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요약

대 식세포는 긴 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 구성 요소로 인식되고있다. 대식 세포와 미생물 사이의 상호 작용의 진화 유전 적, 생화학 적 측면에 관한 지식의 최근의 폭발은 대 식세포에 과학적인 관심을 갱신했다. 이 문서에서는 마우스 골수에서 대식 세포를 구별하는 방법을 설명합니다.

초록

대 식세포는 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 구성 요소이며, 그들은 때문에 그들의 강력한 살균 활동의 외국 침략자에 대한 방어의 첫 번째 라인이다. 대 식세포가 널리 몸 전체에 분포하고 림프 기관에 존재하는, 간, 폐, 위장관, 중추 신경계, 뼈, 피부. 때문에 그들의 재분할 건들은 생리적 및 병리 적 과정의 넓은 범위에 참여한다. 대 식세포는 미세 환경 변화를 인식하고 조직의 항상성을 유지하기 위해 수있는 매우 다양한 세포입니다. 수많은 병원체 생존에 복제 및 감염 인간과 동물 모두를 몸 전체에 전파하기 위해 트로이 목마로 대식 세포를 사용하는 메커니즘을 진화했다. 호스트 병원체 상호 작용의 진화 유전 적, 생화학 적 측면에 대한 관심이 최근의 폭발은 대 식세포에 대한 과학적인 관심을 갱신했다. 여기에서, 우리는 설명호스트 병원체 상호 작용을 공부뿐만 아니라 다른 프로세스 대식 세포의 큰 번호를 제공합니다 쥐의 골수에서 대 식세포를 분리 및 배양하는 절차.

서문

대식 세포 기능의 중요한 측면은 타고난 및 적응 면역에서의 역할입니다. 때문에 불활성 입자, 세균이나 기생충을 탐식하는 그들의 능력으로, 대식 세포는 외국 침략자에 대한 방어의 첫 번째 라인이다. 일단 내면화, 미생물은 phagolysosomes 내에서 분해된다. 대 식세포는 또한 T 림프구 등의 면역 세포에 신규 모집을위한 신호와 현재의 항원을 보낼 수 있습니다. 대 식세포는 단핵 세포에서 파생됩니다. 단핵 세포는 골수 줄기 세포로부터 골수에서 발생하고이 대 식세포로 분화 말초 혈액과 여러 조직으로 마이그레이션 할 수 있습니다. 그것은 건강한 성인 마우스는 다양한 장기와 조직 (표 1) 1, 2에 몸 전체에 분포되어 약 10 8 대 식세포가 포함되어있는 것으로 추정된다. 대 식세포 때문에 자신의 미세 환경의 3,4에 적응하는 능력의 큰 표현형과 기능의 다양성을 표시합니다. 가장 중요한 macrophage 숙박 시설은 미생물을 탐식하고 파괴하는 그들의 능력에 의해 정의됩니다 자신의 살균 활동이다. 식세포 반응은 미생물의 접촉에 의해 자극 된 복잡한 시그널링 네트워크의 활성화에 의해 정의되며, 따라서, 식세포는 다양한 자극에 응답하여 적절하게 유전자 발현을 변조한다. 식균 작용 한 후, 미생물은 phagolysosome라는 구조에서 제거되고 있지만, 많은 병원성 미생물 식세포 5의 살균 기능을 파괴 할 수있는 전략을 개발했습니다. 다른 미생물 종에 의해 이용되는 파괴 메커니즘의 다양성은 식세포 과정 6의 복잡성과 phagolysosome 생합성의 증거입니다. 감염성 질환은 주요 인간의 건강 문제, 그리고 수많은 메커니즘과 분자는 대 식세포의 항균 활동에 참여한다. 또한, 미생물에 의해 납치 된 살균 속성의 목표는 알 그대로 남아 있고, 따라서 전자가대식 세포에 대한 과학적인 관심을 갱신했다 호스트 병원체 상호 작용의 진화 유전 적, 생화학 적 측면에서 관심 XPLOSION. 현재 필드에서 연구의 대부분은 식세포 활성, 사이토킨 생산 및 산화 적 버스트의 조절에 기본 식세포 다를 대식 세포주에서 수행된다. 또한, 그들은 현미경 덜 적합하다. 상호 작용 식세포 - 병원균을 조사하기 위해 그것은 더 많은 생리적 기능을 나타내는 등 골수 유래 대 식세포 (BMDMs)와 같은 차 대식 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 이 대식 세포는 형질 전환 마우스에서 직접 분리하고, 같은 렌티 바이러스 형질 전환과 같은 새로운 기술의 가용성을 할 수 있기 때문에 또한,이 유전자 변형 BMDMs에서 작동 할 수 있으며, 자신의 유전자 발현 프로파일이 유전자 과발현 또는 RNA 간섭에 의해 변경 될 수 있습니다. 여기, 우리는 쥐의 뼈 M을 차별화하는 절차를 설명기능이 같은 단백질 체학 7, transcriptomics 8로 분석하여 다양한위한 7 일에서 대식 세포의 큰 번호를 제공합니다 식세포에 화살표, 세포 내 인신 매매는 9, 동적 스터디 10, 유전 스크린 (RNAi의) 11 심사 약물을 연구.

