Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

Özet

Burada LacI transgenik fare modeli kullanılarak arıtılmış, hematopoietik hücrelerin az sayıda için bir in vivo deneyini tarif mutagenez. LacI gen DNA mutantlarının sıklığı, yer ve tip kendiliğinden ortaya çıkan veya Genotoksinlerin maruz kaldıktan sonra belirlemek için izole edilebilir.

Özet

Son yıllarda, çok sıkı bir şekilde genomik instabilite gelişimsel bozukluklar, kanser, ve yaşlanma ile ilişkili olduğu ortaya çıkmıştır. Kök hücreler yaşam boyu doku homeostazını ve onarım sağlamak için sorumlu olduğu göz önüne alındığında, bu kök hücre popülasyonu dokuların genomik bütünlüğünü korumak için önemli olduğunu varsaymak mantıklıdır. Bu nedenle, önemli faiz kök hücre bazlı hastalıkların etyolojisi anlamak amacıyla, genomik kök hücre dürüstlük ve onların soyu üzerinde endojen ve çevresel faktörlerin etkisinin değerlendirilmesinde ortaya çıkmıştır.

LacI transgenik fareler, LacI gen mutasyon muhabir olarak hizmet ettiği LacI raportör sistemi kodlayan bir geri kazanılabilir λ faj vektörü taşır. Mutasyona uğramış bir LacI geninin sonucu bu böler mavi çevirerek, bir kromojenik alt tabaka, β-galaktosidaz üretimidir. LacI raportör sistemi gerçekleştirilir istem / progenitor hücreler de dahil olmak üzere ve kolay bir şekilde geri kazanılmış ve daha sonra E. enfekte etmek için kullanılabilir n tüm hücreler, coli. E. inkübe edildikten sonra, enfekte doğru alt tabakayı içeren agaroz coli, plaklar atılır olabilir; açık plaklar vahşi tip liman iken mavi plaklar, bir mutant LacI genini göstermektedir. Plakların (net arasında) mavisi sıklığı DNA elde edildi, orijinal hücre popülasyonunda mutant frekansı gösterir. Mutant LacI genini diziliş gendeki mutasyonlar konumunu ve mutasyon tipini gösterir.

LacI transgenik fare modeli, bir in vivo mutajenezi deneyi gibi iyi bilinmektedir. Ayrıca, tahlil için fareler ve ayıraçlar piyasada mevcuttur. Burada bu model kendiliğinden kök hücre zenginleştirilmiş Lin DNA meydana gelen mutasyona uğramış frekansını ölçmek için adapte edilebilir ayrıntılı olarak açıklanmıştır ^- IL7R ^- Sca-1 ^{+ + +} cKit (LSK) hücreleri ve hematopoietik sistemin diğer altgrupları.

Giriş

Çok dokusunda, farklılaşmış hücreler sınırlı bir yaşam süresi vardır. Fonksiyonel bütünlüğünü korumak için, uzun ömürlü, dokuya özel kök hücreler sürekli olarak da söz konusu doku işlevi için gerekli olan tam olarak farklılaşmış hücrelere neden progenitör hücreler üretir. Kök hücreler aynı zamanda kendini yenileme olarak adlandırılan bir süreçte kendi bölmesini doldurmak. Böylece, kök hücreler nedenle içeri ikamet dokusunun fonksiyonel bütünlüğünün korunmasından sorumlu olan, bunların hasarlı DNA'yı duygusu ve potansiyel onarmak için sağlam mekanizmalar ile donatılmış olması zorunludur. Değilse, onların soyu ile kalıtsal olabilir çoklu genomik (zararlı) tedirginlikler, edinebilirler. Kök hücreler bir organizmanın ömrü boyunca kendi genomunu güvenli-guard nasıl anlamak önemli bir sorudur ve genomik istikrarsızlık kanser ve ^(1,2 gözden) diğer bazı yaşa bağlı hastalıklar ile bağlantılı neden anlamamıza yardımcı olabilir.

kök hücre veya erken projenitör hücre popülasyonlarının düzeyinde bir doku genomik bütünlüğünü kontrol / hücre ölümü, yaşlanma ya da farklılaşma ile kök hücrelerinin kusurlu (veya progenitör) ortadan kaldırılması, ve her iki tarafından ya da etkili bir tamir ile elde edilebilir hasarlı DNA. Son çalışmalar, bu nadir popülasyonlarda ^3-6 doğrudan DNA onarımı belirli türde ölçmek mümkün olduğunu göstermiştir. Bu, örneğin, hematopoietik sistem içinde, çift iplikli DNA sonları (NHEJ), ikincisi daha düşük aslına uygunluk onarım işlemi olmak ve böylece yapma riski birleştirme, homolog rekombinasyon (HR) ya da homolog olmayan sonunda tamir edilebilir olduğu bulunmuştur hataları. Hem hematopoetik kök hücre (HSC) ^4,5 olarak kullanılmaktadır, ancak, farelerde erken ataları hücrelerin HR ⁴ kullanmak ise o HKH'lerin ağırlıklı NHEJ görünüyor. Benzer bir gözlem cilt ⁶ kök hücreleri için yapıldı. İlginç bir şekilde, insan HSC İK değil, NHEJ,çift ​​iplikli sonları ³ için tercih tamir mekanizması gibi görünüyor. İki tür arasındaki bu işlevsel fark gerçek ya da sadece bir teknolojik ya da deneysel farkı temsil olsun görülecektir.

