Médula ósea derivada de macrófagos Producción

Resumen

Los macrófagos han sido reconocidos como un componente crítico de la respuesta inmune innata y adaptativa. La reciente explosión de conocimientos relativos a los aspectos evolutivos, genéticos y bioquímicos de la interacción entre los macrófagos y los microbios ha renovado la atención científica a los macrófagos. Este artículo describe un método para diferenciar los macrófagos de médula ósea de ratón.

Resumen

Los macrófagos son componentes fundamentales de la respuesta inmune innata y adaptativa, y son la primera línea de defensa contra los invasores extranjeros debido a sus actividades microbicidas poderosos. Los macrófagos se distribuyen ampliamente por todo el cuerpo y están presentes en los órganos linfoides, hígado, pulmones, tracto gastrointestinal, sistema nervioso central, hueso, y la piel. Debido a su reparto, que participan en una amplia gama de procesos fisiológicos y patológicos. Los macrófagos son células altamente versátiles que son capaces de reconocer alteraciones microambientales y para mantener la homeostasis del tejido. Numerosos patógenos han desarrollado mecanismos para utilizar los macrófagos como caballos de Troya para sobrevivir, replicarse en, e infectar a los seres humanos y los animales y de propagar por todo el cuerpo. La reciente explosión de interés en los aspectos evolutivos, genéticos y bioquímicos de las interacciones huésped-patógeno ha renovado la atención científica en relación con los macrófagos. Aquí se describe unprocedimiento para aislar y cultivar los macrófagos de la médula ósea murina que proporcionará un gran número de macrófagos para el estudio de las interacciones huésped-patógeno, así como otros procesos.

Introducción

Un aspecto significativo de la función de los macrófagos es su papel en la inmunidad innata y adaptativa. Debido a su capacidad de fagocitar partículas inertes, bacterias o parásitos, los macrófagos son una primera línea de defensa contra los invasores extranjeros. Una vez interiorizado, los microbios son degradados en los fagolisosomas. Los macrófagos también envían señales de contratación para y presentan antígenos a otras células inmunes, como los linfocitos T. Los macrófagos se derivan de monocitos. Los monocitos se originan en la médula ósea a partir de células madre mieloides y migran a la sangre periférica y diversos tejidos donde se diferencian en macrófagos. Se estima que un ratón adulto sano contiene aproximadamente 10 ⁸ macrófagos que se distribuyen por todo el cuerpo en varios órganos y tejidos (Tabla 1) ^1,2. Los macrófagos muestran una gran diversidad fenotípica y funcional debido a su capacidad de adaptarse a su ^3,4 microambiente. El macrop más importanteHage propiedad es su actividad microbicida, que se define por su capacidad para fagocitar y destruir microbios ellos. La respuesta fagocítica se define por la activación de complejas redes de señalización que son estimulados por el contacto microbiana, por lo tanto, los macrófagos modulan la expresión génica apropiada en respuesta a diversos estímulos. Después de la fagocitosis, los microbios se eliminan en una estructura llamada fagolisosoma, sin embargo, muchos microbios patógenos han desarrollado estrategias para subvertir la función microbicida de los macrófagos ^5. La diversidad de mecanismos de subversión que son utilizados por diferentes especies microbianas es un testimonio de la complejidad del proceso de fagocitosis ⁶ y fagolisosoma biogénesis. Las enfermedades infecciosas son importantes problemas de salud humana, y numerosos mecanismos y moléculas participan en la actividad antimicrobiana de los macrófagos. Además, los objetivos de las propiedades microbicidas que son secuestrados por los microbios siguen siendo desconocidos, por lo que no es un correoxplosion de interés en los aspectos evolutivos, genéticos y bioquímicos de las interacciones huésped-patógeno que ha renovado la atención científica en relación con los macrófagos. En la actualidad, la mayoría de la investigación en el campo se hace en macrófagos líneas celulares, que difieren de los macrófagos primarios en la actividad fagocítica, la producción de citoquinas y la regulación de la explosión oxidativa. Además, son menos adecuados para la microscopía. Para investigar la interacción macrófagos-patógenos, se recomienda utilizar los macrófagos primarios, como la médula de macrófagos derivados (BMDMs), que presentan características más fisiológicas. Además, es posible trabajar en BMDMs modificados genéticamente, debido a que estos macrófagos pueden ser aislados directamente a partir de ratones transgénicos y, con la disponibilidad de nuevas tecnologías, tales como la transfección lentiviral, su perfil de expresión génica puede ser alterada por la sobreexpresión del gen o ARN de interferencia. Aquí se describe un procedimiento para diferenciar murino m huesoflecha en macrófagos que proporcionarán un gran número de macrófagos en 7 días para diversos análisis funcional, como la proteómica ^{7, 8} transcriptómica, tráfico intracelular estudia ^{9, 10} estudios dinámicos, pantallas genéticas (RNAi), y detección de drogas ^11.

