Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Zusammenfassung

Makrophagen sind seit langem als eine kritische Komponente der angeborenen und erworbenen Immunantworten erkannt. Die jüngste Explosion des Wissens im Zusammenhang mit evolutionären, genetischen und biochemischen Aspekte der Interaktion zwischen Makrophagen und Mikroben hat die wissenschaftliche Aufmerksamkeit auf Makrophagen erneuert. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Makrophagen aus Knochenmark der Maus zu unterscheiden.

Zusammenfassung

Makrophagen sind wichtige Komponenten der angeborenen und adaptiven Immunreaktionen, und sie sind die erste Verteidigungslinie gegen fremde Eindringlinge durch ihre starke mikrobizide Aktivitäten. Makrophagen sind im Körper weit verteilt sind und in den lymphatischen Organen vorhanden sind, Leber, Lunge, Magen, Darm, Zentralnervensystem, Knochen und Haut. Aufgrund ihrer Verteilung, nehmen sie an einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Prozessen. Makrophagen sind sehr vielseitige Zellen, die in der Lage, Veränderungen der Mikroumgebung zu erkennen und Gewebe-Homöostase aufrecht zu erhalten. Zahlreiche Krankheitserreger haben Mechanismen entwickelt, um Makrophagen als Trojanische Pferde, um zu überleben, replizieren und infizieren Menschen und Tiere und über den gesamten Körper ausbreiten. Die jüngste Explosion des Interesses an evolutionären, genetischen und biochemischen Aspekte der Wirt-Pathogen-Interaktionen hat die wissenschaftliche Aufmerksamkeit in Bezug auf Makrophagen erneuert. Hier beschreiben wir eineVerfahren, um aus murinen Knochenmark, die eine große Anzahl von Makrophagen für die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen wie auch andere Prozesse zur Verfügung stellt isolieren und kultivieren Makrophagen.

Einleitung

Ein wesentlicher Aspekt der Makrophagenfunktion ist ihre Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunität. Aufgrund ihrer Fähigkeit, inerte Partikel, Bakterien oder Parasiten phagozytieren, Makrophagen eine erste Linie der Verteidigung gegen fremde Eindringlinge. Einmal verinnerlicht, werden Mikroben innerhalb Phagolysosomen abgebaut. Makrophagen Signale für Rekrutierung und Antigene senden auch auf andere Immunzellen wie T-Lymphozyten. Makrophagen aus Monozyten abgeleitet. Monozyten im Knochenmark von myeloischen Stammzellen entstehen und wandern in peripherem Blut und verschiedenen Geweben, wo sie sich zu Makrophagen differenzieren. Es wird geschätzt, dass eine gesunde erwachsene Maus ungefähr 10 ⁸ Makrophagen, die durch den Körper in verschiedenen Organen und Geweben (Tabelle 1) ^1,2 verteilt sind. Makrophagen zeigen große phänotypische und funktionelle Vielfalt wegen ihrer Fähigkeit, ihre Mikroumgebung ^3,4 anzupassen. Die wichtigste macrophage Eigenschaft ist ihre mikrobizide Aktivität, die durch ihre Fähigkeit definiert ist, Mikroben phagozytieren und zerstören sie. Die phagozytische Reaktion wird durch die Aktivierung von komplexen Signalnetzwerke, die durch mikrobielle Kontakt stimuliert definiert; somit Makrophagen modulieren Genexpression geeignet in Reaktion auf diverse Stimuli. Nach Phagozytose, sind Mikroben in einer Struktur namens Phagolysosom eliminiert, jedoch haben viele pathogene Mikroben Strategien entwickelt, um die Funktion von Makrophagen mikrobizide ⁵ zu untergraben. Die Vielfalt der Subversion Mechanismen, die von verschiedenen Mikrobenarten genutzt werden, ist ein Beleg für die Komplexität des Prozesses phagocytic ⁶ und Phagolysosom Biogenese. Infektionskrankheiten sind große Gesundheitsprobleme und zahlreiche Mechanismen und Moleküle teilnehmen Makrophagen antimikrobielle Aktivitäten. Weiterhin können die Ziele der mikrobiziden Eigenschaften, die durch Mikroben fallen sind unbekannt bleiben, und so gibt es eine Explosion von Interesse in der evolutionären, genetischen und biochemischen Aspekte der Wirt-Pathogen-Interaktionen, die wissenschaftliche Aufmerksamkeit in Bezug auf Makrophagen erneuert hat. Gegenwärtig wird der Großteil der Forschung auf dem Gebiet von Makrophagen-Zellinien, die aus primären Makrophagen in der phagozytischen Aktivität der Cytokine Produktion und die Regulierung des oxidativen Burst unterscheiden geführt. Außerdem sind sie für die Mikroskopie weniger geeignet. Um die Interaktion Makrophagen-Erreger zu untersuchen, wird empfohlen, primären Makrophagen, wie Knochenmarkmakrophagen (BMDMs), die mehrere physiologische Funktionen aufweisen verwenden. Darüber hinaus ist es möglich, über gentechnisch veränderte BMDMs arbeiten, weil diese Makrophagen könnte direkt aus transgenen Mäusen isoliert und mit der Verfügbarkeit von neuen Technologien wie lentivirale Transfektion ihrer Genexpressionsprofil durch Gen-Überexpression oder RNA-Interferenz geändert werden. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Maus-Knochen m unterscheidenPfeil in Makrophagen, die eine große Anzahl von Makrophagen in 7 Tagen für verschiedene Funktions bieten wird analysiert, wie die Proteomik ^{7, 8} Transkriptomik, studiert intrazellulären Transport ^{9, 10} dynamische Studien, genetische Screens (RNAi) und Drogen ^11.

