Identifier ADN mutations dans purifié hématopoïétiques cellules souches / progénitrices

Résumé

Nous décrivons ici un test in vivo de mutagenèse dans des petits nombres de cellules hématopoïétiques purifiées en utilisant le modèle de souris transgénique LacI. Le gène Lacl peut être isolé afin de déterminer la fréquence, le lieu et le type de mutants d'ADN spontanément surgi ou après l'exposition à génotoxines.

Résumé

Au cours des dernières années, il est devenu évident que l'instabilité génomique est étroitement liée à de nombreux troubles du développement, des cancers et de vieillissement. Étant donné que les cellules souches sont responsables d'assurer l'homéostasie tissulaire et la réparation tout au long de la vie, il est raisonnable d'émettre l'hypothèse que la population de cellules souches est essentielle pour la préservation de l'intégrité du génome de tissus. Par conséquent, beaucoup d'intérêt a été soulevée dans l'évaluation de l'impact des facteurs endogènes et environnementaux sur l'intégrité du génome dans les cellules souches et leur progéniture, visant à comprendre l'étiologie des maladies à base de cellules souches.

Souris transgéniques lacI portent un vecteur de phage λ recouvrable codant pour le système rapporteur LacI, dans lequel le gène LacI sert de rapporteur de mutation. Le résultat d'un gène muté LacI est la production de β-galactosidase qui clive un substrat chromogène, le tournant dans le bleu. Le système rapporteur Lad est réalisée in toutes les cellules, y compris les cellules souches / progénitrices et peuvent facilement être récupérés et utilisés pour infecter ensuite E. coli. Après incubation E. infectée coli sur agarose contenant le substrat correct, plaques peut être marqué; plaques bleues indiquent un gène mutant Lad, tandis que les plaques claires abritent de type sauvage. La fréquence de bleu (entre les plaques claires) indique la fréquence de mutation dans la population de cellules d'origine de l'ADN a été extrait à partir de. Le séquençage du gène mutant LacI affiche l'emplacement des mutations dans le gène et le type de mutation.

Le modèle de souris transgénique Lad est bien établi comme un test in vivo de mutagenèse. En outre, les souris et les réactifs pour le test sont disponibles dans le commerce. Nous décrivons ici en détail comment ce modèle peut être adapté pour mesurer la fréquence d'apparition spontanée de mutants d'ADN dans les cellules souches enrichie en cellules Lin ^- IL7R ^- Sca-1 ⁺ cKit ^{+ +} (LSK) et d'autres sous-populations de cellules du système hématopoïétique.

Introduction

Dans la plupart des tissus, des cellules différenciées ont une durée de vie limitée. Afin de maintenir l'intégrité fonctionnelle, les cellules souches spécifiques de tissu à long terme produisent en continu des cellules souches qui à leur tour donnent naissance à des cellules complètement différenciées nécessaires à la fonction de ce tissu particulier. Les cellules souches reconstituer aussi leur propre compartiment par un processus appelé auto-renouvellement. Ainsi, les cellules souches sont responsables du maintien de l'intégrité fonctionnelle des tissus ils résident po Par conséquent, il est impératif qu'ils sont équipés de mécanismes solides pour détecter et potentiellement réparer l'ADN endommagé. Sinon, ils peuvent acquérir de multiples perturbations génomiques (potentiellement dangereux), qui peuvent être hérités par leur progéniture. Comprendre comment les cellules souches sauve-garde de leur génome au cours de la durée de vie d'un organisme est une question importante et peut nous aider à comprendre pourquoi l'instabilité génomique est liée à un cancer et d'autres maladies liées à l'âge (examinés dans ^1,2).

Contrôle de l'intégrité du génome d'un tissu au niveau des cellules souches ou des populations de cellules progénitrices précoce peut être obtenu soit en éliminant tige défectueuse (ou progénitrices) des cellules par l'intermédiaire de la mort cellulaire, la sénescence ou la différenciation, et / ou par une réparation efficace ADN endommagé. Des études récentes ont montré qu'il est possible de mesurer certains types de réparation de l'ADN directement dans ces populations rares ^6.3. On a constaté que, par exemple, dans le système hématopoïétique, les cassures double brin de l'ADN peuvent être réparées par recombinaison homologue (RH) ou de la fin non homologue de jonction (NHEJ), ce dernier étant un procédé de réparation d'une fidélité plus faible et donc une augmentation du risque de prise erreurs. Les deux sont utilisés dans des cellules souches hématopoïétiques (CSH) ^4,5, cependant, chez la souris, il semble qu'il est essentiellement NHEJ dans les CSH tandis que les cellules progéniteurs précoces utilisent HR ^4. Une observation similaire a été faite pour les cellules souches dans la peau ^6. Fait intéressant, dans les CSH humaines HR, pas NHEJ,semble être le mécanisme de réparation de choix pour des cassures double brin ^3. Si cette différence fonctionnelle entre les deux espèces est réelle ou représente une différence technologique ou simplement expérimental reste à voir.

