Костного мозга, полученных макрофагов производства

Резюме

Макрофаги уже давно признаны как ключевой компонент врожденной и адаптивной иммунной реакции. Недавний взрыв знаний по проблемам эволюционной, генетических и биохимических аспектов взаимодействия между макрофагами и микробов возобновил научную внимание макрофагов. Эта статья описывает способ дифференцироваться макрофаги из костного мозга мыши.

Аннотация

Макрофаги являются важнейшими компонентами врожденной и адаптивной иммунных реакций, и они являются первой линией обороны против иноземных захватчиков из-за их мощных бактерицидных деятельности. Макрофаги широко распространены по всему телу и присутствуют в лимфоидных органах, печени, легких, желудочно-кишечного тракта, центральной нервной системы, костей, и кожа. Из-за их передела, они участвуют в широком диапазоне физиологических и патологических процессах. Макрофаги очень универсальный клетки, которые способны распознавать микросреды изменения и поддерживать тканевого гомеостаза. Многочисленные патогены развивались механизмы использовать макрофаги как троянские кони, чтобы выжить, размножаться в, и заразить людей и животных и пропагандировать по всему телу. Недавний взрыв интереса к эволюционных, генетических и биохимических аспектов хост-патогенных взаимодействий возобновил научную внимание относительно макрофагов. Здесь мы описываемПроцедура, чтобы изолировать и культивировать макрофаги от мышиного костного мозга, который будет обеспечивать большое количество макрофагов для изучения хост-патогенных взаимодействий, а также другие процессы.

Введение

Существенным аспектом функции макрофагов их роль в врожденного и адаптивного иммунитета. Из-за их способности фагоцитируют инертные частицы, бактерии или паразиты, макрофаги являются первой линией обороны против иноземных захватчиков. После того, как усвоены, микробы разлагаются в фаголизосомах. Макрофаги также отправить по подбору сигналы для и представить антигены других иммунных клеток, таких как Т-лимфоцитов. Макрофаги получены из моноцитов. Моноциты возникают в костном мозге из миелоидных стволовых клеток и мигрируют в периферической крови и различных тканях, где они дифференцируются в макрофаги. Считается, что здоровый взрослый мыши содержит около 10 ⁸ макрофаги, которые распространяются по всему телу в различных органах и тканях (табл. 1) ^1,2. Макрофаги проявляют большую фенотипические и функциональное разнообразие из-за их способности адаптироваться к их микросреды ^3,4. Наиболее важным macropХадж свойство их бактерицидная активность, которая определяется их способностью фагоцитируют микробы и уничтожить их. Фагоцитарной ответ определяется активации сложных сетей сигнализации, которые стимулируются микробной контакта, таким образом, макрофаги модулировать экспрессию генов соответствующим образом в ответ на различные стимулы. После фагоцитоза, микробы будут устранены в структуре, называемой фаголизосом, однако многие болезнетворные микробы разработали стратегии, чтобы подорвать функцию микробицидную макрофагов ^5. Разнообразие механизмов подрывной, которые используются различными видов микроорганизмов является свидетельством сложности процесса фагоцитоза ⁶ и фаголизосомы биогенеза. Инфекционные болезни являются главной проблемы со здоровьем человека, а также многочисленные механизмы и молекулы участвуют в макрофагов антимикробных деятельности. Кроме того, мишенями бактерицидных свойств, которые угнанных микробами остаются неизвестными, таким образом, существует еXplosion интереса к эволюционных, генетических и биохимических аспектов хозяин-патоген взаимодействий, которые возобновил научную внимание относительно макрофагов. В настоящее время большинство исследований в области делается на макрофагах клеточных линий, которые отличаются от первичных макрофагов в фагоцитарной активности, производство цитокинов и регуляции окислительного всплеска. Кроме того, они менее пригодны для микроскопии. Исследовать взаимодействие макрофагов-патогенные рекомендуется использовать первичные макрофаги, таких как костный мозг, полученных макрофагов (BMDMs), которые проявляют более физиологические особенности. Кроме того, можно работать на генетически модифицированных BMDMs, потому что эти макрофаги могут быть выделены непосредственно из трансгенных мышей и, при наличии новых технологий, таких как лентивирусов трансфекции их профиль экспрессии генов может быть изменена путем генной экспрессией или РНК-интерференции. Здесь мы описываем процедуру дифференцировать мышиный кости мстрелка в макрофаги, которые обеспечат большое количество макрофагов в 7 дней для различных функциональных анализов, таких как протеомики ^7, транскриптомику ^8, внутриклеточный торговля изучает ^9, динамические исследования ^10, генетические экранов (RNAi) и наркотики ^11.