Protocolo

Declaración de Ética

El protocolo para el manejo de animales fue aprobado por el Comité de Ética institucional Animal "Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Experimental Médico-Quirúrgica" (CFREMC, permiso Proyecto 10-300122013 a Eric Ghigo) de la Universidad de Aix-Marsella, en acuerdo con las reglas del Decreto N ° 87-848 del 10/19/1987. Los experimentos se realizaron en la Faculté de Médecine de la Timone (número de permiso de Experimentación 13.385 a Eric Ghigo).

1. Material y Cultura Preparación de Medios

1. Esterilizar dos pinzas, dos tijeras, dos cuchillas quirúrgicas, un mortero y una mano de mortero.
2. Obtener DMEM completo que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS), glutamina 2 mM, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina.
3. Diluir 10 veces en PBS agua destilada estéril para obtener PBS 1x.
4. Obtener enfriado con hielo 1x PBS, DMEM completo enfriado con hielo, WA DMEM completormado a 37 ° C.

2. Preparación de sobrenadantes de células L929

1. Crecer células L929 hasta confluencia (veinte por 175 cm ² frascos) en DMEM completo a 37 ° C, 5% de CO _2.

Nota: Se requiere de colonias de granulocitos y macrófagos factor estimulante (GM-CSF) para inducir la diferenciación de células hematopoyéticas en macrófagos ^12. L929 células producen GM-CSF.

2. En la confluencia, sustituir el medio de cultivo por DMEM completo fresco. Transferencia frascos a 32 ° C, 5% de CO ₂ durante 10 días.
3. Recopilar, piscina y centrifugar los sobrenadantes a 750 g durante 10 min. Desechar los sedimentos celulares.
4. Sobrenadantes tienda en tubos de 15 ml y almacenar a -20 ° C.

3. Médula ósea derivada de macrófagos (BMDM) Preparación

1. Sacrifica 1 ratón por dislocación cervical.
   1. Utilice cuchillas quirúrgicas estériles durante todo el experimento. Desinfecte la piel con 70% alcohol. Hacer una incisión en la parte superior de cada pata trasera y tire de la piel hacia abajo hacia el pie para exponer el músculo.
   2. Cortar las patas traseras, quitar la piel con unas tijeras estériles y pinzas estériles. Coloque las piernas dentro de una placa de Petri estéril (35/10 mm) que contiene estéril, frío de hielo 1x PBS (5 ml).
   3. Retire la carne y los músculos que se ha adherido a los huesos con tijeras y pinzas estériles.
2. Transferencia de los huesos en una nueva, placa de Petri estéril (35/10 mm) que contiene enfriado con hielo, 1 x PBS estéril (5 ml). Lavar los huesos dos veces con 5 ml enfriado en hielo, 1x PBS estéril.
3. Transferir el hueso en un mortero estéril que contiene 5 ml enfriado en hielo, 1x PBS estéril.
4. Cortar la tibia del fémur en la articulación con tijeras estériles. Aplasta los huesos suavemente en un mortero estéril que contiene 5 ml enfriado en hielo, 1x PBS estéril usando una mano de mortero.
5. Recoger el sobrenadante en tubos de 15 ml enfriado en hielo. Repita este paso 3x.
6. Filtrar con un 70 micras stra celular NylonINER para eliminar los fragmentos sólidos. Centrifugar el filtrado a 450 xg durante 10 min a 4 ° C.
7. Deseche con cuidado el sobrenadante. Disociar el precipitado en 10 ml de sangre roja tampón de lisis celular para 30 seg. Añadir 20 ml enfriado en hielo, DMEM completo.

Nota: El objetivo de este paso es eliminar la contaminación de las células rojas de la sangre, por lo tanto, este paso debe realizarse dentro de 2 min para evitar la alteración de células hematopoyéticas por la sangre tampón de lisis de glóbulos rojos.

8. Se centrifuga a 450 × g durante 10 min a 4 ° C. Deseche con cuidado el sobrenadante. Disociar el precipitado en 20 ml de DMEM completo que se ha calentado a 37 ° C.
9. Transferencia de las células disociadas en 2 placas de Petri (100/20 mm). Incubar durante 4 horas a 37 ° C.
10. Reunir los sobrenadantes en tubos de 50 ml a temperatura ambiente. Deseche los platos que contienen los macrófagos residentes.