Un répertoire de cellules souches pour réparer l'ADN endommagé est susceptible d'inclure d'autres mécanismes de réparation d'ADN, telles que l'excision de base de réparation (BER), la réparation par excision de nucléotides (NER) et la réparation des mésappariements (MMR). BER et NER sont responsables de la réparation des lésions de paires de bases simples ou multiples dans l'ADN simple brin, alors que l'inadéquation des correctifs ROR base de base et des boucles d'insertion / délétion; ces types de dommages à l'ADN peuvent pas être réparés par NHEJ ou RH. L'appui de cette notion existe plusieurs études provenant du système hématopoïétique qui démontre un lien entre les modifications dans l'une de ces voies et des anomalies dans le compartiment HSC ^7-9, ainsi qu'un risque accru de développer un syndrome myélodysplasique ^10-16, une maladie qui prend naissance dans laHSC et qui est associée à l'augmentation de l'instabilité génomique que la maladie progresse ^17. Pour l'instant, les mesures de BER, NER et MMR directement dans les CSH n'ont pas été signalés.

En plus d'élucider les divers processus qui contrôlent l'intégrité des tissus au niveau mécanique, il est impératif de pouvoir mesurer l'ampleur de l'ADN muté, de sorte que les conséquences d'aberrations dans l'un de ces processus peuvent être testés, par exemple dans la normale par rapport génétiquement cellules souches modifiées ou vieux par rapport à jeune. Cependant, le développement d'un test pertinent est difficile en raison de la rareté des cellules souches tissulaires spécifiques et le manque de conditions de culture qui préserve "caractère souche". En outre, une telle analyse devrait être amendée à des manipulations génétiques et environnementaux. Une solution possible à ces limitations et exigences est l'utilisation de modèles de souris qui sont spécifiquement conçues pour détecter des mutations de l'ADN.

Muldes modèles de souris transgéniques tiples pour la détection de mutations ont été développés. Par exemple, des souris transgéniques ¹⁸ LacI porter un vecteur de phage λ recouvrable codant pour le système rapporteur LacI, dans lequel le gène code pour un suppresseur LacI de l'opérateur lac et sert de rapporteur de mutation. Lors de la mutation du gène LacI, l'opérateur Lac est activé et β-galactosidase est produite. β-galactosidase clive le substrat chromogène X-gal (5-bromo-4-chloro-e-indolyl-β-D-galactopyranoside), qui transforme le bleu. Les sites cos flanquant le vecteur Lacl permet une récupération facile par lambda protéines de phage et une infection ultérieure de E. coli. Après incubation E. infectée coli sur agarose contenant le substrat X-gal, plaques peut être marqué. Des plaques bleues contiennent un mutant putatif Lac-I portant un phage, alors que des plages claires abritent les non-mutants. La fréquence des plages bleues (e parmie ceux claires) indique la fréquence de mutants dans la population de cellules d'origine de l'ADN a été extrait à partir de. En outre, le phage λ accueillir la cible LacI peut être facilement séquencée en utilisant des techniques de PCR pour l'analyse relativement à haut débit. Le séquençage des gènes multiples Laci mutants va révéler des informations importantes sur le spectre de mutation, qui à son tour peut pointer vers d'éventuelles déficiences dans les voies spécifiques de réparation d'ADN ou à des événements spécifiques génotoxiques. Le système transgénique Lad a été normalisé sur plusieurs laboratoires ¹⁹ et les réactifs sont disponibles dans le commerce. Un inconvénient majeur du système Lad est la capacité limitée pour détecter des délétions ou des réarrangements, par conséquent, d'autres méthodes, par exemple FISH multi-couleur sur les spreads métaphase doivent être utilisés pour compléter cette lacune.

Au sein du vecteur de phage λ du modèle de souris LacI, il existe un gène beaucoup plus petite, CII, Disponible pour l'analyse des mutations. Sa taille et le fait que les mutants peuvent être sélectionnés en font un test de main-d'œuvre et moins cher moins ²⁰ que l'analyse du gène Lad. Cependant, le gène LacI est plus largement étudié pour la mutagenèse ²¹ et la sensibilité du gène de mutations a été bien caractérisé de sorte qu'il y ait une compréhension claire des résidus d'acides aminés qui produisent une réponse phénotypique d'un substrat chromogène ^{de 22 à 25.}

