단백질 - 단백질 상호 작용을 확인<em&gt; 초파리</em탠덤 선호도 정화로&gt; 성인 머리 (TAP)

요약

초파리는하지만 깊이있는 생화학 적 분석의 적합성에 대한, 강력한 유전자 조작으로 유명합니다. 여기에서 우리는 파리의 뇌에서 관심의 단백질의 상호 작용 파트너를 식별 할 수있는 TAP 기반의 절차를 제시한다. 이 절차는 잠재적으로 연구의 새로운 길을 초래할 수 있습니다.

초록

초파리 melanogaster의 (초파리)를 사용하여 실시 유전 화면은 생명 과학의 발전에 많은 이정표 발견을 만들었습니다. 그러나, 유전자 분석에서 얻은 지식을 연장 겨냥 생화학 스크린의 사용은 단지 최근 탐구 하였다. 여기에서 우리는 단백질 복합체를 정화 할 수있는 방법을 설명하는 성인 플라이 헤드 관심의 단백질과 동료. 이 방법은 생체 내에서 비행 신경에있는 탠덤 선호도 정화 (TAP) 태그와 융합 미끼 단백질을 발현하는 초파리 GAL4/UAS 시스템을 활용하고 원래 년에 설립 된 것과 유사한 TAP 절차를 사용하여 정화의 두 라운드를 구현 상호 작용하는 단백질 복합체를 정제하는 효모 ^1. 이 절차의 끝에서, 다중 단백질 복합체의 혼합물을 그 분자 신원 질량 분석법에 의해 결정될 수있다 얻어진다. 후보 단백질의 유효성 검사는 R 도움이됩니다esource과 파리에서 손실의 기능 연구를 수행의 용이성. 유사한 접근법이 다른 플라이 조직에 적용될 수있다. 우리는 비행 모델 시스템에서 유전자 조작이 단백질 체학 접근 방식의 조합은 신경 생물학 분야와 넘어 근본적인 문제를 다루기위한 엄청난 잠재력을 보유하고 있다고 생각합니다.

서문

특정 생물 학적 과정을 중재하는 분자 경로 또는 네트워크를 정의하는 것은 생물 의학 연구의 궁극적 인 목표 중 하나입니다. 비행 유전 학자, 특히 병렬로 함께 작동, 또는 상류 또는 그 유전자의 하류 요인을 식별하는 유전자 화면 (증강 및 회로 화면을 모두) 수정, 앞으로 유전학에 크게 의존했다. 그러나, 앞으로 유전학 화면은 종종 변이 된 경우, 그 손실 함수의 유일한 득점하기 어려운 미묘한 결함의 원인이 기능 중복 및 보상 초기 발달 단계에서 치사, 또는 유전자를 일으키는 원인이되는, 필수 유전자를 확인하기 위해 실패합니다. 이러한 어려움을 극복하는 방법 중 하나는 직접 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 화면이다. 이상 10 년 동안 등 효모 두 하이브리드, 파지 디스플레이, 화학 가교, 공동 IP, 탠덤 선호도 정화 (TAP), 등의 생화학 적 방법의 성장 목록. 단백질을 조사하기 위해 사용되어왔다- 단백질 상호 작용. 각각의 방법은 장점과 민감도와 특이도에 관해서 약점 자체 집합이 있습니다. 그 중에서도, TAP 방식은, 거의 생리적 조건 하에서 물리적 상호 작용의 검출을 허용 특이성 및 ^{일관성이 유지되고 3,4 분석} 높은 처리량을 확장 할 수있는 능력을 포함한다.

