Uhr in sterilen SM-Puffer (2 ul Probe in 100 ul SM-Puffer (Tabelle 3)), Vortex kurz beiseite veröffentlicht. Zu den 4 ml sterilen Röhrchen mit 200 ul SCS-8 E. coli-Kultur (aus Stufe 4.1) und 2 ul der verdünnten Phagen aus der entsprechenden 1-ml-Röhrchen, bei 37 ° C für 5-10 min.
3. Fügen Sie 2,5 ml der Top-Agarose, die X-gal (links-ab Schritt 6.6) zu je 4 ml Tube, Wirbelrohr zu mischen und auf eine 60-mm-NZY Agar-Platte gießen zuvor gegossen (Schritt 3.6). Lassen Sie für 10 min (zu lassen ter Top-Agarose erstarren), invertieren die Schüssel und Inkubation O / N bei 37 ° C
4. Am nächsten Morgen wird die Schale aus dem Inkubator und bestimmen den Blauanteil PFUs auf jeder Schale (Abbildung 6). Wenn 70% oder mehr der PFUs blau sind, wird eine Mutante als bestätigt, ^38,39. Kern die Mutante Plaque von der Schale und in ein 1,5 ml-schrauben Oberrohr, mit 250 ul SM-Puffer (Tabelle 3) und 25 ul Chloroform, es ist jetzt bereit für die Sequenzierung.
5. Wenn 50% oder weniger der PFU ist blau, ist es nicht als eine echte Mutante ^38,39. Wenn die Frequenz der blauen PFUs liegt zwischen 60-70%, prüfen Sie mit zurück in den Erläuterungen über die Form der Plaque, wenn die Form der PFU war "voll", fahren Sie mit Sequenzierung.

9. Sequenzierung für Mutationen im LacI G ene

1. Richten Sie PCR-Reaktionen in einem 25 ul Reaktionsvolumen, einschließlich 1,5 μ, L Überstand von Plaque (Schablone, Schritt 8.4), der Vorwärtsprimer SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3 ') und der reverse Primer SR2 (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3'). Verwenden der PCR-Verlängerungs Taq-Polymerase-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Die Zyklusbedingungen sind wie folgt: 94 ° C für 2 min, dann 35 Zyklen von 94 ° C für 20 sec, 60 ° C für 20 sec, 72 ° C für 2 min, mit einem abschließenden Schritt von 72 ° C für 5 min, gefolgt .
2. Nehmen Sie ein 5 ul Aliquot jeder Reaktion und auf einem 0,8% Agarose-Gel laufen gelassen, um eine Verstärkung zu bestätigen.
3. Bereinigen Sie die PCR-Reaktionen mit den Aufräumarbeiten Augencourt Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
4. Quantifizieren Template-DNA.
5. Verwenden Sie ~ 100 ng PCR-Produkt als Template-DNA für die Sequenzierung. Sequenz Amplikons in beiden Richtungen unter Verwendung der gleichen PCR-Primer wie Sequenzierprimer (siehe oben).
6. Montieren Sequenzen und richten mit der Referenzsequenz LacI ⁴⁰ bis Mutati erkennenons.

Ergebnisse

Die in vivo-Mutagenese-Assay misst eine seltene Ereignis (Mutante PFUs) unter vielen Ereignissen (alle PFUs). Durch Durchführen des Assays mit einer kleinen Anzahl von Zellen ist es möglich, dass das Ergebnis erheblich falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse beeinflusst. Um dieses Problem zu adressieren wir führten eine serielle Verdünnungsexperiment mit unfraktioniertem Knochenmarkzellen, aus drei verschiedenen Tieren geerntet. Wir maßen die Mutationsrate in dem Knochenmark der Tiere mit 1,4 ...

Diskussion

Die hierin beschriebenen in-vivo-Mutagenese-Assay basiert auf der ursprünglich von ¹⁸ Dieses Modell verwendet einen λ-Phagenvektor, der eine lac-Reportergens Kohler et al. Erzeugt LacI transgenen Mausmodell. Die beiden cos-Stellen flankieren die Vektor ermöglichen eine relativ einfache Rückgewinnung und anschließende Verpackung in infektiöse Phagenpartikel, verwendet, um E. infizieren coli. Eine blaue Plakette wird durch Phagen-infizierten <...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
LacI transgenic mice	BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail	Agilent Technologies (Stratagene)	720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli	Agilent Technologies (Stratagene)	200221
DNA size standards – lambda ladder	Bio Rad	170-3635
0.025 mM pore size membranes	Fisher (Millipore)	VSWP 025 00
245 mm2 bioassay dishes (trays)	Fisher (Corning)	07-200-600
NZY broth (powder)	Fisher (Teknova)	N1144
Agar	Fisher	BP1423-500
Agarose	Fisher	E-3120-500
N, N-dimethylformamide	Fisher	AC34843-5000
X-gal	Research Products Intl Corp (RPI)	B71800-10.0
Proteinase K	Roche	3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit	5 PRIME	2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit	Beckman/coulter	A63880