Dérivées de moelle osseuse Macrophages production

Résumé

Les macrophages ont longtemps été reconnu comme un élément essentiel des réponses immunitaires innées et adaptatives. L'explosion récente des connaissances relatives aux aspects évolutifs, génétiques, biochimiques et de l'interaction entre les macrophages et les microbes a renouvelé l'attention des scientifiques à macrophages. Cet article décrit une méthode pour différencier les macrophages de moelle osseuse de souris.

Résumé

Les macrophages sont des éléments essentiels de la réponse immunitaire innée et adaptative, et ils sont la première ligne de défense contre les envahisseurs étrangers en raison de leurs activités microbicides puissants. Les macrophages sont largement distribués dans tout le corps et sont présentes dans les organes lymphoïdes, le foie, les poumons, le tractus gastro-intestinal, du système nerveux central, de l'os et de la peau. En raison de leur répartition, ils participent à une large gamme de processus physiologiques et pathologiques. Les macrophages sont des cellules très polyvalents qui sont capables de reconnaître des modifications micro-environnementales et de maintenir l'homéostasie tissulaire. De nombreux agents pathogènes ont développé des mécanismes pour utiliser les macrophages comme des chevaux de Troie pour survivre, se reproduire dans, et d'infecter les humains et les animaux et de se propager dans tout le corps. La récente explosion de l'intérêt pour les aspects évolutifs, génétiques, biochimiques et des interactions hôte-pathogène a renouvelé l'attention des scientifiques concernant les macrophages. Ici, nous décrivons unprocédé pour isoler et cultiver les macrophages de la moelle osseuse murine qui fournira un grand nombre de macrophages pour étudier les interactions hôte-pathogène, ainsi que d'autres processus.

Introduction

Un aspect important de la fonction des macrophages est leur rôle dans l'immunité innée et adaptative. En raison de leur capacité à phagocyter les particules inertes, des bactéries ou des parasites, les macrophages sont une première ligne de défense contre les envahisseurs étrangers. Une fois intériorisée, les microbes sont dégradés dans phagolysosomes. Macrophages envoient aussi des signaux de recrutement et les antigènes présents à d'autres cellules immunitaires comme les lymphocytes T. Les macrophages sont dérivées de monocytes. Les monocytes se posent dans la moelle osseuse à partir de cellules souches myéloïdes et migrent vers le sang périphérique et de divers tissus où ils se différencient en macrophages. On estime que d'une souris adulte en bonne santé contient environ 10 ⁸ macrophages qui sont distribuées dans tout le corps dans divers organes et tissus (tableau 1) ^1,2. Macrophages présentent une grande diversité phénotypique et fonctionnelle en raison de leur capacité à s'adapter à leur ^3,4 microenvironnement. Le plus important macrophage propriété est leur activité microbicide, qui est défini par leur capacité de phagocyter des microbes et les détruire. La réponse phagocytaire est définie par l'activation des réseaux de signalisation complexes qui sont stimulés par le contact microbienne, ainsi, les macrophages modulent l'expression du gène de manière appropriée en réponse à divers stimuli. Après la phagocytose, les microbes sont éliminés dans une structure appelée la phagolysosome, mais de nombreux microbes pathogènes ont développé des stratégies pour renverser la fonction microbicide des macrophages ^5. La diversité des mécanismes de subversion qui sont utilisés par les différentes espèces microbiennes est un témoignage de la complexité du processus phagocytaire ⁶ et phagolysosome biogenèse. Les maladies infectieuses sont les principaux problèmes de santé humaine, et de nombreux mécanismes et les molécules participent à des activités antimicrobiennes des macrophages. En outre, les objectifs des propriétés microbicides qui sont pris en otage par les microbes restent inconnus; ainsi, il est un explosion d'intérêt dans les aspects évolutifs, génétiques, biochimiques et des interactions hôte-pathogène qui a renouvelé l'attention des scientifiques concernant les macrophages. Actuellement, la majorité des travaux de recherche dans le domaine est effectuée sur des lignées de cellules macrophages, qui diffèrent des macrophages primaires dans l'activité phagocytaire, la production de cytokines et la régulation de la poussée oxydative. En outre, ils sont moins appropriés pour la microscopie. Pour étudier l'interaction macrophages-pathogènes, il est recommandé d'utiliser les macrophages primaires, telles que les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs), qui présentent des caractéristiques plus physiologiques. En outre, il est possible de travailler sur BMDMs génétiquement modifiés, parce que ces macrophages pourraient être isolés directement à partir des souris transgéniques, et de la disponibilité des technologies nouvelles telles que la transfection lentiviral, son profil d'expression du gène peut être modifiée par surexpression du gène ou de l'ARN interférence. Ici, nous décrivons une procédure de différencier osseuse murine mflèche en macrophages qui fourniront un grand nombre de macrophages dans les 7 jours pour diverses analyses fonctionnelles telles que la protéomique ^{7, 8} transcriptomique, le trafic intracellulaire étudie ^{9, 10} études dynamiques, les écrans génétiques (ARNi) et le dépistage de drogues ^11.

