Protein-protein etkileşimi belirlenmesi<em&gt; Drosophila</emTandem Affinity Arıtma tarafından&gt; Adult Başlar (TAP)

Özet

Drosophila ama derinlemesine biyokimyasal analiz uygunluğu için, güçlü genetik manipülasyon ünlüdür. Burada sinek beyin ilgi herhangi bir proteinin etkileşim ortakları belirlemek için TAP-tabanlı bir prosedür mevcut. Bu prosedür, potansiyel araştırma yeni yollar yol açabilir.

Özet

Drosophila melanogaster (meyve sineği) kullanılarak yapılan genetik ekranlar biyolojik bilimler önceden sayısız kilometre taşı keşifler yaptık. Ancak genetik analiz edinilen bilgiye genişletmeyi amaçlayan biyokimyasal ekranlarının kullanımı sadece son zamanlarda araştırılmıştır. Burada protein kompleksi arındırmak için bir yöntem tarif erişkin sinek başkanlarının ilgi herhangi bir protein ile ilişkilendirir. Bu yöntem, in vivo nöron uçucu bir Tandem Affinity saflaştırma (TAP) etiketi ile ikame edilmiş bir yem proteini ifade etmek için Drosophila GAL4/UAS sistemi yararlanır ve daha sonra ilk kurulan benzer bir prosedür kullanılarak TAP arıtma iki tur uygular etkileşimli protein kompleksinin saflaştırılması için maya ^1. Bu işlemin sonunda, çok sayıda protein kompleksleri oluşan bir karışım olan bir moleküler kimlikleri kütle spektrometresi ile belirlenebilir elde edilir. Aday proteinlerin Doğrulama r yararlanacakesource ve sinekler kaybı fonksiyon-çalışmaları gerçekleştirme kolaylığı. Benzer yaklaşımlar, diğer uçucu dokulara uygulanabilir. Biz sinek model sistemde genetik manipülasyonlar ve bu proteomik yaklaşımın birleşimi nörobiyoloji alanında ve ötesinde temel sorunlarla mücadele için muazzam bir potansiyele sahip olduğuna inanıyoruz.

Giriş

Belirli bir biyolojik süreç aracılık moleküler yollar veya ağları tanımlama biyomedikal araştırmanın nihai hedeflerinden biridir. Fly genetikçiler, özellikle paralel olarak, birlikte çalışmak, ya yukarı ya da ilgi bir genin aşağı faktörleri tespit etmek, genetik ekranlar (arttırıcı ve baskılayıcı ekranlar) niteleyici, ileri genetik temeline bağlıydı var. Ancak, ileriye genetik ekranlar çoğu kez mutasyona uğradığı zaman, kimin fonksiyon kaybı sadece puan zor ince kusurlarına neden fonksiyonel fazlalık ve tazminat ile erken gelişim aşamalarında öldürücülüğü, ya da genlerin neden olan, gerekli genleri tanımlamak için başarısız. Bu zorluğun üstesinden gelmek için bir yolu direkt protein-protein etkileşimleri için taranmasıdır. Daha fazla on yıl için, vb maya iki-hibrid, faj gösterimi, kimyasal olarak çapraz bağlanma, Co-IP, Tandem Affinity saflaştırılması (TAP), dahil olmak üzere, biyokimyasal yöntemler, giderek artan bir listesi. proteini incelemek için kullanılmıştır-Protein etkileşimleri. Bu yaklaşımların her biri güçlü ve duyarlılık ve özgüllük açısından zayıflıkları kendi belirledi. Bunlar arasında, TAP yöntem olup, yakın fizyolojik koşullar altında fiziksel etkileşimi tespiti sağlar özgüllük ve tutarlılık ² koruyan ve ^3,4 analiz, yüksek verim için genişletmek için de içerir.