Hasarlı DNA tamir Bir kök hücrenin repertuarı, baz eksizyon tamiri (BER), nükleotid eksizyon tamir (NER) ve uyumsuzluğu onarım (MMR) gibi diğer DNA onarım mekanizmaları dahil etmek olasıdır. DNA hasarı bu tür NHEJ veya İK tarafından tamir edilemez; MMR düzeltmeleri baz baz uyumsuzlukları ve ekleme / silme while döngüleri BER ve NER, tek sarmallı DNA tek veya birden fazla baz çifti lezyonların tamiri için sorumludur. Bu kavramı desteklemek HSC bölme ^7-9, bu yolların ve anormalliklerin birinde değişiklikler arasında bir bağlantı gösteren hematopoietik sistemi yanı sıra, miyelodisplastik sendrom ^10-16 kaynaklanan bir hastalığa yakalanma riski birçok çalışmalarHSC ve hastalık ilerledikçe ¹⁷ genomik instabilite artan ile ilişkilidir. Henüz itibariyle, doğrudan HKH'lerin BER, NER ve MMR ölçümleri rapor edilmemiştir.

Mekanik bir düzeyde doku bütünlüğünü kontrol çeşitli işlemleri açıklık ek olarak, bu işlemlerin biri sapmalarını sonuçları genetik karşı, normal olarak, örneğin, test edilebilir, böylece mutasyona uğramış DNA seviyesini ölçmek mümkün zorunludur mühendislik kök hücreleri veya genç, karşı eski içinde. Bununla birlikte, ilgili bir tahlilin geliştirilmesi için dokuya özel kök hücrelerin yetersizliği ve "stemness" korur kültür koşulları eksikliği zordur. Ayrıca, bu tür bir deney Çevresel ve genetik manipülasyonlara iyileştirilebilir olmalıdır. Bu sınırlamalar ve gereksinimlerine Muhtemel bir çözüm, özellikle DNA mutasyonları tespit etmek için tasarlanmıştır fare modelleri kullanılmasıdır.

Mulmutasyon tespiti için tiplemesine transgenik fare modelleri geliştirilmiştir. Örneğin, transgenik fareler, LacI ¹⁸ LacI gen Lac operatörün bastırıcı kodlayan ve mutasyon muhabir olarak hizmet ettiği LacI raportör sistemi kodlayan bir geri kazanılabilir λ faj vektörü taşır. LacI geninin mutasyon üzerine, Lac operatör etkinleştirilir ve β-galaktosidaz üretilir. β-galaktosidaz böler mavi döner kromojenik alt-tabaka X-gal (5-bromo-4-kloro-e-indolil-β-D-galaktopiranosid). LacI vektörü yan cos siteleri lambda faj protein ve E, daha sonraki enfeksiyonlar ile kolayca giderilmesini sağlar coli. E. inkübe edildikten sonra, enfekte coli X-gal alt tabakayı içeren agaroz, plaklar attı olabilir. Net plaklar olmayan mutantlar liman iken mavi plaklar, Lac-I fajının taşıyan bir farazi mutant içerir. Inci arasında mavi plakların frekansı (e açık olanlar) DNA ekstre edilmiş orijinal hücre popülasyonunda mutant frekansı gösterir. Ayrıca, LacI hedef barındıran λ fajlar, nispeten yüksek verimli analizi için PCR teknikleri kullanılarak dizilenebilir. Birden mutant LacI genleri Dizmek da spesifik DNA onarım yollarındaki olası eksiklikler veya belirli genotoksik olaylara işaret edebilir mutasyon spektrumu hakkında önemli bilgiler ortaya koyacaktır. LacI transgenik sistemi, çok sayıda laboratuarlar ¹⁹ standartlaştırıldı ve ayıraçlar piyasada mevcuttur. LacI sistemin bir dezavantajı, büyük silinti ve yeniden düzenlemeleri tespit etmek için sınırlı bir yeteneği vardır, bu nedenle, metafaz yayılır diğer yöntemler, örneğin çok renkli FISH bu eksikliği iltifat için kullanılması gerekmektedir.

LacI fare modeli λ faj vektörü içinde, çok daha küçük bir gen, CII orada, Mutasyon analizi için kullanılabilir. Boyutu ve mutantlar seçilebilir olması bu LacI gen analizi daha az emek-yoğun ve daha ucuz deney ²⁰ hale getirir. Bir kromojenik alt tabaka ^22-25 bir fenotipik yanıt oluşturmak amino asit kalıntılarının bir anlaşılması olduğu Bununla birlikte, LacI gen daha kapsamlı mutagenez ²¹ ve mutasyon genin hassasiyeti için çalışılmıştır, iyi karakterize edilmiştir.

