La identificación de la interacción proteína-proteína en<em&gt; Drosophila</em&gt; Jefes adultas por Tandem Affinity purificación (TAP)

Resumen

Drosophila es famoso por su gran alcance de la manipulación genética, pero no por su idoneidad del análisis bioquímico en profundidad. Aquí presentamos un procedimiento basado en TAP para identificar socios que interactúan de cualquier proteína de interés a partir de cerebro de la mosca. Este procedimiento puede potencialmente conducir a nuevas vías de investigación.

Resumen

Pantallas genéticos realizados con Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) han hecho numerosos descubrimientos hito en el avance de las ciencias biológicas. Sin embargo, el uso de pantallas bioquímicos destinados a ampliar los conocimientos adquiridos en el análisis genético fue explorado recientemente. Aquí se describe un método para purificar el complejo de la proteína que se asocia con cualquier proteína de interés a partir de cabezas de moscas adultas. Este método toma ventaja del sistema de Drosophila GAL4/UAS para expresar una proteína cebo fusionado con una etiqueta tándem Purificación por Afinidad (TAP) en las neuronas de la mosca in vivo, y luego implementa dos rondas de purificación utilizando un procedimiento de punción similar a la establecida originalmente en de levadura ¹ para purificar el complejo de proteína de interacción. Al final de este procedimiento, se obtiene una mezcla de varios complejos de proteínas cuyas identidades molecular se puede determinar por espectrometría de masas. Validación de las proteínas candidatas se beneficiará de la resource y la facilidad de la realización de estudios de pérdida de función en las moscas. Enfoques similares se pueden aplicar a otros tejidos de la mosca. Creemos que la combinación de la manipulación genética y este enfoque proteómico en el sistema modelo de la mosca tiene un tremendo potencial para abordar los problemas fundamentales en el campo de la neurobiología y más allá.

Introducción

Definición de las vías moleculares o redes que median un proceso biológico en particular es uno de los objetivos fundamentales de la investigación biomédica. Fly genetistas han dependido en gran medida de la genética a plazo, especialmente modificador pantallas genéticos (tanto potenciadoras y pantallas supresoras), para identificar los factores que trabajan juntos, en paralelo con, o aguas arriba o aguas abajo de un gen de interés. Sin embargo, las pantallas de genética hacia adelante muchas veces fallan en identificar los genes esenciales que, cuando muta, causa la letalidad en las etapas tempranas del desarrollo, o los genes con redundancia funcional y una indemnización, cuya pérdida de la función única causa defectos sutiles que son difíciles de marcar. Una forma de superar esta dificultad es la detección de interacciones directas proteína-proteína. Durante más de una década, una creciente lista de métodos bioquímicos, incluyendo la levadura de dos híbridos, visualización de fagos, entrecruzamiento químico, Co-IP, Tandem Affinity purificación (TAP), etc. se han utilizado para investigar proteínas-proteína interacciones. Cada uno de estos enfoques tiene su propio conjunto de fortalezas y debilidades en cuanto a sensibilidad y especificidad. Entre ellos, el método de TAP permite la detección de la interacción física bajo condiciones casi fisiológicas, conserva la especificidad y la consistencia y ² incluye la capacidad de extender al análisis de alto rendimiento de ^3,4.

El método TAP fue desarrollado originalmente en levadura por colegas Rigautand ^1. En este método, una proteína de interés se expresa con una etiqueta de TAP. La etiqueta TAP alberga dos dominios de unión por afinidad independientes: una proteína de un dominio que se une a IgG y un dominio de unión a calmodulina. Los dos dominios están separados por una TEV (Tobacco Etch Virus) sitio de escisión. Tal combinación permite dos rondas independientes de purificaciones de afinidad para reducir suficientemente enlaces no específicos y enriquecen enlaces específicos ^1. Para este ejemplo, el método TAP es una muy poderosa method para identificar en las interacciones in vivo de una proteína dada, aunque la sobreexpresión de la proteína exógena puede hacer que sea más propensos a asociarse con proteínas que normalmente no complejo con su homólogo endógeno. Desde su desarrollo, el método TAP se ha aplicado en muchos otros sistemas, incluidos los sistemas celulares basados ​​en la cultura y otros ^5,6 sistemas modelo in vivo en ^6-9. Aquí se describe la adaptación del método TAP en Drosophila. En primer lugar, generar vectores pUAST-NTAP y pUAST-CTAP para facilitar la clonación y la fusión de la etiqueta TAP para el extremo N-o C-terminal del gen de interés. El TAP-etiquetados-UAS transgén se expresa entonces en el sistema nervioso bajo el control de un controlador de GAL4 neuronal ^10. A continuación, se recogerá un gran número de cabezas de moscas adultas, que tienen un alto contenido de células neuronales y son fáciles de separar de otras partes del cuerpo después de la congelación sobre la base de las diferencias de tamaño. Las cabezas de los adultos se homogeneizan y se aclaró bcentrifugaciones secuenciales y, y el sobrenadante está sujeto a un procedimiento de punción se describe a continuación.