TAP yöntem aslında Rigautand arkadaşları ¹ tarafından maya geliştirilmiştir. Bu yöntemde, ilgi konusu bir protein, TAP etiketi ile ifade edilir. Bir Protein IgG bağlanan bir etki ve Kalmadulin bağlanma alanı: TAP etiketi iki bağımsız afinite bağlanma alanlarını barındırır. Bu iki etki, bir TEV (Tütün Etch Virüsü) yarılma sitesi ile ayrılır. Afinite arındırmalardan bağımsız iki mermi yeterince spesifik olmayan bağlamaları azaltmak ve belirli bağlamaları ¹ zenginleştirmek için böyle bir kombinasyon sağlar. Bu örnek için, TAP yöntem çok güçlü bir metoksidışsal proteini aşırı ifade, normal olarak endojen muadili ile kompleks yapma proteinler ile ilişkilendirmek için daha eğilimli hale getirebilir, ancak, belirli bir proteinin in vivo etkileşim içinde tespit d. Gelişimi bu yana, TAP yöntem, hücre-kültür temelli sistemler ^5,6 ve in vivo model sistemlerinde ^6-9 de dahil olmak üzere pek çok diğer sistemler de uygulanmıştır. Burada Drosophila TAP yöntemin adaptasyonu açıklar. İlk olarak, ilgi konusu genin N-veya C-terminali ya da üzere TAP etiketinin klonlama ve birleşmeyi kolaylaştırmak için pUAST-NTAP ve pUAST-CTAP vektörleri üretir. UAS-TAP-etiketli transgen daha sonra bir nöronal GAL4 sürücü ¹⁰ kontrolünde sinir sisteminde ifade edilir. Daha sonra, yetişkin sinek kafaları çok sayıda nöral hücre içeriği yüksek olan ve büyüklüğü farklılıklara göre dondurucu sonra diğer vücut parçaları ayırmak kolay olan, toplanacaktır. Yetişkin kafaları homojenize ve temizlenir b vardıry ardışık santrüfüj ve süpernatan, aşağıda tarif edilen bir prosedüre TAP tabidir.

Protokol

1.. UAS-TAP-etiketli Transgenik Sinekler üret

1. PUAST-TAP-etiketli DNA yapıları oluşturur.
   1. (N-veya C-ucu) yem proteinin TAP etiket protein yapı / fonksiyon esas alınarak, kaynaşık hangi tarafı karar. Daha fazla ayrıntı için tartışma bakın.
   2. Sırasıyla N-ya da C-terminal-etiketli UAS-TAP transgenlerin oluşturmak için pUAST-NTAP veya pUAST-CTAP vektörlerin birden fazla klonlama bölgesi (MCS) içine ilgi konusu genin cDNA kodlama bölgesini alt-klonlanmıştır. Ayrıntılı haritalar ve kullanışlı kısıtlama siteleri ve okuma çerçeveleri için Şekil 1'e bakınız.
2. UAS-TAP-etiketli transgenik sinekler oluşturun.
   1. P-eleman-aracılı ekleme ¹¹ kullanılarak standart protokollere aşağıdaki transgenik sinekler oluşturun. Enjeksiyon hizmetleri bir ticari olarak mevcuttur.
   2. Her bir transjenik çizgi için nöronal GAL4 sürücü (örneğin BG380-GAL4) çapraz ve protein ekspresyon seviyelerini belirlemekBatı (Peroksidaz anti-peroksidaz antikoru) ile lekeleme ve / ya da (anti-TAP antikoruyla) immunosteyn etme ile her bir satırın. Genel olarak, endojen protein yakın olan bir protein ekspresyon seviyesine sahip bir transgen doğru, TAP işlemleri için tavsiye edilir. Daha fazla ayrıntı için tartışma bakın.
   3. Ilgi konusu genlerin kaybı fonksiyon-mutantları kullanılabilir olup olmadığını TAP-etiketli transgenlerin işlevselliğini teyit etmek için kurtarma deneyler PerformGAL4/UAS-based. Esas olarak şu TAP deneyler için, mutant fenotipleri kurtarma bir transgen seçin.