TAP 방법은 원래 Rigautand 동료 ^(1)에 의해 효모에 개발되었다. 이 방법에서는, 그 단백질은 TAP 태그로 표현된다. 단백질의 IgG에 결합 도메인과 칼 모듈 린 결합 도메인 : TAP 태그는 두 개의 독립적 인 친 화성 결합 도메인을 항구. 두 도메인은 TEV (담배 식각 바이러스) 절단 부위로 구분됩니다. 선호도 않는 정화의 두 개의 독립적 인 라운드가 충분히 특이 현상이 바인딩을 줄이고 특정 바인딩 ^1을 풍성하게하는 그런 조합 할 수 있습니다. 이것은 예를 들어, TAP 방식은 매우 강력하다 메 톡시외래 단백질을 과발현하는 것은 일반적으로 그 내생 대응 복잡한하지 않는 단백질과 연결하기가 더 많은 경향이 만들 수 있지만, 특정 단백질의 생체 내 상호 작용을 식별하기 위해 개발. 개발 이후, TAP 방법은 세포 배양 기반 시스템 ^5,6 및 기타 생체 내 모델 시스템 ^6-9 포함하여 많은 다른 시스템에 적용되었습니다. 여기에서 우리는 초파리의 TAP 방법의 적응을 설명합니다. 우리는 먼저 그 유전자의 N-또는 C-말단 하나에 TAP 태그의 복제 및 융합을 촉진하기 위해 pUAST-NTAP 및 pUAST-CTAP 벡터를 생성합니다. UAS-TAP-태그 된 트랜스이어서 신경 GAL4 드라이버 ^(10)의 제어하에 신경계에서 발현된다. 다음으로, 성인 플라이 헤드의 다수의 신경 세포의 높은 함량을 가지고 사이즈 차이에 기초하여 고정한 후 다른 신체 부위로부터 분리하기 쉽고, 이는 모아질 것이다. 성인 머리 균질화 지울 B입니다Y 연속 centrifugations, 상층 액은 아래에 설명 TAP 절차의 적용을받습니다.

프로토콜

1. UAS-TAP-태그 형질 전환 파리를 생성

1. pUAST-TAP-태그 DNA 구조를 생성합니다.
   1. (N-또는 C-말단) 미끼 단백질의 TAP 태그는 단백질의 구조 / 기능을 기반으로 융​​합되어야하는 가로 결정한다. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오.
   2. 각각 N-또는 C-말단 태그가 UAS-TAP의 도입 유전자를 생성하는 pUAST-NTAP 또는 pUAST-CTAP 벡터의 여러 복제 사이트 (MCS)로 관심의 유전자의 cDNA를 코딩 영역을 서브 클론. 상세한지도와 가능한 제한 사이트 및 독서 프레임의 그림 1을 참조하십시오.
2. UAS-TAP-태그 형질 전환 초파리를 생성합니다.
   1. P 요소 매개 삽입 ^(11)를 이용하여 표준 프로토콜을 다음과 형질 전환 초파리를 생성합니다. 사출 서비스의 개수는 시판되고있다.
   2. 각각의 형질 전환 라인에 신경 GAL4 드라이버 (즉 BG380-GAL4)를 건너 단백질 발현 수준을 결정서부 (퍼 옥시 다제 안티 퍼 옥시 다제 항체) 얼룩 및 / 또는 (안티 - TAP 항체) 면역 염색하여 각 라인의. 일반적으로, 내인성 단백질에 가까운 단백질 발현 수준이 유전자 변형 라인은 TAP 절차에 권장됩니다. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오.
   3. 그 유전자의 기능 상실 돌연변이 체를 사용할 수있는 경우 TAP-태그 도입 유전자의 기능을 확인하는 구조 실험을 PerformGAL4/UAS-based. 실질적으로 다음 TAP 실험의 돌연변이 표현형을 구출 할 수있는 유전자를 선택합니다.