Mutasyon tespiti için diğer fare modelleri ΦX174 ya da LacZ transgenlerin kullanımı bulunmaktadır. T → G: Orijinal A ΦX174 transgenik fare modeli, C reversiyon mutasyon deneyi ²⁶ veya baz çifti değiştirmelerin bir spektrum algılama, LacI modele göre daha az maliyetli bir sistem temsil verir ileri mutasyon deneyi ^27. Bununla birlikte, ön deneyde mutasyon ekran önemsiz ve mutasyon spec değilΦX174 transgen TRUM olarak LacI bu kadar iyi karakterize değildir. LacZ transgenini taşıyan fare modellerinde, LacZ raportör mutasyon E. kullanılarak elde edilir galaktoz ve ²⁸ galaktoz içeren ortama duyarlı olan coli konakçı hücreler. Bu sistemin bir dezavantajı, LacZ hedefin iyileşme de E. ligasyonu ve elektroporasyon takiben sınırlandırma endonükleaz sindirim içerir olmasıdır coli böylece zor hücreleri küçük sayılar için sisteme adapte yapma, ev sahipliği yapıyor. Bu kök / progenitör hücre popülasyonları ile çalışmak için mutlak bir gerekliliktir (bir zaman daha fareler ile başlayabilir) olmamasına rağmen hücreleri çok sayıda (örneğin, milyonlarca ya da daha fazla) gerekiyorsa, hızlı pratik ve maliyet engelleyici olacaktır. Hassas bir mutasyon muhabir sağlarken, aynı zamanda, LacZ nispeten büyük boyutlu, hantal ve DNA sekans analizi ve unsurlar için daha maliyetlidirmutasyon spektrumları ination. Bu modelin önemli bir avantajı ise, geniş eksiltmeler ve ilaveler tespit etme yeteneği, hem de kromozomal yeniden düzenlemeleri olan.

LacI, ΦX174 ve LacZ transgenik fare modellerinde tüm hücreler raportör sistemi taşımak için, bu fare modellerinin herhangi biri gibi uzun süre güvenilir bir şekilde hasat edilebilir, kök ve projenitör hücreleri dahil olmak üzere, ilgi konusu her bir hücre tipinde mutagenez ölçmek için kullanılabilir ve yeterli sayıda. Biz LacI fare modeli ve LacI mutasyon deneyi ile geniş bir deneyim oldu çünkü, biz hematopoetik kök ve progenitör toplumlarda mutagenez analizi için bu sistemi daha sürdürmeye karar verdi.

Hematopoetik doku Lin derece nadir nüfus olarak tanımlanabilir olan uzun vadeli repopulating kök hücreleri de dahil olmak üzere bireysel bileşenler, hücre yüzeyi fenotip açısından iyi karakterize olduğunu ^- IL7R ^{- Sca-1 + cKit + + (LSK'ya) / Flk2 - CD150 + CD48 - hücreleri 29. . DNA onarım eğitim söz konusu olduğunda hücreler hala HKH'lerin için iyi temsilcileri olan ve en ilkel taahhüt miyeloid progenitör (CMP) nüfus önemli derecede farklı - Mohrin ark 4 LSK/Flk2 biraz daha büyük nüfus olduğunu göstermiştir. Ayrıca, zaman HSC bakımından zenginleştirilmiş LSK (Flk-2 + ve Flk-2 -) - IL7R - hücreler, Lin karşılaştırıldı Sca-1-cKit + + (LS-K progenitor hücreler), önemli bir fark yine yoktu az saf arasında NHEJ yeteneği 5, hücre ile zenginleştirilmiş LSK'ya nüfusu ve progenitör kök hücreler. Bu hücre sayısı son derece zordur, en az 2 x 10 5 hücre Bu mutagenez deneyde, tutarlı ve güvenilir sonuçlar için gerekli olduğu bulunmuştur, çünkü hücreler, - Çalışmamızda LSK (Flk-2 + ve Flk-2) HSC zenginleştirilmiş kullanımıCD150 + CD48 nüfus hatta LSK/Flk2 - -, nüfus (fareler, maliyet ve pratiklik açısından) bir LSK/Flk2 sıralar zaman elde edilmiştir. Başlangıçta Kohler ve ark. 18 tarafından geliştirilen birine dayalı bu protokol, spontan DNA mutant frekans farklılaşmış miyeloid hücrelerin popülasyonları gibi ayrışmamış kemik iliği ve dalak hücreleri LSK'ya hücrelerinde tespit ve tanımlanabilir nasıl ayrıntılı olarak anlatılmaktadır.}

Protokol

Bir C57BL / 6 background LacI transgenik farelerden alınan lökositler, Sca-1 (Şekil 1) açıklanmamıştır. Sca-1 hücre saflaştırılması için kullanılan bir işaret ise, bu nedenle, bu fareler Sca-1 ifadesini elde etmek için uygun bir zorlanma ile geçti gerekir, bu protokolde düzenli C57BL / 6 (B6) fareler ve LacI'daki arasında çapraz F1 (C57BL / 6) transgenik fareler (LacI) (Şekil 1) kullanılmıştır. Bu protokolde kullanılan hücre popülasyonlarının, LSKs ve CMPS kemik iliğinde küçük popülasyonları temsil eder. Sadece ayakların veya en az dört farelerden iliği hasat sırasında en az 2 adet x 10 ⁵ / sıralama, yaklaşık on farelerden iliğini birleştirmek arındırmak amacıyla zaman da kalça-, ön bacaklar-, omurga kemikleri, ve sternum kullanılır.

