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Method Article
Os macrófagos têm sido reconhecidos como um componente crítico das respostas imune inata e adaptativa. A recente explosão de conhecimentos relativos aos aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos da interação entre macrófagos e micróbios renovou atenção científica para macrófagos. Este artigo descreve um método para diferenciar macrófagos de medula óssea de ratinho.
Os macrófagos são componentes críticos das respostas imune inata e adaptativa, e eles são a primeira linha de defesa contra invasores estrangeiros por causa de suas poderosas atividades microbicidas. Os macrófagos são amplamente distribuído por todo o corpo e estão presentes nos órgãos linfóides, fígado, pulmões, tracto gastrointestinal, sistema nervoso central, ossos e pele. Por causa da sua repartição, que participam numa vasta gama de processos fisiológicos e patológicos. Os macrófagos são células altamente versáteis que são capazes de reconhecer alterações do microambiente e para manter a homeostase do tecido. Numerosos agentes patogénicos desenvolveram mecanismos para usar macrófagos como cavalos de Tróia para sobreviver, replicam em, e infectam os seres humanos e animais e para propagar ao longo do corpo. A recente explosão de interesse em aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos de interação patógeno-hospedeiro renovou atenção científica sobre macrófagos. Aqui, descrevemos umProcesso para isolar e cultivar macrófagos de medula óssea de murino que irá proporcionar um grande número de macrófagos para estudar interacções hospedeiro de organismos patogénicos, assim como outros processos.
Um aspecto importante da função dos macrófagos é o seu papel na imunidade inata e adaptativa. Devido à sua capacidade de fagocitar partículas inertes, bactérias ou parasitas, os macrófagos são a primeira linha de defesa contra os invasores externos. Uma vez internalizado, micróbios são degradados dentro de fagolisossomas. Os macrófagos também enviam sinais de recrutamento para e antígenos presentes a outras células do sistema imunológico, como os linfócitos T. Os macrófagos são derivados dos monócitos. Os monócitos surgem na medula óssea a partir de células-tronco mielóides e migrar para o sangue periférico e vários tecidos, onde eles diferenciam-se em macrófagos. Estima-se que um rato adulto saudável contém aproximadamente 10 8 macrófagos que são distribuídos ao longo do corpo em vários órgãos e tecidos (Tabela 1) 1,2. Os macrófagos exibem grande diversidade fenotípica e funcional por causa de sua capacidade de se adaptar ao seu microambiente 3,4. O mais importante macrophage propriedade é a sua actividade microbicida, a qual é definida pela sua capacidade de fagocitose de micróbios e as destroem. A resposta fagocítica está definido pela activação de redes de sinalização complexas que são estimulados por contacto microbiana, assim, para modular a expressão de genes de macrófagos de forma apropriada em resposta a diversos estímulos. Após a fagocitose, os micróbios são eliminados em uma estrutura chamada fagolisossomo, no entanto, muitos micróbios patogénicos têm desenvolvido estratégias para subverter a função microbicida dos macrófagos 5. A diversidade de mecanismos de subversão que são utilizadas por diferentes espécies microbianas é uma prova da complexidade do processo de fagocitose 6 e fagolisossomo biogênese. As doenças infecciosas são os principais problemas de saúde humana, e vários mecanismos e moléculas de participar de atividades antimicrobianas de macrófagos. Além disso, os alvos das propriedades microbicidas que são sequestradas por micróbios permanecem desconhecidos, assim, existe uma mensagemxplosion de interesse nos aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos de interação patógeno-hospedeiro, que renovou a atenção científica sobre macrófagos. Atualmente, a maioria das pesquisas no campo é feito em macrófagos linhagens celulares, que diferem de macrófagos primários na atividade fagocitária, a produção de citocinas e da regulação do burst oxidativo. Além disso, eles são menos adequados para microscopia. Investigar a interação macrófagos-patógenos é recomendado o uso de macrófagos primários, tais como medula macrófagos derivados (BMDMs), que apresentam características mais fisiológicas. Além disso, é possível trabalhar em BMDMs geneticamente modificados, porque estes macrófagos pode ser isolado directamente a partir de ratinhos transgénicos e, com a disponibilidade de novas tecnologias, tais como a transfecção lentiviral, o perfil de expressão do gene podem ser alterados por sobre-expressão do gene ou ARN de interferência. Aqui, descrevemos um procedimento para diferenciar murino osso marrow em macrófagos que irão proporcionar um grande número de macrófagos em 7 dias para várias análises funcionais, como a proteômica 7, 8 transcriptômica, tráfico intracelular estuda 9, estudos dinâmicos 10, telas genéticos (RNAi) e triagem de drogas 11.