2. TAP 절차에 대한 샘플을 준비

1. 신경 GAL4 드라이버 (예 : BG380-인 Gal4) 및 비행 샘플의 확장을 용이하게하기 위해 선택 TAP-태그 유전자를 모두 전달하는 비행 주식을 생성합니다. GAL4 드라이버와 위의 조합이 생존과 성장 단점이 발생 드문 경우 UAS - 유전자 십자가의 F1의 자손을 수집합니다.
2. 작은 규모의 샘플을 수집하고 TAP - 태그 단백질을 가용화 용해 상태를 최적화 할 수 있습니다.
   1. 비이 온성 세제 NP-40 (0.1-1 %), NaDOC (0.1-1 %) 및 ​​트리톤 X-100 (0.05-0.5 %)의 조합을 사용하여 용균 버퍼들의 시리즈를 만든다. 자세한 내용은 표 1과 설명을 참조하십시오.
   2. CO2 패드의 위에, 파리를 표현하는 TAP의 유전자에서 20 성인 머리를 해부하고 각 용해 버퍼 상태를 테스트하기 위해 1.5 ML 튜브에서 그들을 수집 # 5 집게를 사용합니다.
   3. 튜브에 100 ㎕ 시험 용해 버퍼를 추가하고 또 다른 100 ㎕ 테스트 버퍼를 추가 한 다음, 최대 쓰다듬어에 의해 플라스틱 유 봉 아래로 머리를 균질화.
   4. 10 분 (4 ℃)를 위해 21,500 XG에서 헤드 해물 스핀, 원심 분리 후 상등액과 펠렛을 분리합니다. 각각 상층 액의 30 UL에 펠릿 10 UL 배 SDS 로딩 버퍼에 25 UL 2X SDS 로딩 버퍼를 추가합니다.
   5. 5 분 동안 두 개의 샘플을 삶아 나란히 그들에게 분석측 PAP 항체 SDS-PAGE 이후 서양의 얼룩을 사용하여. 펠릿 VS 상청액 TAP-단백질 수준의 비율에 의해 용해도를 결정한다.
3. 큰 규모의 샘플을 준비
   1. 확장 및 성인 파리를 수집합니다.
      1. 병 neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene 주식을 확장하고 누적 250 병까지 3 일마다이 컬렉션에 사용되는 병을 플립.
      2. 수집 1~3일 오래된 성인 50 ML 원뿔 튜브에 파리, 즉시 냉동이 파리에 액체 질소에 튜브를 넣어. -80 ° C 냉동고에 파리를 저장합니다. 파리의 부피가 50 ㎖ 튜브의 2 / 3를 초과하지 않아야합니다.
   2. (분말 드라이 아이스의 상단에이 단계를 수행) 플라이 헤드를 수집합니다.
      1. prechilled 체 및 -80 ° C 냉동고에서 박격포와 유봉을 가지고 이상적으로 큰 얼음 양동이 안에, 드라이 아이스에 넣어. 일에 제 25 호 두 개의 미국 표준 시험 체 스택전자의 상단과 하단에있는 제 40 호.
      2. 얼어 붙은 파리를 꺼내 액체 질소에서 그들을 드롭하고 약 10 분 동안 거기에 파리를 유지합니다. 소용돌이 또는 몸에서 머리, 다리, 날개를 깨고 적극적으로 튜브를 흔들.
      3. 맨 체에 혼합물을 부어 함께 두 체를 누른 상태에서 적극적으로 자체를 흔들. 체질 후, 몸은, 상단 체에 머물 머리를 바닥 체에 유지됩니다 비행, 다리, 날개, 및 다른 파편은 드라이 아이스로 떨어질 것입니다. 두 체를 분리하고 조심스럽게 차가운 박격포에 비행 머리를 전송할 수 있습니다.
   3. 플라이 헤드를 균질화
      1. 드라이 아이스 위에, 얼음에 prechilled 된 15 ㎖의 유리 다운스 조직 분쇄기로 가루를 전송 한 후, 분말 입자에 박격포와 유 봉 머리를 갈기.
      2. 헤드 시료 그것을 붓고 전후 분쇄기의 무게를 측정 한 후 얼마 헤드 SAMP보기 계산할르 무게. 플라이 헤드 6-15그램의 총 단백질의 발현 수준에 따라 조정 TAP 각 실험에 대해 충분할 것이다. 유봉 아래로 이동하는 것이 쉬운 때까지 가루에 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼 15 ㎖ (단계 2.2에 최적화 된 용해 버퍼)를 추가 한 다음 큰 간극 유 봉 치기. 항상 얼음에 유리 분쇄기를 유지합니다.
   4. TAP의 상층 액을 준비
      1. ~ 50,000 XG (4 ℃)에서 20 분 동안 고속 원심 분리기 튜브와 스핀에 균질를 전송합니다. 새로운 고속 원심 분리 관에 뜨는을 전송하고 원심 분리를 한 번 더 반복합니다.
      2. 초원 심 분리기 튜브에 뜨는을 전송하고 더 뜨는을 취소 40 분 ~ 25 XG에 스핀을 수행합니다. 상등액을 원심 분리 후 탠덤 친화 정제 과정에 대한 준비가되어 있습니다.