протокол

Заявление по этике

Протокол для обращения с животными был одобрен нашей институциональной комитета животных Этика "Conseil Scientifique дю-центр де Формирование и др. по исследованиям экспериментальной медико-Chirurgical" (CFREMC, разрешение Проект 10-300122013 Эрику Ghigo) от Экс-Марсель университета в соответствии с правилами из Décret N ° 87-848 от 10/19/1987. Эксперименты проводились на faculté де Médecine де-ла-Timone (разрешение Эксперименты числа 13,385 Эрику Ghigo).

1. Материал и культура Подготовка Медиа

1. Стерилизовать два щипцы, два ножницы, две хирургические лезвия, ступки и пестика.
2. Получить полную DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 2 мМ глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
3. Развести 10x PBS в стерильной дистиллированной воде, чтобы получить 1X PBS.
4. Получить ледяной 1x PBS, ледяной полный DMEM, полные DMEM ваРМЕД до 37 ° C.

2. Подготовка L929 клеток супернатантов

1. Расти клетки L929 до слияния (двадцать 175 см ² колбы) в полной DMEM при 37 ° С, 5% СО _2.

Примечание: гранулоцитов-макрофагов колониестимулирующий фактор (GM-CSF) требуется, чтобы побудить кроветворную дифференцировку клеток в макрофаги ^12. L929 клетки производят GM-CSF.

2. При слиянии, заменить питательные среды с свежей полной DMEM. Трансфер колбы до 32 ° C, 5% CO ₂ в течение 10 дней.
3. Сбор, бассейн и центрифуги супернатантов при 750 мкг в течение 10 мин. Откажитесь ячейки гранул.
4. Храните супернатанты в 15 мл пробирки и хранят при температуре -20 ° С.

3. Костного мозга, полученных макрофагов (BMDM) подготовка

1. Жертвоприношение 1 мышь путем смещения шейных позвонков.
   1. Используйте стерильные хирургические лезвия в течение всего эксперимента. Лечить кожу 70% алкохол. Сделайте надрез в верхней части каждой задней ноги и потяните кожу вниз, к подножию, чтобы разоблачить мышцы.
   2. Отрежьте задние ноги, снять кожу с стерильными ножницами и стерильным пинцетом. Поместите ноги в стерильную чашку Петри (35/10 мм), содержащей стерильный, ледяной 1X PBS (5 мл).
   3. Снимите плоть и мышцы, которые, придерживаясь костей с стерильными ножницами и щипцами.
2. Передача кости в новую, стерильную чашку Петри (35/10 мм), содержащего ледяной, стерильную 1X PBS (5 мл). Вымойте костей два раза 5 мл охлажденного льдом, стерильной 1x PBS.
3. Передача кость в стерильных раствора, содержащего 5 мл охлажденного льдом, стерильную 1X PBS.
4. Отрежьте голень от бедра на совместной с стерильными ножницами. Разбить кости осторожно в стерильной раствора, содержащего 5 мл охлажденного льдом, стерильную 1X PBS с помощью пестика.
5. Сбор супернатант в ледяной 15 мл пробирок. Повторите этот шаг 3 раза.
6. Фильтр через страте нейлон клеток 70 мкмIner для удаления твердых фрагментов. Центрифуга фильтрата при 450 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
7. Аккуратно отбросить супернатант. Диссоциируют осадок в 10 мл буфера для лизиса клеток красной крови в течение 30 сек. Добавить 20 мл ледяной, в комплекте DMEM.

Примечание: Цель этого шага заключается в удалении загрязняющих эритроциты, таким образом, этот шаг должен быть выполнен в течение 2 мин, чтобы избежать кроветворную изменение клеток красной буфера для лизиса клеток крови.

8. Центрифуга при 450 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Аккуратно отбросить супернатант. Отделить осадок в 20 мл полной DMEM, который был нагревают до 37 ° С.
9. Перенесите разложенных клетки в 2 чашки Петри (100/20 мм). Инкубировать их в течение 4 часов при 37 ° С.
10. Сбор супернатантов в 50 мл пробирки при комнатной температуре. Откажитесь от блюд, содержащих макрофаги резидентов.

