זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

Summary

כאן אנו מתארים in vivo assay mutagenesis למספר קטן של תאי hematopoietic מטוהרים באמצעות מודל עכבר המהונדס לאצי. גן האצים יכול להיות מבודד כדי לקבוע את התדירות, מיקום והסוג של מוטציות DNA באופן ספונטני קם או לאחר החשיפה לgenotoxins.

Abstract

בשנים האחרונות, זה הפך להיות ברור כי חוסר יציבות גנומית קשור בחוזקה רבות הפרעות התפתחותיות, סרטן והזדקנות. בהתחשב בעובדה שתאי גזע אחראים להבטיח הומאוסטזיס רקמות ותיקון לאורך כל חיים, סביר לשער שהאוכלוסייה בתאי גזע הוא קריטית לשמירה על שלמות גנטית של רקמות. לכן, עניין משמעותי שקם בהערכת ההשפעה של גורמים במשק וסביבתי על שלמות הגנום בתאי גזע וצאצאיהם, במטרה להבין את האטיולוגיה של מחלות בתאי גזע מבוססות.

עכברים הטרנסגניים לאצי לשאת וקטור הפאג λ ההשבה קידוד מערכת הכתב לאצי, שבו הגן לאצי משמש ככתב המוטציה. התוצאה של גן שעבר מוטציה לאצי היא הייצור של β-galactosidase המסלק את מצע chromogenic, הפיכתו הכחולה. מערכת כתב האצים היא נשאתיn כל התאים, כולל תאי גזע / אב והוא יכול בקלות להיות התאושש ונהג להדביק לאחר מכן א ' coli. לאחר דוגרים ה נגועה coli על agarose המכיל את המצע הנכון, יכול להיות הבקיע הפלאק; שלטים כחולים מצביעים על גן שעבר מוטציה לאצי, ואילו הפלאק ברור נמל wild-type. התדירות של כחול (בין ברור) הפלאק מציינת את תדירות המוטציה באוכלוסיית התא המקורית את ה-DNA היה שחולצה מן. רצף הגן לאצי המוטציה יציג את מיקומם של המוטציות בגן והסוג של מוטציה.

מודל העכבר המהונדס האצים הוא מבוסס היטב כin vivo assay mutagenesis. יתר על כן, העכברים וריאגנטים עבור assay זמינים מסחרי. כאן אנו מתארים בפירוט כיצד מודל זה ניתן להתאים למדוד את תדירות מוטציות DNA מתרחש באופן ספונטני בלין המועשר בתאי גזע ^- IL7R ^- SCA-1 ⁺ cKit ^{+ +} (LSתאי K) ואוכלוסיות אחרות של מערכת hematopoietic.

Introduction

ברוב הרקמות, תאים מובחנים תוחלת חיים מוגבלת. כדי לשמור על שלמות פונקציונלית, תאי גזע חיים ארוכים, רקמות ספציפיות ברציפות לייצר תאי אב שבתורו להצמיח תאים המובחנים באופן מלא הנדרשים לתפקוד של רקמה מסוימת. תאי גזע גם לחדש את התא שלהם באמצעות תהליך הנקרא התחדשות עצמית. לכן, תאי גזע אחראים לשמירה על השלמות הפונקציונלית של הרקמה שהם מתגוררים בי לכן, זוהי חובתו הם מצוידים במנגנונים חזקים כדי לחוש ואפשרות לתקן דנ"א פגום. אם לא, הם עשויים לרכוש הפרעות מרובות גנומית (מזיקים), אשר ניתן בירושה לצאצאיהם. הבנה כיצד תאי גזע בטוחים לשמור על הגנום שלהם במהלך תוחלת החיים של האורגניזם היא שאלה חשובה ועשויה לסייע לנו להבין מדוע חוסר יציבות גנומית מקושרת עם סרטן ומחלות אחרות הקשורות לגיל (הנסקרת ב ^1,2).

ass = "jove_content"> שליטה שלמות גנטית של רקמות ברמה של תאי גזע או אוכלוסיות תאים ובתאים מוקדם יכול להיות מושגת על ידי ביטול או גזע פגום (או אב) תאים באמצעות מוות של תאים, הזדקנות או בידול, ו / או על ידי תיקון יעיל ה-DNA של ניזוק. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי ניתן למדוד סוגים מסוימים של תיקון דנ"א ישירות באוכלוסיות נדירות אלה ^3-6. נמצא כי, למשל במערכת הדם, ניתן לתיקון הפסקות הדנ"א כפול גדיל ידי רקומבינציה הומולוגית (HR) או שאינו הומולוגיים סוף להצטרף (NHEJ), האחרון להיות תהליך תיקון של נאמנות נמוכה יותר ובכך הסיכון מוגבר לביצוע שגיאות. שניהם מנוצלים בתאי גזע hematopoietic (HSCs) ^4,5, לעומת זאת, בעכברים שזה נראה זה בעיקר NHEJ בHSCs ואילו תאי אבות מוקדם לנצל משאבי אנוש ^4. תצפית דומה נעשתה לתאי גזע בעור ^6. מעניין לציין, כי בבני HSCs משאבי אנוש, לא NHEJ,נראה שמנגנון התיקון של בחירה עבור הפסקות גדיל כפולות ^3. אם הבדל פונקציונלי בין שני המינים הוא אמיתי או רק מייצג את הבדל טכנולוגי או ניסיוני נותר לראות.