Protocolo

1. Generar UAS-TAP-etiquetados moscas transgénicas

1. Generar pUAST-TAP-etiquetados construcciones de ADN.
   1. Decidir qué lado (N-o C-terminal) de la proteína cebo la etiqueta grifo deberá estar fusionada a, basada en la estructura / función de la proteína. Véase la discusión para más detalles.
   2. Subclónese la región de codificación de cDNA del gen de interés en los sitios de clonación múltiple (MCS) de los vectores pUAST-NTAP o pUAST-CTAP para generar N-o C-terminal de etiquetado transgenes UAS-TAP, respectivamente. Consulte la Figura 1 para los mapas detallados y sitios de restricción utilizables y marcos de lectura.
2. Generar UAS-TAP-etiquetados moscas transgénicas.
   1. Generar moscas transgénicas siguiendo protocolos estándar utilizando P-elemento de inserción mediada por ^11. Un número de servicios de inyección se encuentran disponibles comercialmente.
   2. Cruce GAL4 conductor neuronal (es decir BG380-GAL4) a cada línea transgénica individual y determinar los niveles de expresión de proteínasde cada línea por transferencia de western (con anticuerpo anti-peroxidasa de peroxidasa) y / o la inmunotinción (con anticuerpo anti-TAP). En general, se recomienda una línea transgénica con un nivel de expresión de la proteína que se encuentra cerca de la proteína endógena para los procedimientos de TAP. Véase la discusión para más detalles.
   3. PerformGAL4/UAS-based experimentos de rescate para confirmar la funcionalidad de los transgenes TAP-etiquetados si la pérdida de función de los mutantes de los genes de interés están disponibles. Elija un transgén que puede rescatar a la veracidad de los fenotipos mutantes para los siguientes experimentos TAP.

2. Preparar muestras de Procedimiento TAP

1. Generar una acción mosca que transmite tanto un controlador neuronal GAL4 (por ejemplo, BG380-Gal4) y el transgén de TAP-etiquetados elegido con el fin de facilitar la expansión de las muestras de la mosca. Recoger las progenies F1 de la GAL4 conductor y la cruz-UAS transgenes en los casos raros en que la combinación anterior hace que la supervivencia y el crecimiento de desventaja.
2. Recoger muestras a pequeña escala y optimizar condiciones lisis para solubilizar la proteína TAP-etiquetados.
   1. Hacer una serie de tampones de lisis utilizando una combinación de los detergentes no iónicos NP-40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%) y Triton X-100 (0,05-0,5%). Véase la Tabla 1 y la discusión para más información.
   2. En la parte superior de una almohadilla de CO2, utilice # 5 pinzas para diseccionar 20 cabezas adultas desde el transgén que expresa TAP moscas y recoger en un tubo de 1,5 ml para probar cada condición de tampón de lisis.
   3. Añadir 100 ul de tampón de lisis para las pruebas del tubo y homogeneizar las cabezas acariciando arriba y abajo con una mano de mortero de plástico, a continuación, añadir otro búfer pruebas de 100 ul.
   4. Girar la cabeza lisado en 21.500 xg durante 10 min (4 ° C), y separar el sobrenadante y el sedimento después de la centrifugación. Añadir 25 ul de tampón de carga 2x SDS al sedimento y tampón de carga de 10 ul 4x SDS a 30 ul de sobrenadante respectivamente.
   5. Hervir las dos muestras durante 5 min y analizarlos lado a-Lado utilizando SDS-PAGE y posterior transferencia de Western con el anticuerpo PAP. Determinar la solubilidad por la relación de los niveles de proteína PAT en sobrenadante frente a la pastilla.
3. Preparar la muestra en gran escala
   1. Expandir y recoger las moscas adultas.
      1. Ampliar las acciones neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene en botellas y voltear las botellas cada 3 días hasta 250 botellas acumulativos se utilizan para la recolección.
      2. Recoger 1-3 días de edad moscas adultas en 50 ml tubos cónicos, coloque el tubo en nitrógeno líquido inmediatamente a lo profundo del congelamiento de las moscas. Guarde las moscas en un -80 ° C congelador. Tenga en cuenta que el volumen de las moscas no debe superar los 2/3 del tubo de 50 ml.
   2. Recoger las cabezas de mosca (realizar este paso en la parte superior del hielo seco en polvo).
      1. Saque los tamices preenfriado y el mortero y la maja de la -80 ° C congelador y ponerlos en hielo seco, idealmente dentro de un gran cubo de hielo. Apila dos tamices de ensayo estándar USA con un número 25 en el the superior y N º 40 en la parte inferior.
      2. Tome las moscas congeladas y soltarlos en nitrógeno líquido y mantener las moscas allí por unos 10 minutos. Vortex o agitar los tubos vigorosamente para romper las cabezas, piernas y alas de los cuerpos.
      3. Vierta la mezcla en el tamiz superior, y luego sacudir los tamices vigorosamente mientras sujeta ambos tamices juntos. Después de cribado, los cuerpos se quedan en el tamiz superior, volar cabezas serán retenidos en el tamiz de fondo, y las piernas, alas, y otros escombros caerán al hielo seco. Separar los dos tamices y cuidadosamente transferir las cabezas de mosca al mortero frío.
   3. Homogeneizar las cabezas de mosca
      1. En la parte superior del hielo seco, moler las cabezas con el mortero y la mano del mortero a las partículas en polvo, y luego transferir el polvo a una de 15 ml de vidrio Dounce triturador de tejidos que se preenfriar en hielo.
      2. Medir el peso de la amoladora antes y después de la muestra de la cabeza se vertió en él, y luego calcular cuánto samp cabezale pesa. Un total de 6-15 gramos de cabezas de moscas será suficiente para cada experimento TAP ajustar en consecuencia a los niveles de expresión de la proteína. Añadir 15 ml de tampón de homogeneización enfriado con hielo (tampón de lisis optimizado en el paso 2.2) para el polvo y luego golpe con la mano de mortero de gran holgura hasta que sea fácil para los maja que suben y bajan. Mantenga el triturador de vidrio en el hielo en todo momento.
   4. Preparar el sobrenadante de TAP
      1. Transferir el homogeneizado a un tubo de centrífuga de alta velocidad y efecto durante 20 minutos a 50.000 xg ~ (4 ° C). Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de alta velocidad y repetir la centrifugación una vez más.
      2. Transferir el sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga y realizar una 40 min ~ 250.000 xg de centrifugado para eliminar aún más el sobrenadante. El sobrenadante está listo para los procedimientos de purificación por afinidad en tándem después de ultracentrifugación.