Kemik iliği ve dalak tek hücre süspansiyonları olun. Kemik iliği küçük bir kısmı olduğu gibi, çoğunluk pur için kullanılır kullanılır(FACS) floresan-aktive edilmiş hücre tarafından LSKs ve farklı miyeloid progenitör hücreler örneğin, cmps ve granülositik / monositik ata hücreleri (GMP) ispat. Kemik iliği hücrelerinin izolasyonu ve bu popülasyonlarının FACS arıtma başka ^30-32 tarif edilmektedir. Yaklaşık altı bağımsız sıralar popülasyonlar arasındaki mutasyon frekansları önemli farklılıkları tanımlamak için gereklidir.

Saflaştırılmış hematopoetik alt popülasyonlar spontan in vivo mutant frekansını ölçmek için aşağıdaki protokol Kohler ve ark. ¹⁸ orijinal çalışmalarına dayalı çeşitli stratagene kullanım kılavuzlarına ^33-35, uyarlanmıştır mevcut protokollerin ^33-35 ve bu protokolde arasındaki en kritik farklılık hücrelerin nispeten küçük sayıda kullanılırken gerekli reaktiflerin hacim farklılıkları ve süreleri ve proteinaz K kuluçka için kullanılan sıcaklıklar içerir.

1. Örnek Depolama

1-ml santrifüj tüplerine istenen hücre popülasyonlarının, kısım sonra hücrelerin toplanması (kısım başına hücre sayısı, Tablo 1 'e bakınız). 4 ° C 'de, 7 dakika boyunca 266 x g'de santrifüje Dikkatlice süpernatant aspire. 5 dakika için sıvı azot içine tüpler koyun ve daha sonra kullanım için bir -80 ° C dondurucu aktarın. Numuneler en az 6 ay boyunca saklanabilir.

2. Genomik DNA izolasyonu

1. -80 ° C dondurucu dan numune almak. Örnek tüpe buz soğukluğunda DNA lisis tamponu (Tablo 3), 500 ul ekleyin. Vortex orta hızda 3-5 saniye ve 10 dakika boyunca buz üzerinde tüpleri boruları.
2. 12 dakika için tüpler, 4000 xg, 4 ° C santrifüj Dikkatle ~ 450 ul süpernatan atılır. 3-5 saniye için tüp aşağı spin. Dikkatli bir süpernatan kalanını uzaklaştırmak üzere, bir cam kılcal tüp kullanın. T iç duvarları hava-kurutunO tüpü hiç damlacıklar (~ 2 dak) artık görünür olana kadar.
3. DNA sindirim tamponu (Tablo 3), 100 ul RNace-It ribonükleaz kokteyl 2 ul 1 M DTT ve 10 ul ekle. Işlenecektir numune sayısına göre olan miktarlar ayarlayın, bu DNA sindirim çözeltisi 20 ul numune başına gereklidir. Hücre peleti, bu 20 ul ilave edildikten sonra, topak hafifçe parmak veya kalem ile tüp dokunarak, alt kendini ayırmak yapmaya.
   Not: nedeniyle düşük hücre sayıları pelet görmek için zor olabilir.
4. Çok yavaşça tekrar tüp dokunun, her bir örnek için, 20 ul proteinaz K çözeltisi * (Tablo 3) ilave edin.
   * Not: proteinaz K çözelti bir 50 ° C su banyosu içinde ısıtıldı olmalı, 2 dakika enzimi etkinleştirmek amacıyla kullanılmadan önce.
5. Bir 50 ° C su banyosunda hemen Tüpü. In kurallarına göre örnek Digest Tablo 1. Her 10 dk çok yavaşça tüp dokunun.
   Not: hücre gibi küçük numaraları ile, su banyosunun sıcaklığı ve sindirim kez başarılı bir şekilde yüksek kalitede genomik DNA elde etmek için kesinlikle çok önemlidir.
6. Soğuk odada DNA diyaliz sistemi (Şekil 2) hazırlayın. , 600 ml'lik bir cam kabın içine 600 ml TE tamponu (Tablo 3) Akma tampon diyaliz sırasında karıştırılabilir, böylece küçük bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyip (0.025 mM gözenek boyutu) zarlar tampon yüzeyinde yüzen sağlar. Her örnek için bir zar, 1-4 zarlar tek bir diyaliz beher içinde kullanılabilir. Her numunenin tanımlanması için makas ile zarın kenarındaki bir iz bırakın.
7. Uygun sindirim süresinden sonra, artık çok viskoz genomik DNA * dikkatle yüzen membranın merkezi (Şekil 2) ekleyin. Hemen alüminyum folyo ile örtün beher. ~ 16-20 boyunca 4 ° C 'de genomik DNA Dialyzehr, hafifçe tampon karıştırın.
   * Not: viskoz DNA çözümleri ile çalışırken, geniş bir açılış ile pipet ipuçlarını kullanabilirsiniz.
8. Ertesi gün, temiz bir cam behere taze hazırlanmış TE tampon maddesi (Tablo 3), 600 ml dökün ve çok dikkatli bir şekilde bir kaşık ile yeni behere membranlar transferi ve folyo ile kabı kapsamaktadır. Başka bir 2 saat boyunca Dialyze.
9. Bir kaşık ile TE tampon maddesi ile kaptan diyaliz membranı çıkarın ve yeni, steril 1 ml tüp DNA solüsyonu sadece çok zor akışlı "yığın" aktarın. 4 ° C 'de örnek saklayın Ertesi gün mutagenez tahlil devam ya kadar 1,5 ay sonra. Saflaştırılmış nüfus için, en az 1 hafta bekleyin.