הרפרטואר של תאי גזע כדי לתקן דנ"א פגום צפוי לכלול מנגנוני תיקון DNA אחרים, כגון תיקון כריתת בסיס (BER), תיקון כריתת נוקלאוטיד (נר) ותיקון אי התאמה (MMR). BER והנר אחראים לתיקון נגעי זוג בסיס יחיד או מרובים ב-DNA חד גדילים, ואילו חוסר התאמה תיקוני MMR בסיס בסיס ולולאות הכנסה / מחיקה, אלו סוגים של נזק לדנ"א לא ניתן לתיקון על ידי NHEJ או משאבי אנוש. תמיכה ברעיון זה כמה מחקרים ממערכת hematopoietic הוכחת קשר בין שינויים באחד מהמסלולים האלה וליקויים בתא HSC ^7-9, כמו גם סיכון מוגבר לפתח תסמונת myelodysplastic ^10-16, מחלה שמקורה בHSC וכי הוא קשור עם עלייה בחוסר יציבות גנומית ככל שהמחלה מתקדמת ^17. כמו של עוד, מדידות של BER, נר, וMMR ישירות בHSCs לא דווחו.

בנוסף להבהרת התהליכים השונים השולטים בשלמות רקמות ברמה המכניסטית, זה הכרחי כדי שתוכל למדוד את המידה של ה-DNA שעבר מוטציה, כך שההשלכות של סטיות באחד מהתהליכים אלה ניתן לבדוק, למשל ברגילים לעומת גנטי תאי גזע מהונדסים או בישן מול צעיר. עם זאת, הפיתוח של assay רלוונטי הוא קשה בגלל המחסור בתאי גזע רקמות ספציפיות וחוסר תנאי תרבות המשמר את "stemness". יתר על כן, assay כזה צריך להיות amendable למניפולציות סביבתיות וגנטיות. פתרון אפשרי למגבלות ולדרישות הללו הוא השימוש במודלים של עכברים שהונדסו במיוחד כדי לזהות מוטציות בדנ"א.

מולמודלים עכבר מהונדסים טייפל לזיהוי מוטציה פותחו. לדוגמא, עכברים הטרנסגניים לאצי ¹⁸ לשאת וקטור הפאג λ ההשבה קידוד מערכת כתב לאצי, שבו גן מקודד לאצי מדכא של המפעיל לאק ומשמש ככתב המוטציה. עם המוטציה של הגן לאצי, מפעיל Lac מופעל וβ-galactosidase מיוצר. דבק β-galactosidase X-gal chromogenic המצע (5-bromo-4-כלורו-e-indolyl-β-D-galactopyranoside), שהופך אותו כחול. Cos אתרי איגוף וקטור האצים מאפשר התאוששות קלה על ידי חלבוני הפאג מבדה והזיהום הבא של א ' coli. לאחר דוגרים ה נגועה coli על agarose המכיל את מצע X-gal, יכול להיות הבקיע הפלאק. שלטים כחולים מכילים מוטציה המשוערת לאק, אני נושא הפאג, ואילו הפלאק ברור נמל שאינם מוטציות. התדר של שלטים כחולים (בין הדואר ברור אלה) מציין את תדירות המוטציה באוכלוסיית התא המקורית את ה-DNA שמופקת. יתר על כן, הפאג λ אירוח יעד האצים יכול להיות רצף בקלות באמצעות טכניקות PCR לניתוח תפוקה גבוהה יחסית. רצף הגנים של אצי מוטציה מרובים יחשוף מידע חשוב על ספקטרום המוטציה, אשר בתורו עשוי להצביע על ליקויים אפשריים במסלולי תיקון DNA ספציפיים או לאירועי genotoxic ספציפיים. המערכת המהונדס האצים כבר טופל בכל מעבדות מרובות ¹⁹ והחומרים הכימיים זמינים באופן מסחרי. חסרון עיקרי אחד של המערכת לאצי הוא היכולת המוגבלת לגילוי מחיקות או שחלופים גדולים, ולכן, בשיטות אחרות, כגון דגי צבע רב על מרווחי metaphase צריכים לשמש כדי להחמיא מחסור זה.

בתוך וקטור הפאג λ של מודל עכבר לאצי, יש גן קטן בהרבה, כת"ש, זמין עבור ניתוח מוטציה. הגודל שלה והעובדה שניתן לבחור מוטציות שעושים את זה assay עתיר עבודה וזולה פחות ²⁰ מהניתוח הגנטי לאצי. עם זאת, את הגן לאצי הוא למד באופן נרחב יותר לmutagenesis ²¹ והרגישות של הגן למוטציות כבר מאופיין היטב, כך שיש הבנה ברורה של שאריות חומצת אמינו שיוצרות תגובת פנוטיפי על מצע chromogenic ^22-25.