3. TAP 정화

다음 섹션은 Séraphin 실험실 TAP에서 파생 된 protocol ¹² (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )

1. IgG의 구슬 친화력 정화를 수행
   1. 샘플을 원심 분리하는 동안의 IgG 세 파로스 비드를 준비합니다. 10 ㎖ 차가운 IgG를 세척 버퍼 15 ML 팔콘 튜브에 400 ㎕의 IgG의 구슬 배를 씻으십시오. 각 세척을 위해, 2 분 동안 부드럽게 튜브를 흔들어 다음 다른 2 분 동안 1,000 XG에서 비즈를 스핀 다운. 제 워쉬의 끝에서, 버퍼를 제거하고 튜브 만 비즈를 남긴다.
   2. 조심스럽게 IgG의 구슬을 포함하는 15 ML 튜브에 삭제 상층 액 (~ 15 ㎖)에 전송합니다. 2 시간 동안 nutator에 4 º C에서 구슬과 뇌 해물 믹스를 품어.
   3. 냉장실에 약 15 ml의 총 부피와 깨끗하고 빈 마이크로 열을 설정합니다. 꾸준히 열에 믹스를 부어 IgG의 비드 혼합물을로드, 트랩을하지 않도록 노력공기는 열을 내부에 거품. 구슬이 천천히 중력 흐름에 의해 배출 열 버퍼에 정착 할 수 있습니다.
   4. 뇌 해물 모두가 해결의 IgG 칼럼을 통해 유입 된 후 차가운 IgG의 세척 완충액 10 ㎖로 철저하게 열을 씻으십시오. 세척의 배를 반복합니다. 참고 : 공기 비드를 건조하게하지 마십시오.
2. TEV 절단을 수행
   1. 세 번째 세척 후, 10 ㎖ TEV 절단 버퍼를 사용하여 열을 다시 씻는다. 이 단계는 TEV 절단 용 미끼 복잡한 sequestrates IgG의 구슬을 준비합니다.
   2. TEV 버퍼의 마지막 한 방울은 밖으로 물방울의 흐름을 차단하는 열의 하단에 모자를 쓰고, 열 TEV 효소의 130 단위를 함유하는 1.3 ml의 TEV 버퍼를 추가 한 다음 안전하게의 상단 캡에 대한되기 직전에 열. 열이 양쪽에 잘 밀봉되어 있는지 확인합니다.
   3. TEV 효소가 TEV 사이트에서 펩티드를 절단 및 단백질 복잡한 WHI을 해제 할 수 있도록 2 시간 동안 18 º C의 열을 회전르 단백질 뒤에 IgG의 세파 로스 구슬에 결합 도메인 펩타이드를 떠나.
3. 칼 모듈 린 구슬 친화력 정화를 수행
   1. IgG의 구슬이 TEV 효소 배양하는 동안 칼 모듈 린의 구슬을 준비합니다. 버퍼를 바인딩 차가운 칼 모듈 린의 10 ㎖로, 15 ㎖의 팔콘 튜브의 3 배의 각 시간을 200 ㎕의 칼 모듈 린의 구슬을 씻으십시오. 각 세척을 위해, 부드럽게 nutator에 2 분 동안 튜브를 흔들어 다음 2 분 동안 1,000 XG에서 비즈를 스핀 다운. 세 번째 세척의 끝에서, 모든 버퍼를 꺼내 튜브 만 구슬을 떠난다.
   2. TEV 배양 (단계 3.2.3)의 끝에서 다시 차가운 방에 IgG의 열을 반환하고 똑바로 설정합니다. 구슬이 10 분 동안 정착하자.
   3. 상단 캡 다음 하단 캡을 제거하고 15 ML 팔콘 튜브에 1.3 ㎖의 TEV 절단 제품을 수집합니다. 버퍼가 완전히 비워집니다. 열 죽은 볼륨을 밀어 열을 추가로 200 ㎕의 TEV 버퍼를 추가, F를 수집같은 튜브 낮은 아웃.
   4. 상기 수집 된 1.5 ㎖의 TEV 절단 제품에 버퍼와 4.5 ㎕의 1 M _{염화칼슘을} 결합 칼 모듈 린의 4.5 ML을 추가합니다. _{염화칼슘은} TEV 버퍼에 EDTA를 적정하는 역할을한다. 칼 모듈 린의 구슬이 들어있는 튜브에 6 ml의 혼합물을 전송하고 1 시간 동안 nutator에 4 º C에서 튜브를 회전합니다.
   5. 냉장실에 약 10 ml의 총 부피와 다른 깨끗하고 빈 마이크로 열을 설정합니다. 열에 칼 모듈 린 비드 혼합물을로드하고 중력에 의해 배출 할 수 있습니다.
   6. 모든 솔루션이 정착 칼 모듈 린의 칼럼을 통해 유입 된 경우, 버퍼를 바인딩 차가운 칼 모듈 린의 10 ㎖로 열 두 번, 각각의 세척. 참고 : 칼 모듈 린의 구슬을 방해 방지하고 세척하는 동안 가능한 한 평면 구슬의 표면을 유지하려고합니다.
4. 칼 모듈 린 열에서 미끼 복잡한을 용출.
   마우스 오른쪽 단추로 세척 한 후, 200 ㎕의 차가운 Calmodu 다섯 분수와 칼 모듈 린 열을 용출린 용출 버퍼. 각 부분의 경우, 부드럽게 열 용출 버퍼 200 μl를 추가하고 표시 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브 용출액을 수집합니다. 이 배를 반복합니다.
5. SDS-PAGE에 의해 단백질 복합체를 분석
   1. 다섯 분수 (약 30 μL)의 각각에서 작은 나누어지는을 가지고 SDS 로딩 버퍼를 추가합니다. 5 분 동안 샘플을 삶아 구배 (4 % -15 %) SDS-PAGE 젤에있는 단백질 분자 마커와 시료를 나란히로드합니다.
   2. 샘플이 완전히 겔에서 해결 한 후 전기 영동을 중단하고 ¹³ 얼룩 '파란은'같은 G-250 기반의 민감한 콜로이드 쿠마시 염색 절차 젤을 얼룩. 그것은 이후의 질량 분석 분석과 완벽하게 호환되지 않기 때문에 염색은 바람직 선택 사항이지만이 아닙니다. 이러한 정제 된 단백질 복합체의 분자 신원을 폭로하기위한 질량 분석 등의 추가 분석을 위해 -80 ° C의 냉동고에 용출액의 나머지 부분을 저장합니다. SE전자 토론.