3. E. için Tepsiler hazırlanması coli / Faj Culture (Gün 1)

Her tabla, iki farklı katmanlar içerecek, altındaki bir agar tabaka ve X-gal içeren en az bir agaroz tabakası. E.coli / faj solüsyonu ikinci eklenecektir. Izole edilen hücrelerin sayısı ve türü gerekli olacak kaç tepsiler belirleyecektir. Gerekli tepsiler ve protokolün bu bölümü için çözümler sonraki miktarlarda sayısını hesaplamak için Tablo 1 danışın. Aşağıdaki ~ biri deneyimli bir kişi kolayca işleyebilir 60 tepsiler, üretecektir.

1. Aşağıdaki ortam hazırlayın:
   1. alt tabaka, her bir 1600 ml GKD ₂ O. içeren 6 x 2 L şişeler hazırlamak NZY tozu (21 g / L) ve agar (15 g / L) ekleyin, iyice karıştırın.
   2. üst tabaka için, her biri 800 ml GKD ₂ O. içeren 4 x 1 L cam deney şişesinin hazırlamak NZY tozu (21 g / L) ve agaroz (7.2 g / L) ekleyin, iyice karıştırın.
   3. E. kültürlenmesi için E. coli, 2 x 250 ml şişelere her bir NZY bir toz, 2.5 g ekleyin ve GKD ₂ O ile 100 ml hacim getirmek;
   4. 8 adımda kullanılan onay tepsiler için, NZY toz 8.4 g ve aga 6 g ekleyinr, 1 L bir şişeye ve GKD ₂ O ile 400 ml hacim getirmek
2. Alüminyum folyo ile şişe açıklığı kaplamak. İyice karıştırın ve 121 ° C, 30 dakika boyunca 15 psi'de bunları otoklav.
3. Otoklavdan (ÇOK SICAK!) Şişeler çıkarın. Dikkatlice agar karıştırmak için şişeler girdap ve agaroz, daha sonra 50 ° C su banyosu içine koyun. Su banyosu tekrar 50 ° C ulaştığında, ~ 2 L matara (adım 3.1.1) her kaset (alt tabaka) NZY agar 150 ml dökün.
4. Daha sonra ters çevirin ve tepsileri açmak, agar, en az 2 saat boyunca oda sıcaklığında katılaşmaya izin verin. Kapağın üzerindeki tepsilerin alt kısmına yerleştirin, 45 (Şekil 3) merkezi ° kapalı ve 30 dakika kurumaya bırakın. Tepsileri kapatın ve oda sıcaklığında O / N bırakın.
5. Bu arada, SCS-8 E. hazırlamak ertesi gün için coli kültürü. Iki adet 250 ml'lik şişeler birinden * (adım 3.1.3), 5 ml NZY suyu (Tablo 3) almak ve steril bir 14 m transferl tüpü. 62.5 maltoz / MgSO ₄ çözüm ul ve SCS-8 E. 10 ul eklemek ile takviyesi coli gliserol stok. 250-300 rpm ile çalkalanarak bir 3-4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Çalkalayıcı bir inkübatör (250-300 rpm) 37 ° C 'de (250 mL yan kollu bir şişe içinde) kültür O / N NZY et suyu 95 ml aşılamak için bu kültür 15 ul kullanın.
   * Not: diğer 250 ml'lik bir şişeye, gerekirse (adım 4.1) kültürün OD ayarlamak için daha sonra kullanılabilir
6. Agar (adım 3.1.4) ile 1 L şişeyi alın, ve (bu adımı 8 için gerekli ~ 50 yemekler için yeterli olacaktır) 60 mm yemekleri NZY agar ~ 6-7 ml dökün. Agar (~ 10 dk) sertleşmesine izin, sonra ters ve plastik sarın. Bu yemekler bir ay kadar 4 ° C'de muhafaza edilebilir.