דגמי עכבר אחרים לזיהוי מוטציה לכלול את השימוש של ΦX174 או transgenes LacZ. מודל ΦX174 המהונדס העכבר, עם המקורי: T → G: מוטציה חזרה C assay ²⁶ או assay המוטציה קדימה ²⁷ המאפשר זיהוי של ספקטרום של החלפות זוג בסיס, מייצג מערכת פחות יקרה מאשר המודל לאצי. עם זאת, מסך מוטאציות בassay קדימה אינו טריוויאלי ומפרט המוטציהמוסטרום של transgene ΦX174 לא כמאופיין היטב כמו זה של לאצי. במודלים של עכברים שנשאו transgenes LacZ, כתב מוטאציות LacZ הוא התאושש ניצול E. תאי מארח coli שרגישים לגלקטוז ובינוני המכיל גלקטוז ^28. חסרון של שיטה זו הוא שהתאוששות של יעד LacZ כרוך גם עיכול endonuclease הגבלה ואחרי קשירה וelectroporation של א ' coli מארח, ובכך הופך אותו קשה להתאים את המערכת למספר קטן של תאים. למרות זאת הוא לא דרישה מוחלטת לעבודה עם אוכלוסיות תאי גזע / אב (תמיד אפשר להתחיל עם יותר עכברים), אם מספר גדול של תאים נדרשים (לדוגמא במיליונים או יותר) זה יהיה לא מעשי ועלות אוסרני במהירות. כמו כן, הגודל גדול יחסית של LacZ, תוך מתן כתב מוטאציות רגיש, הוא מסורבל ויקר יותר לניתוח רצף ה-DNA וdetermination של ספקטרום מוטציה. יתרון עיקרי של מודל זה לעומת זאת, הוא יכולתה לזהות מחיקות והוספות גדולות, כמו גם שחלופים בכרומוזומים.

מכיוון שכל התאים במודלי העכבר מהונדסים לאצי, ΦX174 וLacZ לשאת את המערכת העיתונאית, כל אחד ממודלים של עכברים אלה יכול לשמש למדידת mutagenesis בכל סוג תא של עניין, כולל בתאי גזע ואב, כל עוד הם יכולים להיות שנקטפו באופן מהימן ובכמות מספקת. כי היו לנו ניסיון רב עם מודל עכבר לאצי וassay המוטציה לאצי, החלטנו להמשיך את המערכת הזו עוד יותר לניתוח mutagenesis בגזע hematopoietic ואוכלוסיות אב.

רקמות hematopoietic היא מאופיינות היטב במונחים של הפנוטיפ של הרכיבים הבודדים שלה, כוללים בתאי גזע repopulating לטווח ארוך, אשר ניתנים לזיהוי כאוכלוסייה נדירה ביותר של לין פני תא ^- IL7R ^{- SCA-1 + cKit + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - תאי 29. . Mohrin אח' 4 הראו כי האוכלוסייה הגדולה במעט של LSK/Flk2 - תאים הם עדיין נציגים טובים לHSCs ושונה באופן משמעותי מהאב מיאלואידית מחויב הפרימיטיבי ביותר אוכלוסייה (CMP) כשזה מגיע ללימוד תיקון DNA. יתר על כן, כאשר LSK המועשר-HSC (flk-2 + וflk-2 -) תאים הושוו ללין - IL7R - SCA-1-cKit + + (תאי אב LS-K), יש עדיין היה הבדל משמעותי ב יכולת NHEJ 5 בין פחות טהור, גזע אוכלוסיית LSK המועשר בתאים ותאי האב. במחקר שלנו אנו משתמשים HSC מועשר LSK (flk-2 + וflk-2 -) תאים כי מצאנו כי לפחות 2 x 10 5 תאים נדרשים לתוצאות עקביות, אמינות בassay mutagenesis זה; מספר תא זה קשה מאודלהשיג כאשר אחד ממיין את LSK/Flk2 - אוכלוסיית CD150 + CD48 או אפילו LSK/Flk2 - האוכלוסייה (במונחים של עכברים, עלויות ומעשיות). פרוטוקול זה, המבוסס על אחד שפותח במקור על ידי קולר et al. 18 מתאר בפירוט כיצד תדירות המוטציה הספונטנית DNA ניתן לקבוע בתאי LSK והוגדרה אוכלוסיות של תאי מיאלואידית מובחנים, כמו גם תאי מח עצם unseparated וטחול.}

Protocol

כדוריות דם לבנות מעכברים הטרנסגניים לאצי על רקע C57BL / 6 אינם מבטאים SCA-1 (איור 1). לכן, אם SCA-1 הוא סמן המשמש לטיהור תא, עכברים אלה צריכים להיות חצו עם זן מתאים כדי לקבל ביטוי SCA-1; בפרוטוקול זה F1 של הכלאה בין עכברי C57BL / 6 הרגילים (B6) ואצים (C57BL / 6) עכברים הטרנסגניים (לאצי) שימשו (איור 1). של אוכלוסיות התאים בשימוש בפרוטוקול זה, LSKs וCMPs לייצג את האוכלוסיות הקטנות ביותר במח העצם. כדי לטהר לפחות 2 x 10 ⁵ של כל אחד / מיון, לשלב את מח מכעשרה עכברים כאשר קצירת מח מרק הרגלים האחוריים או מלפחות ארבעה עכברים כאשר גם היפ, מול רגליים, עצמות עמוד השדרה, ומשמשים עצם החזה.