프로토콜

윤리 정책

규칙에 맞는 엑스 마르세유 대학에서 동물 처리를위한 프로토콜이 우리의 기관 동물 윤리위원회 "헌법위원회 Scientifique 뒤 센터 드 형성 등 드 공들인 실험 의학적 Chirurgical"의 승인을 받았다 (CFREMC, 에릭 Ghigo에 프로젝트 허가 10-300122013) 의 Décret N은 1987년 10월 19일의 87-848을 °. 실험은 Faculté 드 MEDECI​​NE 드 라 티모네 (에릭 Ghigo에 실험 허가 번호 13.385)에서 수행 하였다.

1. 재료 및 문화 미디어 준비

  1. 두 집게, 두 개의 가위, 두 수술 블레이드, 박격포와 유봉을 소독.
  2. 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 2 MM의 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린 / ㎖ 스트렙토 마이신 100 μg을 포함하는 완전한 DMEM를 얻습니다.
  3. 1X PBS를 얻기 위해 멸균 증류수로 10 배 PBS를 희석.
  4. 얼음처럼 차가운 1X PBS, 얼음처럼 차가운 완전한 DMEM, 완전한 DMEM의 워싱턴 주를 얻37 ° C.에 RMED

2. L929 세포 상층 액의 제조

  1. 37 ° C에서 완전한 DMEM에 (이십 175cm 2 플라스크) 5 % CO 2를 합류 할 L929 세포를 성장.

주 : 인자 (GM-CSF)를 자극하는 과립구 - 대 식세포 콜로니가 대 식세포 (12)에 조혈 세포의 분화를 유도하는 데 필요합니다. L929 세포는 GM-CSF를 생산하고 있습니다.

  1. 합류, 신선한 완전한 DMEM과 문화 매체를 교체하십시오. 10 일 동안 32 ° C, 5 % CO 2에 플라스크를 전송합니다.
  2. 수집, 수영장과 10 분 동안 750 XG에서 상층 액을 원심 분리기. 세포 펠렛을 폐기하십시오.
  3. -20 ℃에서 15 ML 튜브 및 저장소에 보관 상층 액