D'autres modèles de souris pour la détection de mutations incluent l'utilisation de la ΦX174 ou les transgènes LacZ. Le modèle de souris transgénique ΦX174, avec le A initial: T → G: C réversion mutation dosage ²⁶ ou le test de mutation directe ²⁷ qui permet la détection d'un spectre des substitutions de paires de bases, représente un système moins coûteux que le modèle Lad. Cependant, l'écran de mutation dans le dosage de l'avant n'est pas anodin et la spécification de mutationtrum du transgène ΦX174 n'est pas aussi bien caractérisé que celui de la LacI. Dans des modèles de souris portant des transgènes LacZ, le journaliste de mutation LacZ est récupéré en utilisant E. des cellules hôtes E. coli qui sont sensibles au galactose et un milieu contenant du galactose ^28. Un inconvénient de ce système est que la récupération de la cible LacZ implique également la digestion d'endonucléase de restriction suivie d'une ligature et l'électroporation de E. coli héberge, ce qui rend difficile d'adapter le système pour de petits nombres de cellules. Bien que ce n'est pas une exigence absolue pour travailler avec les populations de cellules souches / progénitrices (on peut toujours commencer avec plus souris), si un grand nombre de cellules sont nécessaires (par exemple, des millions ou plus), il deviendra vite impossible et un coût prohibitif. En outre, la taille relativement importante de LacZ, tout en offrant un reporter sensible mutationnelle, est lourd et plus coûteux pour une analyse de séquence d'ADN et la détermination de spectres de mutation. Toutefois, un des grands avantages de ce modèle est sa capacité à détecter de grandes deletions et insertions, ainsi que des réarrangements chromosomiques.

Etant donné que toutes les cellules dans les modèles de souris transgéniques LacI, ΦX174 et LacZ portent le système rapporteur, l'un de ces modèles de souris peut être utilisée pour mesurer la mutagenèse dans n'importe quel type de cellule d'intérêt, y compris des cellules souches et progénitrices, tant qu'ils peuvent être récoltées de façon fiable et en nombre suffisant. Parce que nous avions une grande expérience avec le modèle de la souris Lad et le test de mutation Lad, nous avons décidé de poursuivre encore ce système pour l'analyse de mutagenèse dans souches hématopoïétiques et populations de cellules progénitrices.

Le tissu hématopoïétique est bien caractérisée en termes de phénotype de surface cellulaire de ses composants individuels, y compris les cellules de repopulation à long terme souches, qui sont identifiables comme la population extrêmement rare de Lin ^- IL7R ^{- Sca-1 + cKit + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - 29 cellules. . Mohrin et al 4 ont démontré que la population légèrement plus grand de LSK/Flk2 - cellules sont encore bons représentants pour les CSH et significativement différent de l'ancêtre myéloïde engagé plus primitive (CMP) de la population quand il s'agit de l'étude de réparation de l'ADN. En outre, lorsque le LSK HSC enrichi (Flk-2 + et Flk-2 -) des cellules ont été comparés à la Lin - IL7R - Sca-1-cKit + (cellules progénitrices LS-K) +, il y avait encore une différence significative dans NHEJ capacité 5 entre le moins pur, de la tige de LSK population enrichie en cellules, et les cellules progénitrices. Dans notre étude, nous utilisons HSC enrichi LSK (Flk-2 + et Flk-2 -) des cellules parce que nous avons constaté qu'au moins 2 x 10 5 cellules sont nécessaires pour des résultats cohérents et fiables dans ce test de mutagenèse; ce numéro de cellule est extrêmement difficileà obtenir quand on trie le LSK/Flk2 - population CD150 + CD48 ou même la LSK/Flk2 - population (en termes de souris, les coûts et pratique). Ce protocole, sur la base de celui initialement mis au point par Kohler et al. 18 décrit en détail la façon dont la fréquence de mutants spontanés d'ADN peut être déterminée dans des cellules LSK et des populations de cellules myéloïdes différenciées ainsi que des cellules de moelle osseuse non séparée et la rate définie.}

Protocole

Les leucocytes de souris transgéniques LacI sur un fond C57BL / 6 n'expriment pas Sca-1 (Figure 1). Par conséquent, si Sca-1 est un marqueur utilisé pour la purification de cellules, ces souris ont besoin d'être croisée avec une souche appropriée pour obtenir Sca-1 expression; dans ce protocole F1 d'un croisement entre des souris C57BL / 6 (B6) des souris normales et LacI (C57BL / 6) chez la souris transgénique (LacI) a été utilisé (figure 1). Des populations cellulaires utilisées dans ce protocole, LSKs et CMP représentent les plus petites populations dans la moelle osseuse. Afin de purifier au moins 2 x 10 ⁵ de chaque / trier, combiner la moelle d'environ dix souris lors de la récolte de la moelle à partir de seulement les membres postérieurs ou d'au moins quatre souris quand aussi la hanche, jambes-, avant os de la colonne vertébrale, et le sternum sont utilisés.