4. E. için Tepsiler hazırlanması coli / Faj Kültürü (Gün 2)

1. SCS-8 E. OD kontrol spektrofotometre coli kültür (3.5 adım).NZY et suyu (Tablo 3) (adım 3.1.3) ile 0.6 OD ₆₀₀ ayarlayın ve büyümeyi durdurmak ve kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutmak için buz üzerinde şişesi yerleştirin. Bu adımlar 6.3 ve 8.2 için kullanılacaktır. Bu kültür 4 ° C'de 5 gün boyunca tutulabilir
2. Hava bütün tahlil tepsileri kuru ~ 5 saat (Şekil 3) (önceki gün döktü).

5. Genomik DNA Ambalaj (2. Gün; Devamı)

1. Turuncu Transpack gerekli sayıda almak dışarı tüpleri -80 ° C derin dondurucuda ve kullanıma hazır olana kadar kuru buz koyun; yapılacak her paket reaksiyonuna için turuncu Transpack tüpü almak. Uygun şekilde her tüp etiketleyin. Buz üzerinde hazır genomik DNA örnekleri (adım 2.9) var.
2. Bu aşama, aynı anda tek bir tüp yapılmalıdır. Sonraki DNA örneği geçmeden önce tam adımı tamamlayın. Hızlı bir şekilde bir turuncu tüp * ^{not 1.} Çözülme: bunun çoğu eriyinceye kadar parmaklarınızı kullanın, sonra koymakBuzlu. Karşılık gelen genomik DNA örneğini alın ve hemen turuncu tüp 8-12 ul örnek * ^{not 2,3} aktarın. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme 3x yanı sıra hafifçe parmağınızla tüp dokunarak tarafından içeriği karıştırın. Karıştırma sırasında kabarcıkları tanıtmak için çalışın. 90 dakika için bir 30 ° C su banyosu içinde Tüpü.
   * Not 1: bir mikrosantrifüj içinde hızlı bir eğirme iç duvarlarından tüm içeriği ve kapağı toplamak için gerekli olabilir.
   * Not 2:; 1.0 x 10 ⁶ hücre örnekleri ve 8 ul 10 ul 2,0-5,0 x 10 ⁵ hücre hazırlanan numunelerin 11-12 ul: ilave numune hacmi bu örnek oluşturmak için kullanılan hücre sayısına bağlıdır 1.5 x 10 ⁶ hücre örneklerinin.
   * Not 3: DNA hala çok viskoz olan,, DNA çıkarmak örnek tüpünün dibine pipet ucu itme ve dikkatli bir şekilde borunun iç duvarına karşı ucu etrafında büküm.
3. 1 ya da 2 mavi Transpack tu atınBes -80 ° C dondurucu dışarı * ve daha sonra kullanmak kadar kuru buz koyun. Arasında hızla çözülme ve turuncu tüplerin her biri 12 ul transfer. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme 3 defa çözüm karıştırın. Daha sonra karıştırma için parmağınızla tüp dokunun ve hemen başka bir 90 dakika süreyle 30 ° C su banyosunda geri, 2-3 sn aşağı tüp spin.
   * Not: 10-12 reaksiyonlar için 5-6 reaksiyonlar ve 2 mavi tüpler için kullanın 1 mavi tüp.
4. 90 dakika sonra 5 saniye boyunca orta hızda ve girdap reaksiyonu durdurmak için 970 ul SM tamponu * (Tablo 3), her bir reaksiyon seyreltin. Daha sonra kullanmak kadar buz üzerinde tüpler koyun.
   * Not: hücre sayısı ≤ 5 x 10 ⁵ ise, tepkimeyi durdurmak için 500 ul SM tampon maddesi (Tablo 3) kullanmak, (aynı numunenin) 2 tüpleri daha sonra (adım 6.4), daha sonra birleştirilebilir.