3. 뼈 식세포 (BMDM) 제조 예 골수 유래

  1. 자궁 전위에 의해 1 마우스를 희생.
    1. 실험을하는 동안 무균 수술 블레이드를 사용합니다. 70 % ALCO로 피부를 소독HOL. 각 뒷다리의 상단에 절개를하고 근육을 노출하는 발쪽으로 피부를 아래로 당겨.
    2. 뒷다리를 잘라, 멸균 가위 및 멸균 집게로 피부를 제거합니다. 살균, 얼음처럼 차가운 1X PBS (5 ㎖)를 포함하는 멸균 페트리 접시 (10분의 35 ㎜) 내 다리를 놓습니다.
    3. 멸균 가위와 집게로 뼈에 부착되어있는 살과 근육을 제거합니다.
  2. 얼음처럼 차가운, 살균 1X PBS (5 ㎖)를 포함하는 새로운 멸균 페트리 접시 (10분의 35 ㎜)에 뼈를 전송합니다. 5 ML 얼음처럼 차가운, 살균 1X PBS와 뼈를 두 번 씻으십시오.
  3. 5 ML 얼음처럼 차가운, 살균 1X PBS를 포함하는 멸균 박격포에 뼈를 전송합니다.
  4. 멸균 가위로 관절에서 대퇴골에서 경골을 잘라. 유봉을 사용하여 5 ㎖ 얼음처럼 차가운, 살균 1X PBS를 포함하는 멸균 박격포 부드럽게 뼈를 분쇄.
  5. 얼음처럼 차가운 15 ML 튜브에 뜨는을 수집합니다. 이 단계의 3 배를 반복합니다.
  6. 70 μm의 나일론 셀 스트라 통해 필터고체 조각을 제거하는 iner. 4 ℃에서 10 분 동안 450 XG에서 여과 액을 원심 분리기
  7. 조심스럽게 상층 액을 버린다. 30 초 동안 10 ㎖ 적혈구 세포 용해 버퍼에 펠렛을 떼어 놓다. 20 ㎖의 얼음처럼 차가운, 완전한 DMEM을 추가합니다.

주 :이 단계의 목적은 적혈구 오염 제거하는 것이다, 따라서,이 단계는 적혈구 세포 용해 완충액에 의해 조혈 세포의 변질을 방지하기 위해 2 분 이내에 수행해야한다.

  1. 4 ℃에서 10 분 동안 450 XG에 원심 분리기 조심스럽게 상층 액을 버린다. 37 ℃로 가온 한 20 ㎖ 완전한 DMEM에서 펠렛을 떼어 놓다
  2. 2 페트리 접시 (20분의 100 ㎜)로 분해 세포를 전송합니다. 37 ℃에서 4 시간 동안 그들을 품어
  3. 실온에서 50 ML 튜브에 상층 액을 수집합니다. 상주 대식 세포를 포함하는 요리를 폐기하십시오.

참고 :이 단계의 목적은 주민 뼈 MARRO을 제거하는 것입니다문화 처리 된 플라스틱을 준수 할 수있는 능력에 의해 w 식세포. 이러한 상주 식세포는 다른 실험에 사용될 수있다.

  1. 4 ℃에서 10 분 동안 450 XG에서 수집 된 상층 액을 원심 분리기 상층 액을 버린다.
  2. 10 ㎖의 15 % L929 세포의 상층 액을 포함하는 완전한 DMEM 부드럽게 펠렛을 떼어 놓다. 40 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다.
  3. 여과 액을 복구 할 수 있습니다. 140 ㎖의 15 % L929 휴대 미디어로 보충 된 완전한 DMEM에 수집 된 여과 액 (10 ㎖)를 추가합니다.
  4. 페트리 접시 (15 페트리 접시, 20분의 100 ㎜) 당 세포 현탁액 10 ㎖를 배포합니다. 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 품어.
  5. 3 일 동안 세포를 성장
  6. 10 ㎖의 15 % L929 보충 된 완전한 DMEM을 추가합니다. 4 추가 일 동안 세포를 품어.

참고 : 거꾸로 현미경으로 주기적으로 세포 성장을 모니터 (3.14-3.16 단계). 식세포가 될 것입니다문화의 3 일 후에 관찰했다.