3. Purificación TAP

En las siguientes secciones se derivaron de la TAP laboratorio Séraphin protocol ¹² (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )

1. Realice IgG grano purificación por afinidad
   1. Preparar cordón de sefarosa de IgG, mientras que las muestras se centrifugaron. Lave 400 l 3x perlas de IgG en un tubo Falcon de 15 ml con 10 ml de tampón de lavado frío IgG. Para cada lavado, sacudir el tubo suavemente durante 2 minutos, y luego de girar las bolas a 1.000 xg durante 2 min. Al final del tercer lavado, eliminar el tampón y dejar sólo las perlas en el tubo.
   2. Transferir con cuidado el sobrenadante clarificado (~ 15 ml) en el tubo de 15 ml que contiene las perlas de IgG. Incubar las cuentas y mezcla lisado cerebral a 4 º C en un nutator durante 2 horas.
   3. Configurar una columna micro limpio y vacío con aproximadamente 15 ml de volumen total en el cuarto frío. Cargue la mezcla de glóbulos IgG vertiendo constantemente la mezcla en la columna, no trate de atrapar a cualquierburbujas de aire en el interior de la columna. Permitir que las perlas se asientan en la columna y el tampón para drenar lentamente por gravedad.
   4. Lavar la columna a fondo con 10 ml de tampón de lavado IgG fría después de todo el lisado cerebral ha fluido a través de la columna de IgG resuelto. Repita el lavado 2x. Nota: nunca deje que el cordón seco en el aire.
2. Realice TEV división
   1. Después del tercer lavado, lavar la columna de nuevo con 10 ml de tampón de disociación TEV. Este paso se prepara el cordón de IgG que secuestra el complejo de cebo para TEV división.
   2. Justo antes de la última gota de tampón de TEV está a punto de gotear, poner un tapón en la parte inferior de la columna para bloquear el flujo, añadir 1,3 ml de tampón de TEV que contiene 130 unidades de enzima TEV a la columna, y a continuación, tape de forma segura la parte superior de la columna. Asegúrese de que la columna se sella bien en ambos extremos.
   3. Gire la columna a 18 º C durante 2 horas para permitir que la enzima TEV para escindir el péptido en el lugar de TEV y suelte el WHI complejo proteicole dejando atrás la proteína Un péptido de dominio vinculado a las perlas de la IgG sepharose.
3. Realice Calmodulina grano purificación por afinidad
   1. Preparar las perlas Calmodulin mientras que las perlas de IgG se incubaron con la enzima de TEV. Lave 200 l perlas Calmodulin en unos 15 ml 3x tubo Falcon, cada vez con 10 ml de frío Calmodulina de tampón de unión. Para cada lavado, agite con cuidado el tubo durante 2 minutos en un nutator, y luego de girar las bolas a 1.000 xg durante 2 min. Al final del tercer lavado, saque todo el buffer y dejar sólo las perlas en el tubo.
   2. Al final de la incubación TEV (paso 3.2.3), devuelva la columna de la IgG de nuevo a la cámara frigorífica y déjelo a un derecho para arriba. Deje que los granos se conforman con 10 min.
   3. Quite la tapa superior y luego la tapa inferior y, a continuación, recoger el producto de escisión ml TEV 1,3 en un tubo Falcon de 15 ml. Deje que el buffer se drene completamente. Añadir un tampón de 200 l de TEV adicional a la columna para empujar hacia fuera el volumen muerto de la columna, recoger el fbaja en el mismo tubo.
   4. Añadir 4,5 ml de tampón de unión de calmodulina y 4,5 l 1 M de _CaCl2 al producto de escisión 1,5 ml de TEV recogido anteriormente. El _CaCl2 sirve para valorar el EDTA en el tampón de TEV. Transferir la mezcla de 6 ml al tubo que contenía las perlas de calmodulina y girar el tubo a 4 º C en un nutator durante 1 hora.