Protokoll

Ethikerklärung

Das Protokoll für die Behandlung der Tiere wurde von unseren institutionellen Tierethikkommission "Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Experimentelle medizinisch-Chirurgical" genehmigt (CFREMC, Projektgenehmigung 10-300122013 Eric Ghigo) von Aix-Marseille-Universität in Übereinstimmung mit den Regeln von Dekret Nr. 87-848 von 1987.10.19. Die Experimente wurden an der Faculté de Médecine de la Timone (Experimentieren Zulassungsnummer 13.385 an Eric Ghigo) durchgeführt.

1. Material und Kultur Medien Vorbereitung

1. Sterilisieren zwei Pinzetten, zwei Scheren, zwei chirurgische Messer, Mörser und ein Stößel.
2. Erhalten komplettem DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
3. Verdünnen 10x PBS in sterilen destillierten Wasser 1x PBS erhalten.
4. Erhalten eiskaltem 1x PBS, eiskalte kompletten DMEM, komplett DMEM waauf 37 ° C RMED

2. Vorbereitung der L929-Zellüberständen

1. Wachsen L929-Zellen in vollständigem DMEM bei 37 ° C zur Konfluenz (zwanzig 175 cm ^2-Kolben), 5% CO _2.

Hinweis: Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) ist erforderlich, um hämatopoetische Zelldifferenzierung in Makrophagen ¹² induzieren. L929-Zellen produzieren GM-CSF.

2. Bei Konfluenz ersetzen Kulturmedien mit frischen komplette DMEM. Übertragen Kolben auf 32 ° C, 5% CO ₂ für 10 Tage.
3. Sammeln, Pool und Zentrifugieren der Überstände bei 750 g für 10 min. Entsorgen Zellpellets.
4. Shopüberstände in 15-ml-Röhrchen und bei -20 ° C

3. Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDM) Herstellung

1. Sacrifice 1 Maus durch Genickbruch.
   1. Sterile chirurgische Messer während des Experiments. Desinfizieren Sie die Haut mit 70% Alkoholhol. Einen Einschnitt an der Spitze jedes Hinterbein und ziehen Sie die Haut nach unten in Richtung des Fußes, um den Muskel aus.
   2. Schneiden Sie die Hinterbeine, entfernen Sie die Haut mit einer sterilen Schere und sterile Pinzette. Legen Sie die Beine in einer sterilen Petrischale (35/10 mm), die sterile, eiskalte 1x PBS (5 ml).
   3. Entfernen Sie das Fleisch und Muskeln, die bis auf die Knochen mit einer sterilen Schere und Pinzette anhaften.
2. Übertragen Sie die Knochen in eine neue, sterile Petrischale (35/10 mm) mit eiskaltem, sterilem 1x PBS (5 ml). Zwei Mal mit 5 ml eiskaltem, sterilen 1x PBS Waschen Sie die Knochen.
3. Übertragen Sie die Knochen in einem sterilen Mörser mit 5 ml eiskaltem, sterilen 1x PBS.
4. Schneiden Sie die Tibia vom Femur am Gelenk mit einer sterilen Schere. Smash die Knochen sanft in einem sterilen Mörser mit 5 ml eiskaltem, sterilen 1x PBS mit einem Stößel.
5. Sammeln Sie den Überstand in eiskaltem 15 ml Tuben. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
6. Filtriert durch ein 70 um Nylon Zelle strainer, feste Fragmente zu entfernen. Zentrifugieren des Filtrats bei 450 × g für 10 min bei 4 ° C.
7. Den Überstand vorsichtig verwerfen. Distanzieren das Pellet in 10 ml Lyse der roten Blutkörperchen Puffer für 30 Sekunden. 20 ml eiskaltem, komplett DMEM.

Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist die Entfernung kontaminierender Erythrozyten, so muss dieser Schritt innerhalb von 2 min durchgeführt werden, um hämatopoetische Zellen Veränderung der roten Blutkörperchen Lysepuffer vermeiden.

8. Zentrifuge bei 450 × g für 10 min bei 4 ° C. Den Überstand vorsichtig verwerfen. Dissoziation des Pellets in 20 ml vollständigem DMEM, das auf 37 ° C erwärmt worden ist,
9. Übertragen Sie die dissoziierten Zellen in zwei Petrischalen (100/20 mm). Inkubieren für 4 h bei 37 ° C.
10. Sammeln der Überstände in 50-ml-Röhrchen bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie die Gerichte, die die Makrophagen enthalten.

Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist es, den Bewohner Knochen marro beseitigenw Makrophagen durch ihre Fähigkeit, an kulturbehandelten Kunststoff haften. Diese Makrophagen in anderen Experimenten verwendet werden.

11. Zentrifugieren der gesammelten Überstände bei 450 × g für 10 min bei 4 ° C Überstand verwerfen.
12. Distanzieren sanft das Pellet in 10 ml komplettem DMEM mit 15% L929-Zellüberstand. Filtern Sie die Zellen durch eine 40 um Nylon Zellsieb.
13. Recover das Filtrat. Füge das gesammelte Filtrat (10 ml) auf 140 ml vollständigem DMEM, das mit 15% L929-Zellmedium ergänzt wurde.
14. Verteilen von 10 ml der Zellsuspension pro Petrischale (15 Petrischalen, 20/100 mm). Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO _2.
15. Wachsen Zellen für 3 Tage
16. 10 ml komplettem DMEM, das mit 15% L929 ergänzt wurde. Inkubieren Zellen für 4 weitere Tage.

Hinweis: Überwachung Zellwachstum regelmäßig mit einem inversen Mikroskop (Schritte 3,14-3,16). Adhärenten Makrophagen werdennach 3 Tagen Kultur beobachtet.

4. Ernten BMDMs

1. Entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie BMDMs 2 mal mit komplettem DMEM
2. 5 ml vollständigem DMEM, das auf 37 ° C erwärmt wurde, Nehmen BMDMs durch leichtes Kratzen mit einem Gummiwischer.
3. Sammeln BMDMs in 50 ml Zentrifugenröhrchen und bei 450 g für 10 min. Vorsichtig distanzieren Zellpellets in 20 ml komplettem DMEM.
4. Zählen BMDMs in Gegenwart von Trypanblau (nicht mehr als 10% Mortalität zu beachten).

Hinweis: In der Regel werden etwa 6-7,5 x 10 ⁷ Makrophagen von 15 Petrischalen (100/20 mm) von Makrophagen erhalten. Es gibt ungefähr 4-5 x 10 ⁶ Macrophagen / Petrischale (100/20 mm).

5. Vorbereitung BMDMs wie für das Experiment erforderlich ist. Nach 16 Stunden in Vollmedium bei 37 ° C, 5% CO _2, Makrophagen wieder auf dem Träger haften.

5. Speichern BMDMs

1. Sammeln isoliert BMDMs (Schritt 4.3). Zentrifuge bei 450 × g für 10 min. Hinweis: BMDMs kann in flüssigem Stickstoff eingefroren werden.
2. Resuspendieren Zellpellets in Gefriermedium, bestehend aus 10% DMSO und 90% FCS auf eine Endkonzentration von 4 x 10 ⁶ Zellen / ml und 1 ml-Pipette in jede Ampulle.
3. Einfrieren der Zellen bei einer Kühlrate von 1 ° C / min. Nach 24 Stunden übertragen die Ampulle zu einem Flüssigstickstoffbehälter für Langzeitlagerung.

Ergebnisse

Das Ziel dieser Methode war, einfach in wenigen Tagen erhalten, eine große Anzahl von Makrophagen. Die Knochenmarkzellpräparation ist in Fig. 1 dargestellt. Bones aus dem Hinterbein wurden gesammelt und in einem Mörser zerschlagen. Wenn die Makrophagen wurden aus dem Knochenmarkszellpräparat entfernt wurden Knochenmarkzellen mit GM-CSF (Tag 0) inkubiert. Nach 3 Tagen sind die Zellen, die vor rund und nicht-adhärenten Kultur waren, beginnen, in Makrophagen zu differenzieren und zu halten (Ab...

Diskussion

Das hierin beschriebene Protokoll Informationen ein Verfahren, eine große Anzahl von BMDMs erzeugen. BMDM Primärzellen und die biologische Funktion und die Eigenschaften von Makrophagen aus Monozyten differenziert da reifen, im Gegensatz zu Makrophagen-Zelllinien, die unreif sind. BMDMs kann genetisches Screening (RNAi), Drogen-Screening, funktionelle Studien, Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien und viele andere Bereiche der Untersuchung verwendet werden.

Die hierin präsentierten Verfahren ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
DMEM	Gibco Life Technologies	21969-035
Fetal Calf Serum	Gibco Life Technologies	10270
Penicillin/Streptomycin	Gibco Life Technologies	15070
Glutamine	Gibco Life Technologies	25030-024
PBS (10x)	Lonza	BEM515F
Red Blood Cell Lysis buffer	Sigma	R7757
Cell strainer 70 μm Nylon	BD Falcon	352350
Cell strainer 40 μm Nylon	BD Falcon	352340
50 ml tubes	any supplier	n/a
15 ml tubes	any supplier	n/a
Petri dishes (100/20 mm)	any supplier	n/a	culture treated
Petri dishes (35/10 mm)	any supplier	n/a