Faire des suspensions monocellulaires à partir de la moelle osseuse et la rate. Une petite proportion de la moelle osseuse est utilisé tel quel, la majorité est utilisée pour PURIFy LSKs et les cellules progénitrices myéloïdes différenciées, à savoir CMP et de granulocytes / progéniteurs monocytaires (BPF) par cellule activé par fluorescence (FACS). L'isolement des cellules de moelle osseuse et purification par FACS de ces populations est décrit ailleurs ^30-32. Environ six sortes indépendants sont nécessaires pour identifier les différences significatives des fréquences de mutation entre les populations.

Le protocole suivant pour la mesure de la fréquence spontanée vivo dans le mutant dans des sous-populations hématopoïétiques purifiées est une adaptation de plusieurs manuels d'instruction Stratagene ^33-35, sur la base de l'œuvre originale de Kohler et al. ¹⁸ Les différences les plus importantes entre les protocoles existants ^33-35 et ce protocole , nécessaire lors de l'utilisation relativement petit nombre de cellules, y compris les différences de volumes de réactifs et les temps et les températures utilisées pour la protéinase K incubation.

1. Stockage des échantillons

Après avoir recueilli les populations de cellules, les cellules désirées aliquotes dans des tubes de centrifugation de 1 ml (pour le nombre de cellules par aliquote, voir le tableau 1). Centrifuger à 266 g pendant 7 min, à 4 ° C. Aspirer le surnageant avec précaution. Mettez les tubes dans l'azote liquide pendant 5 min, puis les transférer dans un congélateur à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. Les échantillons peuvent être stockés pendant au moins 6 mois.

2. Isolement d'ADN génomique

1. Prenez les échantillons de -80 ° C congélateur. Ajouter 500 ul de tampon d'ADN lyse glacé (tableau 3) pour le tube d'échantillonnage. Vortex les tubes pour 3-5 sec à vitesse moyenne et placer les tubes sur de la glace pendant 10 min.
2. Centrifuger les tubes pendant 12 min, 4000 g, 4 ° C. Défaire délicatement ~ 450 pi du surnageant. Isoler le tube pendant 3-5 sec. Utiliser un tube capillaire en verre pour éliminer soigneusement le reste du surnageant. Sécher à l'air des parois intérieures du til tube jusqu'à ce qu'aucune goutte sont plus visibles (~ 2 min).
3. Ajouter 2 ul de RNace-Il ribonucléase cocktail et 10 pi de 1 M DTT à 100 pi du tampon de digestion d'ADN (tableau 3). Ajuster le volume en fonction du nombre d'échantillons qui seront traités, 20 ul de cette solution de digestion d'ADN par échantillon est nécessaire. Après addition de 20 pl de cette au culot cellulaire, essayer de faire le culot de se détacher du fond, en tapotant doucement le tube avec le doigt ou un stylo.
   Remarque: il peut être difficile de voir le culot en raison des faibles nombres de cellules.
4. Ajouter 20 ul protéinase K solution * (tableau 3) à chaque échantillon, très doucement appuyez à nouveau tube.
   * Remarque: la solution de protéinase K doit être réchauffé dans un bain d'eau à 50 ° C, 2 min avant de les utiliser afin d'activer l'enzyme.
5. Placer le tube immédiatement dans un bain d'eau à 50 °. Digérer l'échantillon selon les lignes directrices Tableau 1. Appuyez sur le tube très doucement toutes les 10 min.
   Remarque: Avec un si petit nombre de cellules, la température du bain d'eau et les temps de digestion sont absolument critique pour obtenir avec succès l'ADN génomique de grande qualité.
6. Préparer le système de dialyse de l'ADN dans la chambre froide (figure 2). Verser 600 ml de tampon TE (tableau 3) dans un bécher de 600 ml en verre, ajouter une petite barre d'agitation magnétique, de sorte que le tampon peut être agité pendant la dialyse et de laisser les 0,025 mm (taille des pores) membranes flottent à la surface de la mémoire tampon. Une membrane par échantillon; 1-4 membranes peuvent être utilisées dans un seul récipient de dialyse. Faire une marque sur le bord de la membrane avec des ciseaux pour l'identification de chaque échantillon.
7. Après le temps de digestion approprié, ajouter de l'ADN génomique présent très visqueux * soigneusement au centre de la membrane flottante (figure 2). Recouvrir immédiatement d'une feuille d'aluminium. Dialyser l'ADN génomique à 4 ° C pendant ~ 16 à 20h, remuer doucement le tampon.
   * Remarque: Lorsque vous travaillez avec des solutions d'ADN visqueux, utiliser des embouts de pipette à large ouverture.
8. Le lendemain, versez 600 ml de tampon TE fraîchement préparé (tableau 3) dans un bécher de verre propre et de transférer les membranes pour le nouveau gobelet avec une cuillère très attentivement, et couvrir le bécher d'une feuille. Dialyser pendant 2 h.
9. Retirer la membrane de dialyse du bécher avec le tampon TE aide d'une cuillère et de ne transférer que le "bouquet" plus visqueux de la solution d'ADN dans un nouveau tube de 1 ml, stérile. Conserver l'échantillon à 4 ° C. Continuer le test de mutagenèse le lendemain ou jusqu'à 1,5 mois plus tard. Pour les populations purifiées, attendre au moins 1 semaine.