결과

여기에서 우리는 즉시 뇌에 Highwire 상호 작용하는 단백질을 식별하는 우리의 노력을 보여줍니다. Highwire (HIW)과 척추 동물과 무척추 동물 상동 신경계 ^(14)의 개발 및 수리를 조절 거대한 유비퀴틴 리가 제입니다. 그들은 고도의 보존 기능 영역의 번호를 공유 할 수 있습니다. 그러나, 그들의 분자의 행동은 완전히 명확하지 않습니다. 웜에 수행 한 작업은, 비행 및 마우스가 현재 작업 모델?...

토론

탠덤 선호도 정화 (TAP) 메서드는 두 개의 독립적 인 친 화성 정제 단계를 통해 분리 및 단백질 단지의 농축을 할 수있는 듀얼 정화 프로토콜을 제공합니다. TAP 태그의 디자인이 프로토콜에 제시되어 무엇에 한정되지 않고 버퍼 조건을 적절하게 조정하는 경우, 다른 단백질 결합 도메인 및 모티프도 적용 할 수 있습니다. 다른 TAP 태그의 좋은 예는 GS-TAP 태그, G 단백질의 조합 배양 포유 동물 세포 라...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.S.A. standard test sieve No. 25	Fisher Scientific	04-881-18
U.S.A. standard test sieve No. 40	Fisher Scientific	04-881-21
Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml	Kimble Chase	885300-0015
IgG sepharose beads	Pharmacia	17-0969-01
Econo-column 0.7 cm x 20 cm	Bio-Rad	737-4721
Econo-column 0.5 cm x 15 cm	Bio-Rad	737-4716
Calmodulin beads	Stratagene	214303
Coors Mortar and Pestle	CoorsTek	60311
AcTEV Protease	Invitrogen	12575-015
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Protease Inhibitor Mix	Sigma	P8340