2. TAP Prosedür Örnekleri hazırlayın

1. Bir nöronal GAL4 sürücüsü (örneğin BG380-Gal4) ve sinek örneklerinin genişlemesini kolaylaştırmak için seçilen TAP-etiketli transgenini hem taşıyan bir sinek stok oluşturmak. GAL4 sürücü ve yukarıdaki kombinasyonu hayatta kalma ve büyüme dezavantajına neden nadir durumlarda UAS-transgen haç F1 yavrularıyla toplayın.
2. Küçük ölçekli örnekleri toplamak ve TAP-etiketli protein eritebilmek için parçalama durumunu optimize eder.
   1. Noniyonik deterjanlar NP-40 (% 0.1-1), NaDOC (% 0.1-1) ve Triton X-100 (% 0.05-0.5) oluşan bir kombinasyon kullanılarak parçalama tampon bir dizi yapın. Daha fazla bilgi için Tablo 1 ve açıklamalara bakın.
   2. CO2 yastığı üstüne, sinekler ifade TAP transgenden 20 yetişkin kafaları incelemek ve her lizis tamponu koşulu sınamak için 1.5 ml tüp onları toplamak için # 5 forseps kullanın.
   3. Tüp 100 ul test lizis tamponu ekleyin ve başka bir 100 ul test tamponu ekleyin, sonra yukarı okşayarak tarafından ve plastik bir havan tokmağı ile aşağı kafaları homojenize.
   4. 10 dakika (4 ° C) 21,500 x g de baş lizat Spin ve santrifüjlemeden sonra süpernatan ve topak ayırın. Sırasıyla, 30 ul süpernatan için pelet ve 10 ul 4x SDS yükleme tamponu 25 ul 2 x SDS yükleme tamponu ekleyin.
   5. 5 dakika için iki numune kaynatılır ve yan analizTarafı PAP antikoru ile yapılan SDS-PAGE ve Western Blot daha sonra kullanılmıştır. Pelet vs süpernatan içinde TAP-protein seviyelerinin oranı ile çözünürlüğünü belirlemek.
3. Büyük ölçekli bir örnek hazırlayın
   1. Genişletin ve yetişkin sinekler toplamak.
      1. Şişelerde neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene stok genişletmek ve birikimli 250 şişe kadar her 3 gün toplama için kullanılan şişe çevirin.
      2. Toplayın 1-3 gün yetişkin 50 ml konik tüpler içine uçar, hemen derin dondurucuda sinekler sıvı azot içinde tüp koymak. -80 ° C derin dondurucuda saklayın sinekler. Sineklerin hacmi 50 ml tüp yaklaşık 2/3 'ünü geçmemelidir unutmayın.
   2. (Toz kuru buz üstüne bu adımı gerçekleştirmek) sinek kafaları toplayın.
      1. Önceden soğutulmuş elekler ve -80 ° C dondurucu havan dışarı atın ve ideal büyük bir buz kovası içinde, kuru buz koydu. Th üzerinde No: 25 sayılı iki ABD standart test elekleri Stacke üst ve alt No: 40.
      2. Donmuş sinekler dışarı atın ve sıvı azot içinde bırakın ve yaklaşık 10 dakika boyunca orada sinekler tutmak. Vortex veya organları başkanları, bacaklarını ve kanatlarını kırmak için şiddetle tüpler sallayın.
      3. En iyi eleğe dökün ve her ikisi de bir arada tutarken elekler daha sonra kuvvetli bir şekilde elekler sallayın. Eleme sonra, organları, üst elek üstünde kalmak kafaları alt elek üzerinde muhafaza edilecektir sinek ve bacaklar, kanatlar, ve diğer enkaz kuru buz düşecek olacaktır. İki elekler ayırın ve dikkatlice soğuk harç sinek başlarını aktarmak.
   3. Sinek kafaları homojenleştiriniz
      1. Kuru buz üzerine, buz üzerinde önceden soğutulmuş bir 15 ml bir cam Dounce doku öğütücü için tozu aktarmak sonra, toz parçacıkları için harç ve havan tokmağı ile kafaları öğütülür.
      2. Kafa numune içine döküldü önce ve sonra değirmeni ağırlıklarını ölçmek, ve sonra ne kadar kafa Samp hesaplamakle ağırlığındadır. Uçucu kafaların 6-15 gram toplam proteinin ekspresyon seviyelerine göre ayarlanması her TAP deneme için yeterli olacaktır. Pestle aşağı yukarı gidip için kolay kadar toz buz-soğuk homojenizasyon tampon 15 ml (adım 2.2 optimize lizis tamponu) ekleyin ve ardından büyük boşluk tokmak ile inme. Her zaman buz üzerinde cam değirmeni tutun.
   4. TAP için süpernatant hazırlayın
      1. ~ 50,000 x g'de (4 ° C) 'de 20 dakika boyunca yüksek hızlı bir santrifüj tüpüne ve spin Homojenat aktarın. Yeni bir yüksek hızlı santrifüj tüpüne süpernatant aktarın ve santrifüj bir kez daha tekrarlayın.
      2. Bir ultrasantrifüjdeki tüp süpernatant aktarın ve daha süpernatant temizlemek için bir 40 dk ~ 250,000 xg sıkma gerçekleştirin. Süpernatan ultrasantrifüj sonra tandem afinite saflaştırma işlemleri için hazırdır.