3. Préparation de plateaux pour le E. coli / Phage Culture (Jour 1)

Chaque bac contient deux couches différentes, une couche d'agar à la base et une couche d'agarose dans la partie supérieure qui contient X-gal. Le E.coli solution / du phage sera ajouté à celui-ci. Le nombre et le type de cellules isolées détermineront combien de plateaux sera nécessaire. Consulter le tableau 1 pour calculer le nombre de plateaux nécessaires et les montants suivants de solutions pour cette partie du protocole. Ce qui suit va générer ~ 60 plateaux, dont une personne expérimentée peut traiter facilement.

1. Préparer les supports suivants:
   1. pour la couche inférieure, la préparation de 6 x 2 L avec des flacons contenant chacun 1 600 ml trou DDH ₂ O. Ajouter la poudre NZY (21 g / L) et de la gélose (15 g / L) et bien mélanger.
   2. pour la couche supérieure, préparer 4 x 1 L flacons contenant chacun avec 800 ml ddH ₂ O. Ajouter NZY poudre (21 g / L) et d'agarose (7,2 g / L) et bien mélanger.
   3. pour la culture de E. coli, ajouter 2,5 g de poudre NZY à chacun des deux ballons de 250 ml x et porter le volume à 100 ml avec le trou DDH ₂ O;
   4. pour les plateaux de confirmation utilisés à l'étape 8, ajouter 8,4 g de poudre NZY et 6 g de agar à une fiole de 1 L et porter le volume à 400 ml avec le trou DDH ₂ O.
2. Couvrir l'ouverture des fioles avec une feuille d'aluminium. Mélangez bien et les passer à l'autoclave à 121 ° C, 15 psi pendant 30 min.
3. Retirez les flacons (très chaud!) De l'autoclave. Agiter soigneusement les flacons à mélanger l'agar-agar et d'agarose, puis placez-les dans un bain d'eau à 50 °. Lorsque le bain d'eau a atteint 50 ° C, à nouveau, verser des flacons de 2 litres (étape 3.1.1) ~ 150 ml de gélose NZY dans chaque plateau (couche inférieure).
4. Laisser la gélose se solidifier à la température ambiante pendant au moins 2 heures, puis inverser et ouvrir les tiroirs. Placez le fond des bacs sur le couvercle, 45 ° hors centre (figure 3) et laisser sécher pendant 30 min. Fermez les plateaux et laissez O / N à la température ambiante.
5. Pendant ce temps, préparer la SCS-8 E. coli pour la culture du lendemain. De l'un des deux flacons de 250 ml * (étape 3.1.3), prendre 5 ml de bouillon NZY (tableau 3) et transférer à un stérile 14 ml tube. Supplément avec 62,5 pi de maltose / solution de MgSO ₄ et ajouter 10 ul du SCS-8 E. coli stock de glycérol. Incuber à 37 ° C pendant 3-4 heures tout en agitant à 250-300 rpm. Utiliser 15 pi de cette culture pour inoculer 95 ml de bouillon NZY (dans un ballon de 250 ml arme de poing), la culture O / N à 37 ° C dans un incubateur à agitation (250-300 tours par minute).
   * Remarque: l'autre flacon de 250 ml peut être utilisé plus tard pour ajuster le diamètre extérieur de la culture si nécessaire (étape 4.1)
6. Prenez la fiole de 1 L avec de l'agar (étape 3.1.4), et versez ~ 6-7 ml de gélose NZY en boîtes de 60 mm (ce sera suffisant pour ~ 50 plats, nécessaires à l'étape 8). Laisser durcir agar (~ 10 min), puis inversez et envelopper dans du plastique. Ces plats peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à un mois.

4. Préparation de plateaux pour le E. coli / Phage Culture (Jour 2)

1. Vérifiez la DO du SCS-8 E. culture coli (étape 3.5) sur le spectrophotomètre.Régler la DO ₆₀₀ à 0,6 avec du bouillon NZY (tableau 3) (étape 3.1.3), et placer le ballon sur glace pour arrêter la croissance et garder sur la glace jusqu'à utilisation. Il sera utilisé pour les étapes 6.3 et 8.2. Cette culture peut être conservé pendant 5 jours à 4 ° C.
2. Air sécher tous les bacs de dosage (versé la veille) pour ~ 5 heures (Figure 3).