הפוך השעיות תא בודדות ממח עצם וטחול. חלק קטן של מח העצם משמש כפי שהוא, הרוב משמש לPUR ify LSKs ובתאי מיאלואידית מובחנים, כלומר CMPs וgranulocytic / אבות monocytic (GMPs) על ידי תא הקרינה המופעל מיון (FACS). הבידוד של תאי מח העצם וFACS טיהור של אוכלוסיות אלו מתוארים במקומות אחרים ^30-32. כשישה מיני עצמאיים נדרשים לזהות הבדלים משמעותיים בתדרי מוטציה בין אוכלוסיות.

הפרוטוקול למדידת in vivo תדירות המוטציה הספונטנית בתת אוכלוסיות hematopoietic מטוהרים הבא מותאם כמה מדריכי Stratagene הוראת ^33-35, המבוססים על יצירה מקורית מהקולר ואח'. ¹⁸ הבדלים הקריטיים ביותר בין הפרוטוקולים הקיימים ^33-35 ופרוטוקול זה , הנדרש בעת שימוש במספר קטן יחסית של תאים, כוללים הבדלים בכמויות של חומרים כימיים וזמנים וטמפרטורות המשמשות לדגירת K proteinase.

> 1. אחסון מדגם

לאחר איסוף אוכלוסיות תאים, תאי aliquot הרצויים בצינורות צנטריפוגה 1 מ"ל (לתא מספר לaliquot, ראה טבלה 1). צנטריפוגה ב266 XG במשך 7 דק ', ב 4 ° C. לשאוב supernatant בזהירות. שים את הצינורות לתוך חנקן נוזלי למשך 5 דקות ולאחר מכן להעבירם ל-80 ° C במקפיא לשימוש נוסף. הדגימות יכולות להיות מאוחסנות במשך לפחות 6 חודשים.

2. בידוד של הדנ"א הגנומי

1. קח דוגמאות מ-80 ° C במקפיא. הוסף 500 μl של חיץ קר כקרח תמוגה DNA (לוח 3) לצינור המדגם. ורטקס הצינורות ל3-5 שניות במהירות בינונית ומניחים את הצינורות על קרח דק 10.
2. צנטריפוגה הצינורות במשך דקות 12, 4,000 XG, 4 ° C. להשליך בזהירות ~ 450 μl של supernatant. ספין למטה את הצינור ל3-5 שניות. השתמש בצינור נימי זכוכית כדי להסיר את שארית supernatant בזהירות. אוויר יבש הקירות הפנימיים של tהוא הצינור עד שלא טיפות גלויות יותר (~ 2 דקות).
3. הוסף 2 μl של קוקטייל ribonuclease RNace-זה ו10 μl של 1 M DTT למאגר ה-DNA העיכול (לוח 3) 100 μl. התאם את הכמויות בהתאם למספר הדגימות שתעובדנה; 20 μl של פתרון עיכול ה-DNA זה נדרש לדגימה. לאחר הוספת 20 μl של זה לתא גלולה, מנסה להפוך את גלולה לנתק את עצמו מהתחתית, בעדינות על ידי הקשה על הצינור עם אצבע או עט.
   הערה: ייתכן שיהיה קשה לראות את הכדור בגלל מספרי תא נמוכים.
4. הוספה * 20 μl K proteinase פתרון (לוח 3) לכל דגימה, מאוד לטפוח בעדינות צינור שוב.
   * הערה: פתרון K proteinase יש לחמם באמבט מים 50 מעלות צלזיוס, 2 דקות לפני השימוש כדי להפעיל את האנזים.
5. מניחים את הצינור מייד באמבט מים C ° 50. לעכל את המדגם על פי ההנחיות ב טבלת 1. לחץ על הצינור בעדינות רבה כל 10 דקות.
   שים לב: עם מספרים כה קטנים של תאים, את הטמפרטורה של המים באמבטיה ופעמי העיכול הן בהחלט קריטיות לקבלת הדנ"א הגנומי באיכות גבוהה בהצלחה.
6. הכן את מערכת הדיאליזה DNA בחדר הקר (איור 2). יוצקים 600 חיץ מיליליטר TE (לוח 3) לתוך כוס זכוכית מיליליטר 600, להוסיף סרגל מערבבים מגנטי קטן, כך שהמאגר יכול להיות עורר במהלך דיאליזה ולתת את הקרומים (0.025 מ"מ נקבובית גודל) לצוף על פני השטח של המאגר. קרום אחד לדגימה; 1-4 ממברנות ניתן להשתמש בכוס דיאליזה אחת. להטביע את חותמו בשולי הקרום עם מספריים לזיהוי של כל דגימה.
7. לאחר זמן העיכול המתאים, להוסיף את ה-DNA החברה צמיגה מאוד הגנומי * בזהירות למרכז של הקרום הצף (איור 2). כסה את הכוס מייד ברדיד אלומיניום. Dialyze הדנ"א הגנומי על 4 מעלות צלזיוס במשך ~ 16-20שעה, מערבבים החיץ בעדינות.
   * הערה: בעת עבודה עם פתרונות DNA צמיג, השתמש טיפים פיפטה עם פתח רחב.
8. למחרת שופכים 600 מיליליטר של חיץ מוכן טרי TE (לוח 3) לכוס זכוכית נקייה ולהעביר את ממברנות לכוס החדשה עם כפית בזהירות רבה, ולכסות את הכוס בנייר כסף. Dialyze לעוד 2 שעות.
9. להסיר את קרום הדיאליזה מהכוס עם TE החיץ בעזרת כף ולהעביר רק את "גוש" צמיג ביותר של פתרון ה-DNA לצינור מיליליטר 1 חדש, סטרילי. חנות המדגם ב 4 ° C. המשך assay mutagenesis למחרת או עד 1.5 חודשים מאוחר יותר. לאוכלוסיות המטוהרים, לחכות לפחות שבוע 1.