Nota: El objetivo de este paso es eliminar el marro hueso residentemacrófagos w por su capacidad de adherirse a plástico de cultivo tratados. Estos macrófagos residentes pueden ser utilizados en otros experimentos.

11. Centrifugar los sobrenadantes recogidos a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
12. Disociar suavemente el sedimento en 10 ml de DMEM completo que contiene 15% de L929 sobrenadante celular. Filtre las células a través de una 40 m de células colador de nylon.
13. Recuperar el filtrado. Añadir el filtrado recogido (10 ml) a 140 ml de DMEM completo que se ha suplementado con 15% de L929 medio celular.
14. Distribuir 10 ml de la suspensión de células por placa de Petri (15 placas de Petri, 100/20 mm). Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO _2.
15. Se cultivan las células durante 3 días
16. Añadir 10 ml de DMEM completo que se ha suplementado con 15% de L929. Se incuban las células durante 4 días adicionales.

Nota: Supervisar periódicamente el crecimiento de células con un microscopio invertido (pasos 3.14 a 3.16). Macrófagos adherentes seránobservado después de 3 días de cultivo.

4. BMDMs Cosecha

1. Eliminar el sobrenadante. Lave BMDMs 2 veces con DMEM completo
2. Añadir 5 ml de DMEM completo que se ha calentado a 37 ° C. Separe BMDMs raspando suavemente con una espátula de caucho.
3. Recoger BMDMs en tubos de 50 ml y centrifugar a 450 xg durante 10 min. Disociar suavemente sedimentos celulares en 20 ml de DMEM completo.
4. Cuente BMDMs en presencia de azul de tripano (sin mortalidad superior al 10% debe ser observado).

Nota: Por lo general, alrededor de 6-7,5 x 10 ⁷ macrófagos se obtuvieron a partir de 15 placas de Petri (100/20 mm) de los macrófagos. Hay aproximadamente 4-5 x 10 ⁶ macrófagos / placa de Petri (20/100 mm).

5. Preparar BMDMs según sea necesario para el experimento. Después de 16 h en medio completo a 37 ° C, 5% de CO _2, macrófagos volverá a adherirse al soporte.

5. Almacenamiento BMDMs

1. Recoger BMDMs aislados (paso 4.3). Se centrifuga a 450 × g durante 10 min. Nota: BMDMs pueden congelarse en nitrógeno líquido.
2. Resuspender los sedimentos celulares en medio de congelación que consiste en 10% de DMSO y 90% de FCS a una concentración final de 4 x 10 ⁶ células / ml y pipeta de 1 ml en cada ampolla.
3. Congelar las células a una velocidad de enfriamiento de 1 º C / min. Después de 24 horas, transferir la ampolla a un contenedor de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.

Resultados

El objetivo de este método era obtener fácilmente un gran número de macrófagos en pocos días. La preparación de células de médula ósea se ilustra en la Figura 1. Los huesos de la pata trasera se recogieron y se rompieron en un mortero. Una vez que los macrófagos residentes fueron retirados de la preparación de células de médula ósea, células de médula ósea se incubaron con GM-CSF (Día 0). Después de 3 días, las células, que eran redondas y no adherente antes del cultivo, comienzan a...

Discusión

El protocolo descrito en el presente documento detalla un método para producir un gran número de BMDMs. BMDM son células primarias y tienen la función y las propiedades de los macrófagos a partir de monocitos diferenciados biológica porque hay madura, en contraste a las líneas celulares de macrófagos, que son inmaduros. BMDMs pueden ser utilizados para la investigación genética (RNAi), la detección de drogas, los estudios funcionales, estudios de interacción huésped-patógeno y muchas otras áreas de invest...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco Life Technologies	21969-035
Fetal Calf Serum	Gibco Life Technologies	10270
Penicillin/Streptomycin	Gibco Life Technologies	15070
Glutamine	Gibco Life Technologies	25030-024
PBS (10x)	Lonza	BEM515F
Red Blood Cell Lysis buffer	Sigma	R7757
Cell strainer 70 μm Nylon	BD Falcon	352350
Cell strainer 40 μm Nylon	BD Falcon	352340
50 ml tubes	any supplier	n/a
15 ml tubes	any supplier	n/a
Petri dishes (100/20 mm)	any supplier	n/a	culture treated
Petri dishes (35/10 mm)	any supplier	n/a