4. 수확 BMDMs

  1. 뜨는을 제거합니다. 완전한 DMEM으로 BMDMs을 2 회 반복
  2. 5 ㎖를 37 ℃로 예열 된 완전한 DMEM 추가 부드럽게 고무 경찰관으로 긁어 BMDMs를 분리합니다.
  3. 10 분 450 XG에 50 ML 튜브와 원심 분리기에 BMDMs를 수집합니다. 조심스럽게 20 ML 완전한 DMEM으로 세포 펠렛을 떼어 놓다.
  4. 트리 판 블루의 존재에 BMDMs 카운트 (더 이상 10 % 이상 사망률이 관찰 될 수 없습니다).

참고 : 일반적으로, 약 6-7.5 × 10 7 대식 세포는 대 식세포의 15 페트리 접시 (20분의 100 ㎜)에서 얻을 수 있습니다. 약 4 ~ 5 × 10 6 대 식세포 / 페트리 접시 (20분의 100 밀리)가있다.

  1. 실험에 필요한 BMDMs를 준비합니다. 37 ° C에서 전체 미디어의 16 시간 후, 5 % CO 2, 대식 세포는 다시 지원을 준수합니다.

5. BMDMs 저장

  1. 고립 BMDMs (4.3 단계)를 수집합니다. 10 분 450 XG에 원심 분리기. 참고 : BMDMs은 액체 질소에 냉동 할 수있다.
  2. 각 앰풀에 / ㎖ 피펫 1 ㎖ 4 × 10 6 세포의 최종 농도 10 % DMSO 및 90 % FCS로 구성된 미디어를 동결을 Resuspend 세포 펠렛.
  3. 1 ° C / 분의 냉각 속도로 세포를 동결. 24 시간 후, 장기간 저장을 위해 액체 질소 용기에 앰플을 전송.

결과

이 방법의 목적은 쉽게 몇 일 대식 세포의 큰 숫자를 얻을 수 있었다. 골수 세포의 제조는도 1에 도시되어있다. 뒷다리의 뼈를 수집 및 박격포에서 격돌했다. 상주 식세포는 골수 세포 제제로부터 제거 된 후에, 골수 세포를 GM-CSF (0 일)와 함께 배양 하였다. 3 일 후에, 문화 전 라운드와 비 접착 있던 세포, 대 식세포로 분화 및 (그림 1A)을 준수하기 시작합니다. 세포 계측법 ...

토론

본원에 기재된 프로토콜은 BMDMs 다수 생산하는 방법을 상세. BMDM은 일차 전지이며 미성숙 대 식세포 세포주 달리, 성숙한 있기 때문에 생물학적 기능 및 단핵구로부터 분화 된 대식 세포의 특성을 갖는다. BMDMs는 유전자 검사 (RNAi의), 약물 스크리닝, 기능적 연구 기주 - 연구 및 조사의 많은 다른 분야에 사용될 수있다.

본원에 제시된 절차는 매우 간단하고 특수 장비를 필요로?...

공개

관심 없음 충돌 선언이 없습니다.

감사의 말

이 작품은 CNRS (PICS EG에 2012-2014)에 의해 Regione 캄파니아 (LR의 N.5, 지오 반나 모톨라에 2002년 3월 28일)에서 부여에 의해 지원되었다. 필리포 콘티 과학 협력 재단 'Infectiopole 수드의 동료입니다.'니콜라 Boucherit은 연구 및 기술에 대한 프랑스 정부의 동료입니다. 자금 출처는 연구 설계, 데이터 수집, 데이터 분석, 게시 할 수있는 의사 결정, 또는 원고 준비에 역할을했다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Material/EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
DMEMGibco Life Technologies21969-035
Fetal Calf SerumGibco Life Technologies10270
Penicillin/StreptomycinGibco Life Technologies15070
GlutamineGibco Life Technologies25030-024
PBS (10x)LonzaBEM515F
Red Blood Cell Lysis bufferSigmaR7757
Cell strainer 70 μm NylonBD Falcon352350
Cell strainer 40 μm NylonBD Falcon352340
50 ml tubesany suppliern/a
15 ml tubesany suppliern/a
Petri dishes (100/20 mm)any suppliern/aculture treated
Petri dishes (35/10 mm)any suppliern/a

참고문헌

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  12. Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).

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