Declaração de Ética
O protocolo para manejo dos animais foi aprovado pelo Comitê de Ética institucional nosso Animal "Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Experimental Médico-Cirúrgica" (CFREMC, licença Projeto 10-300122013 para Eric Ghigo) da Universidade de Aix-Marseille de acordo com as regras Décret de N ° 87-848 de 1987/10/19. Os experimentos foram realizados na Faculté de Médecine de la Timone (número de autorização Experimentação 13,385 para Eric Ghigo).
1. Material e Meios de Cultura Preparação
2. Preparação de sobrenadantes de células L929
Nota: granulócitos-macrófagos colónia factor (GM-CSF) estimulante é necessária para induzir a diferenciação de células hematopoiéticas em macrófagos 12. L929 células produzem GM-CSF.
3. Bone Marrow-derivado do macrófago (BMDM) Preparação
Nota: O objectivo deste passo é o de remover contaminantes de células vermelhas do sangue, portanto, este passo deve ser realizado no prazo de 2 minutos, para evitar a alteração de células hematopoiéticas por o tampão de lise de glóbulos vermelhos.
Nota: O objetivo deste passo é eliminar o marro osso residentemacrófagos w por sua capacidade de aderir ao plástico tratados com cultura. Estes macrófagos residentes podem ser usados em outras experiências.
Nota: Monitorar periodicamente o crescimento de células com um microscópio invertido (passos 3,14-3,16). Macrófagos aderentes seráobservado após 3 dias de cultura.
4. BMDMs Colheita
Nota: Em geral, cerca de 6-7,5 x 10 7 macrófagos são obtidos a partir de 15 placas de Petri (100/20 mm) dos macrófagos. Há cerca de 4-5 x 10 6 macrófagos / placa de Petri (100/20 mm).
5. Armazenar BMDMs
O objectivo deste método é obter facilmente um grande número de macrófagos em poucos dias. A preparação de células da medula óssea é ilustrada na Figura 1. Ossos da perna foram coletadas e esmagado num almofariz. Uma vez que os macrófagos residentes foram removidos a partir da preparação de células de medula óssea, células da medula óssea foram incubadas com GM-CSF (Dia 0). Após 3 dias, as células, que foram rodada e não aderentes antes da cultura, começam a diferenciar-se em macróf...
O protocolo aqui descrito detalha um método para produzir grandes números de BMDMs. BMDM são células primárias e têm a função biológica e as propriedades dos macrófagos diferenciados a partir de monócitos, porque há madura, em contraste com as linhas celulares de macrófagos, que são imaturos. BMDMs podem ser utilizados para o rastreio genético (RNAi), a triagem de drogas, estudos funcionais, estudos de interação patógeno-hospedeiro e muitas outras áreas de investigação.
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Não há conflitos de interesse declarados.
Este trabalho foi apoiado pelo CNRS (PICS 2012-2014 a GE) e por uma bolsa da Regione Campania (LR n.5, 28.03.2002 para Giovanna Mottola). Filippo Conti é membro da Cooperação Científica Foundation'' Infectiopole Sud.'' Nicola Boucherit é um companheiro do Ministério Francês de Pesquisa e Tecnologia. As fontes de financiamento não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados, análise de dados, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
50 ml tubes | any supplier | n/a | |
15 ml tubes | any supplier | n/a | |
Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
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