   5. Crear otra columna micro limpio y vacío con aproximadamente 10 ml de volumen total en el cuarto frío. Cargar la mezcla de glóbulos de calmodulina a la columna y dejar que se drene por gravedad.
   6. Cuando toda la solución ha fluido a través de la columna de calmodulina asentado, lavar la columna dos veces, cada una con 10 ml de calmodulina de tampón de unión frío. Nota: no molestar a los granos de calmodulina y tratar de mantener la superficie de las perlas tan planas como sea posible durante el lavado.
4. Eluir el complejo de cebo de la columna de calmodulina.
   Inmediatamente después del lavado, eluir la columna de la calmodulina con cinco fracciones de 200 l frío Calmodutampón de elución Lin. Para cada fracción, agregar suavemente 200 l de tampón de elución a la columna y recoger el eluido con una marcada 1,5 ml tubo Eppendorf. Repita este 4x.
5. Analizar el complejo de proteínas por SDS-PAGE
   1. Tomar una pequeña alícuota de cada una de las cinco fracciones (unos 30 l) y añadir tampón de carga SDS. Hervir las muestras durante 5 min y la carga de las muestras de lado a lado con la proteína de marcadores moleculares en un gradiente (4-15%) en gel de SDS-PAGE.
   2. Después de que las muestras han resuelto por completo en el gel, detener la electroforesis y teñir el gel con cualquier procedimiento coloidales sensibles basados-G-250 de Coomassie de tinción tales como 'plata azul' tinción ^13. La tinción con plata es opcional, pero no es preferible debido a que no es totalmente compatible con el análisis de espectrometría de masas posterior. Almacenar el resto del eluido en un congelador -80 ° C para su posterior análisis, tales como la espectrometría de masas para el descubrimiento de las identidades moleculares del complejo de proteína purificada. See discusión.

Resultados

Aquí se demuestra nuestro esfuerzo en la identificación de proteínas Highwire interaccionan en el cerebro de mosca. Highwire (Hiw) y sus homólogos de vertebrados e invertebrados son enormes ubiquitina ligasas que regulan el desarrollo y la reparación del sistema nervioso ^14. Ellos comparten una serie de dominios funcionales altamente conservadas. Sin embargo, sus acciones moleculares no están del todo claras. El trabajo realizado en gusano, mosca y el ratón condujo al modelo de trabajo actual que HIW f...

Discusión

Método de purificación por afinidad en tándem (PAT) ofrece un protocolo de purificación dual que permite el aislamiento y enriquecimiento de complejos de proteínas a través de dos etapas de purificación de afinidad independientes. El diseño de la etiqueta TAP no se limita a lo que se presenta en este protocolo, otros dominios y motivos de unión de proteínas también son aplicables si las condiciones del tampón se ajustan en consecuencia. Un buen ejemplo de otras etiquetas de TAP es la etiqueta GS-TAP, una com...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.S.A. standard test sieve No. 25	Fisher Scientific	04-881-18
U.S.A. standard test sieve No. 40	Fisher Scientific	04-881-21
Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml	Kimble Chase	885300-0015
IgG sepharose beads	Pharmacia	17-0969-01
Econo-column 0.7 cm x 20 cm	Bio-Rad	737-4721
Econo-column 0.5 cm x 15 cm	Bio-Rad	737-4716
Calmodulin beads	Stratagene	214303
Coors Mortar and Pestle	CoorsTek	60311
AcTEV Protease	Invitrogen	12575-015
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Protease Inhibitor Mix	Sigma	P8340