Примечание: Цель этого шага состоит в ликвидации костный Marro резидентаW макрофаги по их способности прилипать к культуральной обработке пластмассы. Эти резидентные макрофаги могут быть использованы в других экспериментах.

11. Центрифуга собранные супернатантов при 450 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Удалите супернатант.
12. Диссоциируют осторожно осадок в 10 мл полной DMEM, содержащей 15% L929 клеток супернатанта. Фильтр клетки через ситечко нейлон клеток 40 мкм.
13. Восстановление фильтрата. Добавить собранную фильтрат (10 мл) в 140 мл полной DMEM, которая была дополнена 15% L929 клеток средах.
14. Распределить 10 мл клеточной суспензии в чашку Петри (15 чашек Петри, 100/20 мм). Инкубируйте клетки при 37 ° С, 5% СО _2.
15. Рост клеток в течение 3 суток
16. Добавьте 10 мл в комплекте DMEM, которая была дополнена 15% L929. Инкубируйте клетки в течение 4 дополнительных дней.

Примечание: периодически контролировать рост клеток с помощью инвертированного микроскопа (шаги 3.14-3.16). Приверженец макрофаги будетнаблюдалось после 3 дней культивирования.

4. Сбор BMDMs

1. Удалить супернатант. Вымойте BMDMs 2 раза с полной DMEM
2. Добавить 5 мл полной DMEM, который был нагревают до 37 ° С Снять BMDMs, осторожно очищая с резиновой полицейского.
3. Сбор BMDMs в 50 мл пробирки и центрифуге при 450 х г в течение 10 мин. Аккуратно отделить ячейки гранул в 20 мл полной DMEM.
4. Всего BMDMs в присутствии трипанового синего (не более 10% смертность не должны быть соблюдены).

Примечание: Как правило, примерно 6-7,5 х 10 ⁷ макрофаги получают из 15 чашки Петри (100/20 мм) от макрофагов. Есть приблизительно 4-5 х 10 ⁶ макрофаги / Чашка Петри (100/20 мм).

5. Подготовка BMDMs как это требуется для эксперимента. Через 16 ч в полной среде при 37 ° С, 5% СО _2, макрофаги снова прилипать к опоре.

5. Хранение BMDMs

1. Сбор изолированных BMDMs (шаг 4.3). Центрифуга при 450 мкг в течение 10 мин. Примечание: BMDMs могут быть заморожены в жидком азоте.
2. Ресуспендируют осадок клеток в замораживании носитель, состоящий из 10% ДМСО и 90% FCS до конечной концентрации 4 × 10 ⁶ клеток / мл и 1 мл пипетки в каждую ампулу.
3. Замораживание клеток при скорости охлаждения 1 ° С / мин. Через 24 ч передавать ампулу в емкости для жидкости азота в течение длительного хранения.

Результаты

Цель этого метода было легко получить большое количество макрофагов в несколько дней. Препарат клеток костного мозга показано на рисунке 1. Кости от задней ноги были собраны и разбил в ступке. После того, как резидентных макрофагов были удалены из клеточного препарата костног?...

Обсуждение

Протокол, описанный здесь подробно способ получения большого количества BMDMs. BMDM первичные клетки и обладают биологической функцией и свойства макрофагов дифференцированных из моноцитов, потому что есть зрелый, в отличие от макрофагов клеточных линий, которые незрелыми. BMDMs могут быть ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
DMEM	Gibco Life Technologies	21969-035
Fetal Calf Serum	Gibco Life Technologies	10270
Penicillin/Streptomycin	Gibco Life Technologies	15070
Glutamine	Gibco Life Technologies	25030-024
PBS (10x)	Lonza	BEM515F
Red Blood Cell Lysis buffer	Sigma	R7757
Cell strainer 70 μm Nylon	BD Falcon	352350
Cell strainer 40 μm Nylon	BD Falcon	352340
50 ml tubes	any supplier	n/a
15 ml tubes	any supplier	n/a
Petri dishes (100/20 mm)	any supplier	n/a	culture treated
Petri dishes (35/10 mm)	any supplier	n/a