3. הכנת מגשים לE. coli / הפאג תרבות (יום 1)

כל מגש יכיל שתי שכבות שונות; שכבה אגר בתחתית ושכבת agarose בחלק העליון שמכיל X-gal. E.פתרון coli / הפאג יתווסף לאחרון. המספר והסוג של תאים מבודדים יקבעו כמה מגשים יידרשו. התייעץ טבלת 1 כדי לחשב את מספר מגשים צורך והכמויות הבאות של פתרונות לחלק זה של הפרוטוקול. הבא יפיק ~ 60 מגשים, שאדם אחד מנוסה יכול לעבד בקלות.

1. הכן את אמצעי התקשורת הבאה:
   1. לשכבה התחתונה, להכין 6 x 2 צלוחיות L עם כל המכיל 1,600 מיליליטר DDH ₂ O. להוסיף אבקת NZY (21 גר '/ ל') ואגר (15 גר '/ ל'); מערבב היטב.
   2. לשכבה העליונה, להכין צלוחיות L 4 x 1 עם כל המכילים 800 DDH מיליליטר ₂ O. להוסיף אבקת NZY (21 גר '/ ל') וagarose (7.2 גר '/ ל'); מערבב היטב.
   3. לculturing E. coli, להוסיף 2.5 גרם של אבקת NZY לכל אחד מ2 x 250 מיליליטר צלוחיות ולהביא את הנפח ל100 מיליליטר עם DDH ₂ O;
   4. למגשי אישור המשמשים בשלב 8, להוסיף 8.4 גרם של אבקת NZY ו6 גרם של אגאr בבקבוק 1 ליטר ולהביא את הנפח 400 מיליליטר עם DDH ₂ O.
2. לכסות את הפתח של צלוחיות עם נייר אלומיניום. מערבבים היטב וחיטוי אותם ב121 ° C, 15 psi במשך 30 דקות.
3. הסר את צלוחיות (חמות מאוד!) מהחיטוי. לערבל בזהירות את צלוחיות לערבב אגר וagarose, ולאחר מכן למקם אותם באמבט מים C ° 50. , כאשר אמבט המים הגיע 50 מעלות צלזיוס שוב יוצקים מצלוחיות 2 L (צעד 3.1.1) ~ 150 מיליליטר של אגר NZY בכל מגש (שכבה תחתונה).
4. לאפשר אגר לבסס על RT לפחות 2 שעות, ולאחר מכן להפוך ולפתוח את המגשים. הנח את החלק התחתון של המגשים על המכסה, 45 ° מחוץ למרכז (איור 3) ולתת להתייבש למשך 30 דקות. סגור את המגשים ולעזוב O / N ב RT.
5. בינתיים מכין את ה SCS-8 תרבות coli ליום המחרת. מאחת משני 250 מיליליטר צלוחיות * (צעד 3.1.3), לקחת 5 מיליליטר מרק NZY (לוח 3) ולהעביר ל14 מ 'סטריליצינור ליטר. תוסף עם 62.5 μl של מלטוז / MgSO ₄ פתרון ולהוסיף 10 μl של ה SCS-8 מניית גליצרול coli. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 3-4 שעות בזמן הרועדת ב 250-300 סל"ד. השתמש 15 μl של תרבות זו לחסן 95 מיליליטר של מרק NZY (בבקבוק נשקים 250 מיליליטר), תרבות O / N ב 37 מעלות צלזיוס בחממה רועדת (250-300 סל"ד).
   * הערה: הבקבוק 250 מיליליטר האחר יכול לשמש מאוחר יותר כדי להתאים את קוטר חיצוני של התרבות במידת צורך (שלב 4.1)
6. קח בקבוק 1 ליטר עם אגר (צעד 3.1.4), ויוצקים ~ 6-7 מיליליטר של אגר NZY ב60 מ"מ מנות (זה יהיה מספיק בשביל ~ 50 מנות, הנדרשות לשלב 8). לאפשר אגר להקשיח (~ 10 דקות), ואז להפוך ועוטפים בפלסטיק. אפשר לשמור מנות אלה על 4 מעלות צלזיוס עד לחודש.