6. Genomik DNA (; Devamı Gün 2) Paketlenmiş Kaplama

1. Ters ağar t kapatınSabah kurutma açılmıştır ışınları. Her numune için tepsiler etiketleyin.
2. N, 16.8 ml X-gal 4.8 g çözülür, N-dimetilformamid (6.5 adım için gereklidir). Hemen karıştırın ve bir çalkalayıcı platform üzerine koymak. Işığa karşı koruyun. Çözüm 20-30 dakika içinde açık olmalıdır.
3. SCS-8 E. tümbölen coli hücreleri. Tepsilerin her set için *, bir 50 ml konik tüp kullanın. Paketlenmiş DNA örneği adı ile tüp etiketleyin. E. 2 ml ekle Her bir tepsi için coli süspansiyon.
   * Not: Örneğin, 3 x 10 ⁵ GMP 8 tepsiler bir dizi (Tablo 1 'e bakın). Bu şekilde, iki numune, 8 x 2 = 16 tepsileri gerektirir. Alikotları her biri = 16 8 ml x 2 E ile, iki adet 50 ml tüpler ayrılması ve böylece hazırlamak Ol coli süspansiyon.
4. SCS-8 E. ihtiva eden uygun bir 50 ml tüp (aşama 5.4 'dan itibaren) paketlenmiş DNA numunesinin 1 ml * ekleme coli kısım ve iyice karıştırın. Bu E. inkübe bir çalkalama incu içinde coli / faj karışımıbatör (250-300 rpm), 23 dakika boyunca 37 ° C'de.
   * Not: DNA ≤ 5 x 10 ⁵ hücre ekstrakte ise, SM tampon 500 ul reaksiyon (adım 5.4) durdurmak için kullanıldı. Bu adımda, tüpler kombine edilebilir ve bir 50 ml konik tüp ilave edildi.
5. Ne E. coli / faj karışımı üst agaroz tabakası için hazırlıklara başlar kuluçkalanırken. X-gal / N, 5 ml, üst tabaka agaroz çözeltisi her bir 800 ml şişeye, N-dimetilformamid solüsyonu (adım 6.2) (aşama 3.1.2 itibaren, 50 ° C'de tutulur). X-gal son konsantrasyonu 1.5 mg / mL olacaktır. Agaroz eklendiğinde X-gal biraz hızlandırabilir. X-gal çözülür ve tekrar 50 ° C su banyosu içinde şişe koymak için girdap.
6. E. al kuluçka coli / faj karışımı (6.4 adım). Her örnek birden çok tepsi gerektirir, her tepsi, 50 ml X-gal/agarose çözüm (adım 6.5) gerektirir. (Yani, 50 ml x her numune için X-gal/agarose gerekli hacmi döküntepsiler sayısı) daha büyük bir steril plastik şişe ve uygun E. eklemek coli / faj karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Karıştırmak için şişe çalkalanır. 50 ml konik tüplerde 45-50 ml'lik alikolar içinde karışımın bölün. Tüplerin sayısı, bu numune için gerekli tablaların sayısı ile aynı olması gerekir.
   Not: X-gal/agarose kalan çözelti, aşama 8.3 'de kullanılacaktır. Çözelti, daha sonra kullanmak kadar bir 50 ° C su banyosu içinde saklanabilir.
7. Tahlil tepsinin alt yarısı boyunca üst agaroz karışımı 50 ml dökün. Çabuk bir yönde hafifçe deney kaseti eğerek agaroz yayıldı.
   Not: agaroz çok hızlı soğuyacak ve tepsiye yayılmış imkansız hale gelecektir. Bu nedenle, bu adım, nispeten hızlı ve 50 ° C 'de muhafaza edilmiştir agaroz ile yapılması gerekmektedir
8. En iyi agaroz en az 15 dakika boyunca sertleşmeye izin verin. Sonra, ters ve onları hava-kuru 30 dakika (Şekil 3) için izin tahlil tepsileri açmak.
9. , Tepsileri kapatın 15-16 saat boyunca 37 ° C 'de (alt agar tabakası tarafında üstte) ters deney tablaları inkübe edin. Fazla 5 kasetlerini koymayın.

7. Bir Putatif Mutant Frekans Tayini (Gün 3)

1. 37 ° C inkübatör tepsileri çıkarın ve onları soğumaya bırakın. Her tepsi üzerinde saydam plak oluşturan birimler (PFU) saymak, rastgele, tepsiler üzerinde 2 siteleri seçmek 2.5 x 2.5 cm ² veya 5 x 5 cm ² bir kare * çizin ve bir işaretleme hücre sayıcı ile her karede tüm pfus saymak (Şekil 4A, B).
   * Not: Şekil 5'te gösterildiği gibi kare kullanılacak malzeme bir cihaz çizin. Sayılır pfus sayısı 40 ≥ ise, aksi halde büyük kullanımı, daha küçük kare kullanın.
2. Sayılır kareler ortalamasını alın ve küçük bir kare sayma ise 96 ile çarpın veya büyük biri ile sayma ise 24 ile bu sayıyı çarpın. Pfus sayısı sa tüm tepsiler için sayılan ekleBeni örnek. Bu, numune için oluşturulan pfus toplam sayısıdır.
3. Sonra, her tepsiye mutant plaklar saymak. Tepsiler artık mutant plaklar bulmak için yardımcı olacak, soğuduktan. Ayrıca, mavi plaklar tespit kolaylaştırmak kırmızı ve / veya beyaz yüzey üzerinde tepsiyi taşımak için, kırmızı ve beyaz kağıt yaprak iyi çalışır. Bir işaretleyici kalem ile bir mavi plak daire. ^36,37, her mutant mavi renk şeklini ve yoğunluğunu (Şekil 4C örneğin tam, daire, sektör) kaydedin.
4. Pfus toplam sayısı (adım 7.2) ile mutant pfus sayısını (aşama 7.3) bölünerek, her numune için putatif mutant frekansı belirler.