5. Conditionnement de l'ADN génomique (Jour 2, suite)

1. Prenez le nombre requis d'orange Transpack les tubes à -80 ° C congélateur et placez-les sur de la glace sèche avant d'être prêt à l'emploi; prendre un tube de Transpack orange pour chaque réaction de l'emballage doit être effectuée. Étiqueter chaque tube de manière appropriée. Avoir les échantillons d'ADN génomique (étape 2.9) prêts sur la glace.
2. Cette étape doit être effectuée une tube à la fois. Terminer l'étape complète avant de passer à la prochaine échantillon d'ADN. Décongeler un tube orange * ^{note 1} rapidement: utilisez vos doigts jusqu'à ce que la plus grande partie est décongelé, puis mettresur la glace. Prenez l'échantillon d'ADN génomique correspondant et transférer immédiatement 8-12 ul d'échantillon * ^{Note 2,3} au tube orange. Mélanger le contenu en pipetage de haut en bas 3x, ainsi que par tapotant doucement le tube avec votre doigt. Essayez de ne pas introduire de bulles lors du mélange. Placer le tube dans un bain-marie à 30 ° pendant 90 min.
   * Note 1: un tour rapide dans une micro peut être nécessaire de recueillir tous les contenus de la paroi intérieure et le bouchon.
   * Note 2: volume de l'échantillon ajouté est fonction du nombre de cellules utilisées pour générer l'échantillon: 11 à 12 pi d'échantillons préparés à 2,0 à 5,0 x 10 ⁵ cellules, 10 ul de 1,0 x 10 ⁶ cellules-échantillons, et 8 pl de 1,5 x 10 ⁶ cellules-échantillons.
   * Note 3: L'ADN est encore très visqueux; prendre l'ADN, enfoncez la pointe de la pipette vers le bas du tube de l'échantillon et soigneusement tordre le bout autour contre la paroi intérieure du tube.
3. Prendre 1 ou 2 bleu Transpack tubes * le congélateur à -80 ° C et placez-les sur de la glace sèche jusqu'à utilisation ultérieure. Décongeler rapidement et transférer 12 pi de chacun des tubes oranges. Mélanger la solution par un léger pipetage de haut en bas 3 fois. Spin le tube diagonal pour 2-3 sec, puis appuyez sur le tube avec le doigt pour obtenir un mélange et retourner immédiatement au bain-marie à 30 ° pour un autre 90 min.
   * Remarque: Utilisez 1 tube bleu 5-6 réactions et deux tubes bleus pour 10-12 réactions.
4. Après 90 min, diluer chaque réaction avec un tampon de 970 pi de SM * (tableau 3) pour arrêter la réaction et vortex à vitesse moyenne pendant 5 sec. Mettez tubes sur la glace jusqu'à utilisation ultérieure.
   * Remarque: si le nombre de cellules est ≤ 5 x 10 ^5, utiliser 500 pi SM tampon (tableau 3) pour arrêter la réaction, 2 tubes (du même échantillon) peuvent ensuite être combinées plus tard (étape 6.4).