4. הכנת מגשים לE. coli / הפאג תרבות (יום 2)

1. בדוק את OD של ה SCS-8 תרבות coli (שלב 3.5) בספקטרופוטומטר.התאם את OD _600-0.6 עם מרק NZY (לוח 3) (צעד 3.1.3), ומניח את הבקבוק על קרח כדי לעצור את הצמיחה ולשמור על קרח עד מוכן לשימוש. זה ישמש לצעדים 6.3 ו8.2. תרבות זו יכולה להישמר במשך 5 ימים ב 4 ° C.
2. אוויר יבש כל מגשים assay (שפכתי היום לפני) ל~ 5 שעות (איור 3).

5. אריזה של הדנ"א הגנומי (יום 2; המשך)

1. קח את המספר הדרוש של תפוז Transpack צינורות החוצה -80 ° C במקפיא ומניח אותם על קרח יבש עד לשימוש; לקחת צינור Transpack כתום אחד לכל תגובת אריזה שיש לבצע. כל תווית צינור כראוי. יש דגימות הדנ"א הגנומי (שלב 2.9) מוכנות על קרח.
2. צעד זה צריך להתבצע בצינור אחד באותו הזמן. לסיים את השלב המלא לפני שעברת לדגימת DNA הבאה. להפשיר ^פתק * צינור תפוז אחד ¹ מהירות: להשתמש באצבעות שלך עד שרובו מופשר, ואז לשיםעל קרח. קח דגימת DNA הגנומי המתאימה ולהעביר באופן מיידי 8-12 מדגם μl ^פתק * ^2,3 לצינור הכתום. מערבבים את התכולה בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה 3x, כמו גם על ידי הקשה על הצינור בעדינות עם האצבע שלך. נסה לא להכניס בועות כאשר ערבוב. מניחים את הצינור באמבט מים C ° 30 ל90 דקות.
   * הערה 1: סיבוב מהיר בmicrocentrifuge ייתכן שיהיה צורך לאסוף את כל התוכן מהקירות הפנימיים וכובע.
   * הערה 2: נפח הדגימה הוסיפה תלויה במספרם של תאים המשמש ליצירת מדגם ש: 11-12 μl של דגימות מוכנות 2.0-5.0 x 10 ⁵ תאים; 10 μl של 1.0 x 10 ⁶ תאי דגימות, ו8 μl של 1.5 x 10 ⁶ תאי דגימות.
   * שים לב 3: ה-DNA היא עדיין צמיגה מאוד; לקחת את ה-DNA החוצה, לדחוף את קצה pipet לחלק התחתון של צינור המדגם ובזהירות לסובב את הקצה סביב לקיר הפנימי של הצינור.
3. קח 1 או 2 Transpack tu הכחולBES * מתוך -80 ° C במקפיא ומניח אותם על קרח יבש עד לשימוש נוסף. הפשירו אותם במהירות ולהעביר 12 μl לכל אחד מהצינורות הכתומים. מערבבים את הפתרון על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה 3 פעמים. לסובב את הצינור למטה ל2-3 שניות, ולאחר מכן לחץ על הצינור עם האצבע לערבוב נוסף ומייד להחזיר אותו לC אמבט המים 30 מעלות לעוד דקות 90.
   * הערה: צינור כחול השתמש ב 1 ל5-6 תגובות ו -2 צינורות כחולים ל10-12 תגובות.
4. לאחר 90 דקות, לדלל כל תגובה עם * חיץ SM 970 μl (לוח 3) כדי לעצור את התגובה ומערבולת במהירות בינונית במשך 5 שניות. שים את הצינורות על קרח עד לשימוש נוסף.
   * הערה: אם מספר התאים הוא ≤ 5 x 10 ^5, השתמש 500 חיץ SM μl (לוח 3) כדי לעצור את התגובה; 2 צינורות (של המדגם זהה) אז יכולים להיות משולבים מאוחר יותר (שלב 6.4).

6. ציפוי אריזת הדנ"א הגנומי (יום 2; המשך)