3. TAP Arıtma

Aşağıdaki bölümlerde Séraphin laboratuvar TAP türetilmiştir protocol ¹² (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )

1. IgG boncuk afinite saflaştırma gerçekleştirmek
   1. Numuneler santrifüj edilmektedir sırasında IgG sepharose boncuk hazırlayın. 10 ml soğuk IgG yıkama tamponu ile bir 15 ml Falcon tüpü içerisinde 400 ul boncuk IgG 3x yıkayın. Her yıkama için, 2 dakika boyunca hafifçe tüp kaya, ve daha sonra başka bir 2 dakika boyunca 1.000 xg'de boncuk aşağı spin. Üçüncü yıkama sonunda, tamponunu çıkarın ve tüp içinde sadece boncuk bırakın.
   2. Dikkatlice IgG boncuklar içeren 15 ml tüp içine temizlenmiş süpernatan (~ 15 mi) aktarın. 2 saat boyunca bir nutator 4 º C'de boncuk ve beyin lizat karışımı inkübe edin.
   3. Soğuk odada yaklaşık 15 ml toplam hacim ile temiz ve boş mikro sütun kurmak. Sürekli sütuna karışımı dökerek IgG boncuk karışımı yükleyin; herhangi bir tuzak değil deneyinhava sütun içinde kabarcıklar. Boncuklar yavaş yavaş yerçekimi akışı ile tahliye sütun ve tampon yerleşmek için izin verin.
   4. Beyin lizat bütün yerleşik IgG sütun aktıktan sonra soğuk IgG yıkama tamponu, 10 ml ile iyice sütunu yıkayın. Yıkama 2x tekrarlayın. Not: Havada boncuk kuru izin vermeyiz.
2. TEV bölünme gerçekleştirin
   1. Üçüncü yıkamadan sonra, 10 ml TEV yarılma tamponu ile tekrar sütun yıkayın. Bu adım TEV bölünme için yem kompleksi sequestrates IgG boncuk hazırlar.
   2. TEV tamponun son damla damla dışarı akışını engellemek için sütunun alt kısmında bir kapak koymak, kolona TEV enzimin 130 birimlerini ihtiva eden 1.3 ml tampon TEV ekleyin ve güvenli bir üst kapak üzere hemen önce sütun. Sütun her iki uçta da kapalı olduğundan emin olun.
   3. TEV enzim TEV yerinde peptidi ve protein kompleksi, WHI serbest bırakmak için izin vermek için 2 saat boyunca 18 ° C'de sütun döndürmele, proteinin arkasında IgG sefaroz boncuklara bağlanan bir etki peptidi bırakır.
3. Kalmoduline boncuk afinite saflaştırma gerçekleştirmek
   1. IgG boncuklar TEV enzim ile inkübe edilir ise Kalmoduline boncuk hazırlayın. Soğuk kalmodulin bağlama tamponu içinde 10 ml bir 15 ml Falcon tüpü 3x, her zaman 200 | il boncuk Kalmoduline yıkayın. Her bir yıkama için, yumuşak bir nutator 2 dakika boyunca tüp kaya, ve daha sonra 2 dakika boyunca 1000 x g'de boncuk aşağı doğru döndürün. Üçüncü yıkama sonunda, bütün tamponu çıkarmak ve tüp içinde, sadece boncuk bırakın.
   2. TEV inkübasyon (adım 3.2.3) sonunda, geri soğuk odaya IgG sütun dönmek ve yukarı doğru ayarlayın. Boncuklar 10 dakika dinlendiriniz.
   3. En iyi kap ve daha sonra alt kapak kaldırma ve daha sonra bir 15 ml Falcon tüpüne 1.3 ml TEV yarılma ürünü toplamak. Tampon tamamen tahliye edelim. Sütunun bir ölü hacmi dışarı itmek için kolona ilave bir 200 ul TEV tampon ekleme, f toplamakaynı tüpte düşük-out.
   4. Yukarıda toplanan 1.5 ml TEV yarılma ürünü tampon ve 4.5 ul 1 M CaCl ₂ bağlayıcı kalmodülin 4.5 ml ilave edilir. _CaCl2 TEV EDTA tampon maddesi içinde titre hizmet etmektedir. Kalmodulin boncuklar içeren tüpe 6 mi karışımı aktarın ve 1 saat boyunca bir nutator 4 ° C'de tüp döndürün.
   5. Soğuk odada yaklaşık 10 ml toplam hacim ile başka temiz ve boş mikro sütun kurmak. Kolona Kalmoduline boncuk karışımı Yük ve yer çekimi ile akmasını sağlar.
   6. Bütün çözelti, yerleşmiş Kalmoduline kolondan akmıştır zaman, soğuk bağlama tamponu kalmodülin, 10 ml ile kolondan iki kez, her biri yıkayın. Not: Kalmoduline boncuk rahatsız etmemek ve yıkama sırasında mümkün olduğunca düz boncukların yüzeyini tutmaya çalışın.
4. Kalmoduline kolonundan yem kompleksi Zehir.
   Sağ yıkandıktan sonra, 200 ul soğuk Calmodu beş fraksiyonları ile Kalmoduline Kolonu akıtmaklin elüsyon tampon çözeltisiyle ayrılmıştır. Her bir kısmı için, hafifçe kolona elüsyon tampon 200 ul ekleyin ve belirgin bir 1.5 ml Eppendorf tüpü ile eluatın toplar. Bu 4x tekrarlayın.
5. SDS-PAGE ile protein kompleksi analiz
   1. Beş fraksiyon (yaklaşık 30 ul) her birinden küçük bir kısım alın ve SDS yükleme tamponu ilave edin. 5 dakika için kaynatılır ve örnekleri gradyanı (% 4-15) SDS-PAGE jel içinde protein moleküler işaretleri ile numuneleri yan yana yükleyin.
   2. Numuneler tam olarak jel içinde çözüldü sonra elektroforez durdurmak ve bu ¹³ boyama 'mavi gümüş' olarak bir G-250 bazlı duyarlı koloidal Coomassie lekeleme işlemleri ile jel leke. Bu daha sonraki kütle spektrometresi analizleri ile tam uyumlu değil çünkü Gümüş boyama tercih isteğe değil ama. Bu tür saflaştırılmış protein kompleksinin moleküler kimliklerini açığa çıkarmak için kütle spektrometrisi gibi daha fazla analiz için bir -80 ° C dondurucu içinde, sıyırma sıvısının geri kalanını saklayın. See tartışma.