Protocole

Déclaration d'éthique

Le protocole de manipulation des animaux a été approuvé par notre Comité institutionnel d'éthique animale "Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Expérimentale Médico-Chirurgical» (CFREMC, permis de projet 10-300122013 Eric Ghigo) de l'Université d'Aix-Marseille en accord avec les règles de Décret N ° 87-848 du 19/10/1987. Les expériences ont été effectuées à la Faculté de Médecine de la Timone (numéro de permis d'expérimentation 13,385 à Eric Ghigo).

Une. Matériel et Culture Préparation médias

1. Stériliser deux pinces, deux ciseaux, deux lames chirurgicales, un mortier et un pilon.
2. Obtenir du DMEM complet contenant 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM de glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine.
3. Diluer 10x PBS dans de l'eau distillée stérile pour obtenir 1x PBS.
4. Obtenir glacée 1x PBS, DMEM complet glacée, wa DMEM completrmé à 37 ° C.

2. Préparation de L929 surnageants cellulaires

1. Croître jusqu'à confluence des cellules L929 (vingt 175 ^cm2 dans du DMEM complet) à 37 ° C, 5% CO _2.

Remarque: les colonies de granulocytes-macrophages facteur de stimulation (GM-CSF) est nécessaire pour induire la différenciation des cellules hématopoïétiques dans les macrophages ^12. L929 produisent GM-CSF.

2. A confluence, remplacer le support de culture avec du DMEM complet frais. Transférer les flacons à 32 ° C, 5% CO ₂ pendant 10 jours.
3. Recueillir, piscine et centrifuger les surnageants à 750 g pendant 10 min. Jeter culots cellulaires.
4. surnageants de magasins en tubes de 15 ml et conserver à -20 ° C.

3. Dérivées de moelle osseuse macrophages (BMDM) Préparation

1. Sacrifier une souris par dislocation cervicale.
   1. Utiliser des lames chirurgicales stériles pendant toute l'expérience. Désinfecter la peau avec 70% alcohol. Faire une incision au sommet de chaque patte arrière et tirez la peau vers le bas vers le pied pour exposer le muscle.
   2. Coupez les pattes de derrière, enlever la peau avec des ciseaux stériles et des pinces stériles. Placer les jambes à l'intérieur d'une boîte de Pétri stérile (35/10 mm) contenant stérile, refroidi à la glace 1x PBS (5 ml).
   3. Retirer la chair et les muscles qui sont adhère à l'os avec des ciseaux et des pinces stériles.
2. Transférer les os dans un nouveau plat, Petri stérile (35/10 mm) contenant de la glace-froid, stérile 1x PBS (5 ml). Laver les os deux fois avec 5 ml refroidi à la glace, 1x PBS stérile.
3. Transférer l'os dans un mortier stérile contenant 5 ml refroidi à la glace, 1x PBS stérile.
4. Couper le tibia du fémur à l'articulation avec des ciseaux stériles. Briser les os délicatement dans un mortier stérile contenant 5 ml de glace-froid, stérile 1x PBS aide d'un pilon.
5. Recueillir le surnageant dans 15 ml tubes glacés. Répétez cette étape 3x.
6. Filtrer à travers une cellule de Nylon stra 70 umINER pour éliminer les fragments solides. Centrifuger le filtrat à 450 xg pendant 10 min à 4 ° C.
7. Jeter doucement le surnageant. Dissocier le culot dans 10 ml de tampon de lyse des globules rouges pendant 30 s. Ajouter 20 ml refroidi à la glace, du DMEM complet.

Remarque: Le but de cette étape est d'éliminer les contaminer les globules rouges, ainsi, cette étape doit être effectuée en 2 min afin d'éviter l'altération des cellules hématopoïétiques par le tampon de lyse des globules rouges du sang.

8. Centrifuger à 450 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter doucement le surnageant. Dissocier le culot dans 20 ml de DMEM complet qui a été chauffé à 37 ° C.
9. Transférer les cellules dissociées dans deux boîtes de Pétri (100/20 mm). Incuber pendant 4 heures à 37 ° C.
10. Collecter les surnageants dans des tubes de 50 ml à la température ambiante. Jeter les plats qui contiennent les macrophages résidents.