1. סגור את t אגר ההפוךקרני שנפתחו לייבוש בבוקר. לתייג את המגשים עבור כל דגימה.
2. ממיסים 4.8 גרם של X-gal ב16.8 מיליליטר של N, N-dimethylformamide (נחוץ לצעד 6.5). מערבבים באופן מיידי ולשים על פלטפורמה שייקר. להגן מפני אור. פתרון צריך להיות ברור ב20-30 דקות.
3. Aliquot ה SCS-8 תאי coli. עבור כל קבוצה של מגשים *, השתמש בצינור חרוטי אחד 50 מיליליטר. תווית הצינור עם שם של דגימת DNA הארוזה. הוסף 2 מיליליטר של E. ההשעיה coli לכל מגש.
   * הערה: לדוגמא 3 x 10 ⁵ GMPs דורש סט של 8 מגשים (ראה טבלה 1). לפיכך, שני aliquots, דורשים 8 x 2 = 16 מגשים. שמור aliquots להפריד ובכך להכין שני צינורות 50 מיליליטר, כאשר כל 8 x 2 = 16 מיליליטר E. ההשעיה coli.
4. להוסיף 1 מיליליטר * של דגימת DNA ארוזה (משלב 5.4) לצינור מיליליטר המתאים 50 המכיל את ה SCS-8 aliquot coli ומערבבים היטב. דגירה E. זה coli תערובת הפאג / בincu רועדבטור (250-300 סל"ד), ב-C ° 37 ל23 דקות.
   * הערה: אם ה-DNA היה שחולץ מן ≤ 5 x 10 ⁵ תאים, 500 μl של חיץ SM היה בשימוש כדי לעצור את התגובה (שלב 5.4). בשלב זה, ניתן לשלב את הצינורות והוסיפו לצינור חרוטי אחד 50 מיליליטר.
5. כאשר א תערובת coli / הפאג היא דוגרת, להתחיל בהכנות לשכבת agarose העליונה. הוסף 5 מיליליטר של X-gal / N, פתרון N-dimethylformamide (שלב 6.2) לכל בקבוק 800 מיליליטר של תמיסה העליונה agarose השכבה (משלב 3.1.2; שמר על 50 מעלות צלזיוס). ריכוז סופי של X-gal יהיה 1.5 מ"ג / מיליליטר. X-gal עשוי לזרז קצת כשהוסיף לagarose. מערבולת כדי לפזר את X-gal, והניח את הבקבוק בחזרה באמבט המים 50 מעלות צלזיוס.
6. קח את ה תערובת coli / הפאג מחוץ לחממה (שלב 6.4). כל דגימה דורשת מגשים מרובים; כל מגש, דורש 50 מיליליטר פתרון X-gal/agarose (שלב 6.5). יוצקים את הנפח הנדרש X-gal/agarose עבור כל דגימה (כלומר x 50 מיליליטרמספר המגשים) בבקבוק פלסטיק סטרילי גדול ולהוסיף E. המתאים coli הפאג תערובת /. לערבל את הבקבוק כדי לערבב. מחלקים את התערובת בaliquots של 45-50 מיליליטר ב50 צינורות חרוטי מיליליטר. מספר הצינורות צריך להיות זהה למספר המגשים נדרש למדגם זה.
   הערה: פתרון X-gal/agarose השאריות ישמש בשלב 8.3. הפתרון יכול להיות מאוחסן באמבט המים C ° 50 עד לשימוש נוסף.
7. יוצקים את 50 מיליליטר של תערובת agarose העליונה על פני המחצית התחתונה של מגש assay. במהירות התפשט agarose על ידי הטיית מגש assay מעט בכיוון אחד.
   הערה: agarose יהיה להתקרר מהר מאוד ויהפוך לבלתי אפשרי המתפרסים על פני המגש. לכן, צעד זה צריכה להתבצע יחסית מהיר ועם agarose כי כבר המשיך ב50 ° C.
8. אפשר agarose העליון להקשיח לפחות 15 דקות. ואז, להפוך ולפתוח את מגשי assay לתת להם להתייבש באוויר למשך 30 דקות (איור 3).
9. סגור את המגשים, דגירה מגשי assay ההפוך (בצד שכבה אגר תחתון על גבי) ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 15-16. לא מחסנית יותר מ 5 מגשים.

7. קביעת תדירות המשוערת Mutant (יום 3)

1. הסר את המגשים מ37 מעלות צלזיוס החממה ולתת להם להתקרר. לספור את היחידות השקופות פלאק להרכיב (PFU) על כל מגש; תבחר באופן אקראי 2 אתרים במגשים, לצייר * רבוע של 2.5 x 2.5 ² סנטימטר או 5 X 5 סנטימטר ² ולספור את כל PFUs בכל ריבוע עם דלפק תא לציון (איור 4 א ', ב').
   * הערה: כדי לצייר ריבוע שימוש מכשיר כפי שמוצג באיור 5. אם מספר PFUs נספר הוא ≥ 40, השתמש בריבוע הקטן יותר, אחרת להשתמש גדול יותר.
2. קח את הממוצע של הריבועים נספרים ולהתרבות על ידי 96 אם לספור עם ריבוע קטן יותר, או להכפיל את המספר הזה על ידי 24 אם לספור עם אחד הגדול. הוסף את מספר PFUs נספר עבור כל המגשים מsaלי לטעום. זהו המספר הכולל של PFUs שנוצר עבור מדגם זה.
3. בשלב הבא, לספור את הפלאק המוטציה בכל מגש. המגשים עכשיו התקררו, אשר יסייעו לאתר את הפלאק שעבר מוטציה. כדי להקל עוד יותר באיתור השלטים הכחולים, להעביר את המגש על משטח אדום ו / או לבן; גיליונות נייר אדום ולבן לעבוד היטב. הקף בעיגול כל שלט כחול עם עט סימון. רשום את הצורה ואת עוצמת הצבע הכחול של כל מוטציה (לדוגמא מלא, העיגול, מגזר; איור 4C) ^36,37.
4. לקבוע את תדירות המוטציה המשוערת עבור כל דגימה על ידי חלוקת מספר PFUs מוטציה (שלב 7.3) במספר הכולל של PFUs (שלב 7.2).