Sonuçlar

Burada sinek beyinde Highwire-etkileşim proteinleri tanımlamak bizim çaba göstermektedir. Highwire (HIW) ve omurgalı ve omurgasız homologlarını sinir sistemi ¹⁴ gelişimini düzenleyen ve onarım büyük ubiquitin ligaz bulunmaktadır. Bunlar, yüksek oranda muhafaza edilmiş işlevsel sahaların bir dizi paylaşır. Ancak, moleküler eylemler tamamen açık değildir. Solucan yapılan iş, sinek ve fare geçerli çalışma modeline neden olduğu bir E3 ligaz gibi ve geçiş süresi ve hücre tipine ?...

Tartışmalar

Tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemi, iki bağımsız afinite saflaştırma adımları üzerinden izole edilmesini ve protein kompleksleri zenginleştirme sağlayan bir çift saflaştırma protokolü bulunmaktadır. TAP etiketinin tasarımı bu protokolde yer ne sınırlı değildir tampon şartları buna göre ayarlanır ise, başka bir protein bağlayıcı etki ve motifleri de geçerlidir. Diğer TAP etiketlerin iyi bir örnek GS-TAP etiketi, bir G-proteinine ait bir arada ve kültürlenmiş memeli hücre çizg...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.S.A. standard test sieve No. 25	Fisher Scientific	04-881-18
U.S.A. standard test sieve No. 40	Fisher Scientific	04-881-21
Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml	Kimble Chase	885300-0015
IgG sepharose beads	Pharmacia	17-0969-01
Econo-column 0.7 cm x 20 cm	Bio-Rad	737-4721
Econo-column 0.5 cm x 15 cm	Bio-Rad	737-4716
Calmodulin beads	Stratagene	214303
Coors Mortar and Pestle	CoorsTek	60311
AcTEV Protease	Invitrogen	12575-015
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Protease Inhibitor Mix	Sigma	P8340