Remarque: L'objectif de cette étape est d'éliminer la Marro osseuse résidentw macrophages par leur aptitude à adhérer à la culture traitée plastique. Ces macrophages résidents peuvent être utilisés dans d'autres expériences.

11. Centrifuger les surnageants recueillis à 450 xg pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
12. Dissocier doucement le culot dans 10 ml de DMEM complet contenant 15% L929 surnageant cellulaire. Filtrer les cellules à travers un tamis cellulaire en nylon de 40 pm.
13. Récupérer le filtrat. Ajouter le filtrat recueilli (10 ml) à 140 ml de DMEM complet qui a été supplémenté avec 15% de cellules L929 médias.
14. Distribuer 10 ml de la suspension de cellules par boîte de Pétri (15 boîtes de Pétri, 100/20 mm). Incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO _2.
15. Cultiver des cellules pendant 3 jours
16. Ajouter 10 ml de DMEM complet qui a été complété par 15% L929. Incuber les cellules pendant 4 jours supplémentaires.

Remarque: Surveiller la croissance des cellules périodiquement avec un microscope inversé (étapes 3.14 à 3.16). Macrophages adhérents serontobservé après 3 jours de culture.

4. BMDMs de récolte

1. Retirer le surnageant. Laver BMDMs 2 fois avec du DMEM complet
2. Ajouter 5 ml de DMEM complet qui a été chauffé à 37 ° C. Détachez BMDMs en grattant doucement avec une spatule en caoutchouc.
3. Recueillir BMDMs en tubes de 50 ml et centrifuger à 450 g pendant 10 min. Dissocier doucement culots de cellules dans 20 ml de DMEM complet.
4. Comptez BMDMs en présence de bleu trypan (pas de mortalité de plus de 10% doit être observé).

Remarque: En règle générale, d'environ 6 à 7,5 x 10 ⁷ macrophages sont obtenus à partir de 15 boites de Pétri (100/20 mm) des macrophages. Il ya environ 4-5 x 10 ⁶ macrophages / boîte de Pétri (100/20 mm).

5. Préparer BMDMs comme requis pour l'expérience. Après 16 heures dans un milieu complet à 37 ° C, 5% CO _2, les macrophages de nouveau adhérer au support.

5. Stockage BMDMs

1. Recueillir BMDMs isolés (étape 4.3). Centrifuger à 450 g pendant 10 min. Remarque: BMDMs peuvent être congelées dans l'azote liquide.
2. les culots de cellules de remettre en suspension dans des milieux de congélation consistant en 10% de DMSO et 90% de FCS à une concentration finale de 4 x 10 ⁶ cellules / ml et pipette 1 ml dans chaque ampoule.
3. Geler les cellules à une vitesse de refroidissement de 1 ° C / min. Après 24 h, le transfert de l'ampoule dans un récipient d'azote liquide pour un stockage à long terme.

Résultats

Le but de ce procédé est d'obtenir facilement un grand nombre de macrophages dans quelques jours. La préparation de cellules de moelle osseuse est illustré sur la figure 1. Os de la patte arrière ont été recueillies et brisé dans un mortier. Une fois que les macrophages résidents ont été retirés de la préparation de cellules de moelle osseuse, des cellules de moelle osseuse ont été incubées avec du GM-CSF (jour 0). Après 3 jours, les cellules, qui étaient ronds et non adhérent ava...

Discussion

Le protocole décrit ci-après en détail un procédé pour produire de grands nombres de BMDMs. BMDM sont des cellules primaires et ont la fonction biologique et les propriétés des macrophages différenciés à partir de monocytes, car il n'y a mature, à la différence de lignées de cellules macrophages, qui sont immatures. BMDMs peut être utilisé pour le dépistage génétique (RNAi), le dépistage des drogues, des études fonctionnelles, les études d'interaction hôte-pathogène et de nombreux autres d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco Life Technologies	21969-035
Fetal Calf Serum	Gibco Life Technologies	10270
Penicillin/Streptomycin	Gibco Life Technologies	15070
Glutamine	Gibco Life Technologies	25030-024
PBS (10x)	Lonza	BEM515F
Red Blood Cell Lysis buffer	Sigma	R7757
Cell strainer 70 μm Nylon	BD Falcon	352350
Cell strainer 40 μm Nylon	BD Falcon	352340
50 ml tubes	any supplier	n/a
15 ml tubes	any supplier	n/a
Petri dishes (100/20 mm)	any supplier	n/a	culture treated
Petri dishes (35/10 mm)	any supplier	n/a