8. אימות של משוערים Mutant לוחות (יום 3-5)

1. באמצעות פיפטה פסטר, ליבה כל מוטציה (כחול) PFU ולהעביר את התקע 250 μl חיץ סטרילי SM (לוח 3). הוסף 25 μl של כלורופורם, מערבולת למשך 5 שניותחנות ד ב 4 ° C כדי להמשיך למחרת או לצאת לשעה 2 ב RT, לפני שתמשיך לשלב הבא, כדי לוודא שהמוטציה PFU היא אכן מוטציה. ניתן לאחסן הדגימות על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 1 שנה.
2. תווית אחת 1 מיליליטר וצינור אחד 4 מיליליטר סטרילי עבור כל מוטציה שהיה מחוברת. בצינור מיליליטר 1 החדש, לדלל את הפאג resuspended שוחרר מהתקע אגר (שלב 8.1) 1:50 במאגר SM סטרילי (2 μl של מדגם ל100 חיץ SM μl (לוח 3)), בקצרה מערבולת, מניח בצד. ל4 מיליליטר צינור סטרילי להוסיף 200 μl SCS-8 א ' תרבות coli (משלב 4.1) ו2 μl של הפאג בדילול מלא מצינור 1 מיליליטר המתאים, דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
3. הוסף 2.5 מיליליטר של agarose העליון המכיל X-gal (משמאל למעלה מצעד 6.6) לכל 4 מיליליטר צינור, צינור מערבולת לערבב ולשפוך על גבי צלחת אגר NZY 60 מ"מ שפך קודם לכן (שלב 3.6). לצאת ל10 דקות (כדי לאפשר tהוא עליון לחזק agarose), להפוך את צלחת דגירה O / N ב 37 ° C.
4. למחרת בבוקר, להסיר את הצלחת מן החממה ולקבוע את שיעור PFUs הכחול על כל צלחת (איור 6). כאשר 70% או יותר מPFUs הם כחולים, מוטציה נחשבת אישרה ^38,39. ליבת רובד המוטציה מהצלחת ולהכניס ל1.5 מיליליטר בורג צינור עליון, המכיל 250 חיץ SM μl (לוח 3) ו25 כלורופורם μl, הוא עכשיו מוכן לסידור.
5. כאשר 50% או פחות מPFU הוא כחולים, זה לא נחשב ^38,39 מוטציה אמיתית. כאשר התדירות של PFUs הכחול היא בין 60-70%, בדוק שוב עם בהערות על הצורה של השלט, אם בדמותם של PFU הייתה "מלאה", להמשיך ברצף.

9. סידור עבור מוטציות באצי G מז

1. הגדרת PCR תגובות ב25 μl נפח תגובה, כולל 1.5 μ; ליטר של supernatant פלאק (תבנית, צעד 8.4), פריימר קדימה SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3 ") וSR2 ההפוך פריימר (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3"). השתמש בערכת פולימראז PCR מאריך תקי על פי הוראות היצרן. תנאי רכיבה על אופניים הם כדלקמן: 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ולאחר מכן 35 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס במשך 20 שניות, 60 מעלות צלזיוס במשך 20 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ולאחריו שלב סופי של 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות .
2. קח aliquot 5 μl של כל תגובה ולרוץ על ג'ל agarose 0.8%, כדי לאשר את ההגברה.
3. לנקות את תגובות PCR באמצעות ערכת ניקוי Augencourt על פי הוראות היצרן.
4. לכמת תבנית ה-DNA.
5. שימוש במוצר ה-PCR ~ 100 ng כתבנית ה-DNA על רצף. amplicons רצף בשני הכיוונים תוך שימוש באותה primers PCR כמו פריימרים רצף (ראה לעיל).
6. להרכיב רצפים וליישר עם רצף ההתייחסות לאצי ⁴⁰ לזהות mutatiפיירפוקס.

תוצאות

In vivo assay mutagenesis מודד אירוע נדיר (PFUs מוטציה) בין אירועים רבים (כל PFUs). על ידי ביצוע assay עם מספר קטן של תאים, זה אפשרי שהתוצאה מושפעת במידה ניכרת על ידי תוצאות חיוביות שגויות וכוזבות שליליות. כדי לטפל בבעיה זו ביצענו ניסוי דילול סדרתי עם תאי מח עצם unfractionated, שנקטפו מש?...

Discussion

In vivo assay mutagenesis המתואר כאן מבוסס על המודל של עכברים הטרנסגניים לאצי שנוצר במקור על ידי קולר et al. ¹⁸ מודל זה מנצל וקטור הפאג λ נושא גן כתב לאצי. שני אתרי cos איגוף הווקטור לאפשר התאוששות פשוטה יחסית ואריזה שלאחר מכן לחלקיקי phage זיהומיות, נהגו ל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LacI transgenic mice	BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail	Agilent Technologies (Stratagene)	720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli	Agilent Technologies (Stratagene)	200221
DNA size standards – lambda ladder	Bio Rad	170-3635
0.025 mM pore size membranes	Fisher (Millipore)	VSWP 025 00
245 mm2 bioassay dishes (trays)	Fisher (Corning)	07-200-600
NZY broth (powder)	Fisher (Teknova)	N1144
Agar	Fisher	BP1423-500
Agarose	Fisher	E-3120-500
N, N-dimethylformamide	Fisher	AC34843-5000
X-gal	Research Products Intl Corp (RPI)	B71800-10.0
Proteinase K	Roche	3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit	5 PRIME	2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit	Beckman/coulter	A63880