6. Placage emballée ADN génomique (Jour 2, suite)

1. Fermez l'agar inversé trayons qui ont été ouverts pour le séchage du matin. Étiqueter les plateaux pour chaque échantillon.
2. Dissoudre 4,8 g de X-gal dans 16,8 ml de N, N-diméthylformamide (nécessaire pour l'étape 6.5). Incorporer immédiatement et mettre sur une plate-forme de shaker. Protéger de la lumière. Solution doit être limpide dans 20-30 min.
3. Aliquoter le SCS-8 E. cellules de E. coli. Pour chaque ensemble de plateaux *, utiliser un tube conique de 50 ml. Étiqueter le tube avec le nom de l'échantillon d'ADN emballé. Ajouter 2 ml de E. coli suspension pour chaque bac.
   * Note: Par exemple 3 x 10 ⁵ BPF nécessite un ensemble de 8 plateaux (voir le tableau 1). Ainsi, les deux parties aliquotes, nécessitent 8 x 2 = 16 plateaux. Gardez les aliquotes séparent et préparent ainsi deux tubes de 50 ml, avec chacun 8 x 2 = 16 ml E. suspension coli.
4. Ajouter les 1 ml * de l'échantillon d'ADN emballé (de l'étape 5.4) dans le tube approprié ml 50 contenant le SCS-8 E. aliquote coli et bien mélanger. Incuber ce E. coli mélange / de phage dans un incu secouantbator (250-300 rpm), à 37 ° C pendant 23 min.
   * Remarque: Si l'ADN a été extrait à partir de ≤ 5 x 10 ⁵ cellules, 500 ul de tampon SM ont été utilisées pour arrêter la réaction (étape 5.4). A ce stade, les tubes peuvent être combinés et ajoutés à 50 ml d'un tube conique.
5. Lorsque le E. mélange coli / phage est en incubation, commencer la préparation de la couche d'agarose haut. Ajouter 5 ml de X-gal / N, solution N-diméthylformamide (étape 6.2) dans chaque fiole de 800 ml de solution d'agarose couche supérieure (de l'étape 3.1.2, maintenue à 50 ° C). Concentration finale de X-gal sera de 1,5 mg / ml. Le X-gal peut précipiter un peu lorsqu'il est ajouté à l'agarose. Agiter pour dissoudre le X-gal et mettre la bouteille dans le bain d'eau à 50 ° C.
6. Prenez le E. mélange coli / phage de l'incubateur (étape 6.4). Chaque échantillon nécessite plusieurs plateaux, chaque plateau, nécessite 50 ml de solution X-gal/agarose (étape 6.5). Verser le volume requis de X-gal/agarose pour chaque échantillon (par exemple 50 ml xnombre de plateaux) dans une grande bouteille en plastique stérile et ajouter la E. approprié coli mélange / de phage. Agiter le flacon pour mélanger. Répartir le mélange dans des aliquotes de 45-50 ml à 50 ml tubes coniques. Le nombre de tubes doit être le même que le nombre de plateaux nécessaires à cet échantillon.
   Remarque: La solution X-gal/agarose restes sera utilisé dans l'étape 8.3. La solution peut être stockée dans un bain-marie à 50 ° C jusqu'à une utilisation ultérieure.
7. Verser 50 ml d'agarose top mélange à travers la moitié inférieure de la barre d'essai. Propager rapidement l'agarose en inclinant légèrement le tiroir de dosage dans une direction.
   Remarque: l'agarose se refroidit très rapidement et deviendra impossible à s'étaler sur le plateau. Par conséquent, cette étape doit être effectuée relativement rapidement et avec de l'agarose qui a été maintenu à 50 ° C.
8. Laisser l'agarose haut à durcir pendant au moins 15 min. Ensuite, inverser et ouvrir les tiroirs de dosage pour les laisser sécher à l'air pendant 30 minutes (Figure 3).
9. Fermez les plateaux, incuber les bacs de dosage inversées (côté de la couche de gélose de bas en haut) à 37 ° C pendant 15-16 h. Ne pas empiler plus de 5 plateaux.

7. La détermination d'une fréquence putatif Mutant (Jour 3)

1. Retirez les bacs à partir du 37 ° C incubateur et laisser refroidir. Compter les unités formant des plaques translucides (UFP) sur chaque plateau, choisir au hasard 2 sites sur les plateaux, dessiner un carré * de 2,5 x 2,5 cm ² ou 5 x 5 cm ² et comptez toutes les UFP dans chaque carré avec un compteur de cellules marquage (figure 4A, B).
   * Note: Pour dessiner l'utilisation carré un dispositif tel que représenté sur la figure 5. Si le nombre de compté PFU est ≥ 40, utiliser le petit carré, sinon utiliser la plus grande.
2. Prendre la moyenne des carrés comptés et multiplier par 96 si le comptage avec un petit carré, ou multiplier ce nombre par 24 si le comptage avec la grande. Ajouter le nombre de PFU compté pour tous les magasins de la SAmoi échantillon. Ceci est le nombre total de PFU généré pour cet échantillon.
3. Ensuite, compter les plaques mutants dans chaque bac. Les plateaux ont refroidi, ce qui aidera à localiser les plaques mutantes. Pour faciliter encore repérer les plaques bleues, déplacer le plateau sur une surface rouge et / ou blanc; feuilles de papier rouge et blanc bien travailler. Encerclez une plaque bleue avec un marqueur. Notez la forme et l'intensité de la couleur bleue de chaque mutant (par exemple complet, cercle, secteur, figure 4C) ^36,37.
4. Déterminer la fréquence de mutants putatifs pour chaque échantillon en divisant le nombre de PFU mutant (étape 7.3) par le nombre total de PFU (étape 7.2).