8. Putatif Mutant Plaketler (Gün 3-5) Doğrulama

1. Pasteur pipeti, çekirdek her mutant (mavi) PFU kullanarak ve 250 ul steril SM tampon maddesi (Tablo 3) içine fiş aktarın. 5 SEC için kloroform, girdap 25 ul ekle4 ° C d mağaza ertesi gün veya devam mutant PFU gerçekten bir mutant olduğunu doğrulamak için, bir sonraki adıma devam etmeden önce oda sıcaklığında 2 saat bırakmak. Numuneler en az 1 yıl boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
2. Bir 1 ml ve takılan her mutant için, bir 4 ml steril tüp etiketleyin. Yeni 1 ml tüp içinde, agar fiş kısaca steril SM tampon maddesi içinde (adım 8.1) 01:50 (100 ul SM tampon maddesi (Tablo 3) içine örnek 2 ul), girdap, kenara salınan yeniden süspansiyon haline faj seyreltin. 4 ml steril tüp SCS-8 E. 200 ul ekleyin coli (adım 4.1) kültür ve karşılık gelen 1 ml tüpten seyreltilmiş faj 2 ul, 5-10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
3. 60 mm NZY agar plakası üzerine karıştırmak ve dökmek için her tüp 4 ml, girdap tüpüne (aşama 6.6 'dan sol üzerinde) X-gal ihtiva eden üst agaroz 2.5 ml ilave edilir, daha önce (adım 3.6) içine döküldü. 10 dakika bekletin (izin to top agaroz) kuvvetlendirmek, çanak ters çevirin ve 37 ° C'de O / N kuluçkaya
4. Ertesi sabah, inkübatör çanak kaldırmak ve her yemeğin üzerinde mavi pfus oranını (Şekil 6) belirler. Pfus% 70 veya daha fazla mavi olduğunda, bir mutant ^38,39 teyit olarak kabul edilir. Çekirdek mutant çanak plak ve 1.5 ml 250 ul koyun SM tampon maddesi (Tablo 3) ve 25 | il kloroform içeren tüp, vida; Hemen sekanslama hazır.
5. PFU% 50 ya da daha az mavidir, bu gerçek bir mutant ^38,39 olarak kabul edilmez. , PFU'nun şekli "tam" eğer sıralama ile devam; mavi pfus sıklığı% 60-70 arasında olduğunda, plak şekli hakkında notlar ile tekrar kontrol edin.

9. LacI G DKD Mutasyonlar için dizileme

1. 1,5 μ de dahil olmak üzere, bir 25 ul reaksiyon hacmi içinde PCR reaksiyonları ayarlama, Plak yüzer (template, aşama 8.4) l, ileri primer SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3 ') ve ters primer SR2 (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3'). Üreticinin talimatlarına uygun olarak PCR uzatma Taq polimeraz kiti kullanın. Aşağıdaki döngü koşulları şunlardır: 94 ° C, 2 dakika, daha sonra 20 saniye boyunca 94 ° C 35 döngü, 20 saniye için 60 ° C, 2 dakika için 72 ° C, 5 dakika boyunca 72 ° C'lik bir son aşama izlemektedir .
2. Her bir reaksiyon 5 ul bir kısım alın ve bir% 0.8 agaroz jel üzerine, büyütme onaylamak için.
3. Üreticinin talimatlarına uygun olarak Augencourt temizleme kiti kullanılarak PCR reaksiyonları temizleyin.
4. Şablon DNA nicelleştirmektedir.
5. Sekanslama için şablon DNA olarak PCR ürünü ~ 100 ng kullanın. (Yukarıya bakın) dizileme primerleri ile aynı PCR primerleri kullanılarak her iki yönde de sırası amplikonlar.
6. Dizilerini ve Mutati tespit LacI referans dizisi ⁴⁰ ile uyumons.

Sonuçlar

In vivo mutajenez tahlil nadir bir olay birçok olaylar arasında (mutant pfus) (Tüm pfus) ölçer. Küçük hücre sayısı ile tahlil gerçekleştirerek, bu sonuç oldukça olumlu-yanlış ve yanlış-negatif sonuçları etkilenir mümkündür. Bu sorunu çözmek için üç farklı hayvanlar hasat fraksiyonlanmamış kemik iliği hücreleri, bir seri seyreltme deney gerçekleştirdi. Biz, 1.4 x 10 ^6, 7.0 x 10 ⁵ kullanarak bu hayvanların kemik iliğinde 3.5 x 10 ⁵ mutan...

Tartışmalar

Burada tarif edilen in vivo mutajenezi, ilk deney Kohler et al. ¹⁸ Bu model, lacI genini taşıyan bir raportör λ faj vektörü kullanır tarafından oluşturulan LacI transgenik fare modeline dayanır. Vektör bulaşıcı faj parçacıkları halinde nispeten basit bir iyileşme ve daha sonraki ambalajlama için izin komşu iki cos siteleri, E. enfekte etmek için kullanılır coli. Bir mavi plak faj ile enfekte edilmiş E. tarafından ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
LacI transgenic mice	BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail	Agilent Technologies (Stratagene)	720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli	Agilent Technologies (Stratagene)	200221
DNA size standards – lambda ladder	Bio Rad	170-3635
0.025 mM pore size membranes	Fisher (Millipore)	VSWP 025 00
245 mm2 bioassay dishes (trays)	Fisher (Corning)	07-200-600
NZY broth (powder)	Fisher (Teknova)	N1144
Agar	Fisher	BP1423-500
Agarose	Fisher	E-3120-500
N, N-dimethylformamide	Fisher	AC34843-5000
X-gal	Research Products Intl Corp (RPI)	B71800-10.0
Proteinase K	Roche	3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit	5 PRIME	2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit	Beckman/coulter	A63880