8. Vérification des putatif Mutant Plaques (Jour 3-5)

1. L'utilisation d'un pipette Pasteur, le noyau de chaque mutant (bleu) PFU et transférer la fiche dans 250 pi de tampon SM stérile (tableau 3). Ajouter 25 ul de chloroforme, vortex pendant 5 secondes uned conserver à 4 ° C pour continuer le lendemain ou à laisser pendant 2 heures à température ambiante avant de continuer à l'étape suivante, pour vérifier que le mutant PFU est en effet un mutant. Les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C pendant au moins 1 an.
2. Label One 1 ml et un 4 ml tube stérile pour chaque mutant qui a été branché. Dans le nouveau tube de 1 ml, diluer le phage remis en suspension libéré du bouchon de gélose (étape 8.1) 1:50 dans un tampon SM stérile (2 pi d'échantillon dans 100 pi de tampon SM (Tableau 3)), vortex brièvement, mettre de côté. Pour les 4 ml tube stérile ajouter 200 ul SCS-8 E. coli culture (de l'étape 4.1) et 2 ul de la dilution du phage à partir du tube de 1 ml correspondant, incuber à 37 ° C pendant 5 à 10 min.
3. Ajouter 2,5 ml de la gélose supérieure contenant X-gal (à gauche depuis l'étape 6.6) à chaque tube de 4 ml, tube agiter pour mélanger et verser sur une plaque de gélose NZY 60 mm précédemment versé (étape 3.6). Laisser reposer 10 minutes (pour laisser til agarose de solidifier), inverser le plat et laisser incuber O / N à 37 ° C.
4. Le lendemain matin, retirez le plat de l'incubateur et de déterminer la proportion de bleu UFP sur chaque plat (figure 6). Lorsque 70% ou plus de la PFU sont bleus, un mutant est considéré comme confirmé ^38,39. La plaque de base mutant de la boîte et mettre dans un 1,5 ml vis tube supérieur, contenant 250 pi de tampon SM (tableau 3) et 25 ul de chloroforme, il est maintenant prêt pour le séquençage.
5. Lorsque 50% ou moins de la PFU est bleu, il n'est pas considéré comme un réel ^38,39 mutant. Lorsque la fréquence de bleu PFU est entre 60-70%, revenez dans les notes sur la forme de la plaque, si la forme de la PFU était "complet", procéder à un séquençage.

9. Séquençage de mutations dans le Lacl G ène

1. Mise en place des réactions de PCR dans un volume réactionnel de 25 ul, comprenant 1,5 μ; L de surnageant plaque (modèle, l'étape 8.4), l'amorce sens SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3 ') et l'amorce inverse SR2 (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3'). Utiliser le kit de polymerase Taq PCR extenseur selon les instructions du fabricant. Les conditions de cyclage sont les suivantes: 94 ° C pendant 2 min, puis 35 cycles de 94 ° C pendant 20 sec, 60 ° C pendant 20 s, 72 ° C pendant 2 min, suivie par une étape finale de 72 ° C pendant 5 min .
2. Prendre une aliquote de 5 ul de chaque réaction et sur un gel d'agarose à 0,8%, pour confirmer l'amplification.
3. Nettoyer les réactions de PCR en utilisant le kit de nettoyage Augencourt selon les instructions du fabricant.
4. Quantifier Patron de l'ADN.
5. Utiliser ~ 100 ng de produit de PCR comme matrice d'ADN pour le séquençage. amplicons de séquence dans les deux directions en utilisant les mêmes amorces de PCR comme amorces de séquençage (voir ci-dessus).
6. Assembler et aligner les séquences avec la séquence de référence Lacl ⁴⁰ pour détecter mutations.

Résultats

Le test in vivo de mutagenèse mesure un événement rare (mutant UFP) parmi beaucoup d'événements (UFP). En effectuant le dosage avec un petit nombre de cellules, il est possible que le résultat est considérablement influencée par des résultats faux-positifs et faux-négatifs. Pour répondre à cette question nous avons réalisé une expérience de dilution en série avec des cellules de moelle osseuse non fractionnées, récoltées à partir de trois animaux différents. Nous avons mesuré la ...

Discussion

Le test in vivo de mutagenèse in décrite ici est basée sur le modèle de souris transgénique LacI initialement généré par Kohler et al. ¹⁸ Ce modèle utilise un vecteur de phage λ portant un gène rapporteur lad. Les deux sites cos flanquant le vecteur permettre une relativement simple récupération et le conditionnement ultérieur en particules infectieuses de phages, utilisés pour infecter E. coli. Une plaque bleue sera généré par p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
LacI transgenic mice	BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail	Agilent Technologies (Stratagene)	720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli	Agilent Technologies (Stratagene)	200221
DNA size standards – lambda ladder	Bio Rad	170-3635
0.025 mM pore size membranes	Fisher (Millipore)	VSWP 025 00
245 mm2 bioassay dishes (trays)	Fisher (Corning)	07-200-600
NZY broth (powder)	Fisher (Teknova)	N1144
Agar	Fisher	BP1423-500
Agarose	Fisher	E-3120-500
N, N-dimethylformamide	Fisher	AC34843-5000
X-gal	Research Products Intl Corp (RPI)	B71800-10.0
Proteinase K	Roche	3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit	5 PRIME	2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit	Beckman/coulter	A63880