Определение белок-белковых взаимодействие в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Взрослые Главы по Tandem аффинной очистки (TAP)

Резюме

Drosophila славится своей мощной генетической манипуляции, но не для его пригодности углубленного биохимического анализа. Здесь мы представляем процедуру TAP основе для выявления взаимодействующих партнеров любого интересующего белка с лету мозга. Эта процедура может потенциально привести к новым бульварам исследования.

Аннотация

Генетические экраны, проведенные с использованием дрозофилы (плодовой мухи) сделали многочисленные вехой открытия в заранее биологических наук. Тем не менее, использование биохимических экранов, направленных на расширение знаний, полученных от генетического анализа была изучена лишь недавно. Здесь мы опишем метод, чтобы очистить белковый комплекс, который ассоциируется с любого интересующего белка от взрослых мух голов. Этот метод использует системы дрозофилы GAL4/UAS выразить приманки белка, слитого с тегом Тандем Affinity Очистка (ТАР) в лету нейронов в естественных условиях, а затем реализует два раунда очистки с использованием процедуры TAP похожий на тот, первоначально закрепленной в дрожжи ^1, чтобы очистить взаимодействующих белкового комплекса. В конце этой процедуры, смесь нескольких белковых комплексов получается, молекулярная идентичность может быть определена путем масс-спектрометрии. Проверка кандидата белков выиграют от гesource и простота выполнения с потерей функции исследования в мух. Аналогичные подходы могут быть применены к другим мухи тканей. Мы считаем, что сочетание генетических манипуляций и этого протеомного подхода в лету модельной системы имеет огромный потенциал для решения фундаментальных проблем в области нейробиологии и за ее пределами.

Введение

Определение молекулярных путей и сетей, которые опосредуют особую биологический процесс является одним из конечных целей биомедицинских исследований. Fly генетики значительной степени зависят от форвардных генетики, особенно модификатора генетические экраны (как энхансерные и экраны супрессоры), выявить факторы, которые работают вместе, параллельно с или до или после интересующего гена. Тем не менее, вперед генетика экраны зачастую не в состоянии идентифицировать существенные гены, которые, когда мутировал, вызвать летальность на ранних стадиях развития, или гены с функциональной избыточности и компенсации которого потеря функции только вызывают тонкие дефекты, которые трудно забить. Одним из способов преодоления этой трудности является для выявления прямых белок-белковых взаимодействий. На протяжении более чем десяти лет, растущий список биохимическими методами, в том числе дрожжей двухгибридной фагов, химической сшивки, со-IP, Tandem аффинной очистки (TAP) и др. были использованы для исследования белок-белковых взаимодействий. Каждый из этих подходов имеет свой собственный набор сильных и слабых сторон в отношении чувствительности и специфичности. Среди них, метод TAP позволяет для обнаружения физического взаимодействия в ближней физиологических условиях, сохраняет специфику и последовательности ² и включает в себя возможность расширения до высокой пропускной анализирует ^3,4.

Метод TAP был первоначально разработан в дрожжах путем Rigautand коллегами ^1. В этом методе, представляющий интерес белок экспрессируется с краном тега. TAP тег таит два независимых сродством-связывающие домены: белок доменов, который связывается с IgG и калмодулин-связывающий домен. Две области отделены друг от друга TEV (табак) травления Вирус сайта расщепления. Такое сочетание позволяет два независимых раунда сродства очисток, чтобы значительно уменьшить неспецифические привязки и обогатить конкретных привязок ^1. Для этого, например, метод ТАР является очень мощным метод определить в естественных условиях взаимодействия данного белка, хотя гиперэкспрессией экзогенного белка может сделать его более склонны связывать с белками, которые обычно не комплекс с эндогенным коллегой. С момента своего развития, метод ТАР был применен во многих других системах, в том числе клеточных культур на основе систем ^5,6 и других в естественных условиях модельных систем ^6-9. Здесь мы опишем адаптации метода TAP у дрозофилы. Сначала генерировать pUAST-NTAP и pUAST-CTAP векторы для облегчения клонирования и слияние ТАР тега или к N-или C-конце гена. UAS-TAP-меченый трансген затем выразили в нервной системе под контролем нейронов водителя GAL4 ^10. Далее, большое количество взрослых мух головок будут собраны, которые имеют высокое содержание нервных клеток и их легко отделить от других частей тела после замораживания на основе различия в размерах. Взрослые руководители гомогенизируют и очистили бу последовательные центрифугирования и супернатант подлежит процедуре TAP, описанным ниже.

протокол

1. Создать БАС-тук-тегами Трансгенные Мухи

1. Создать pUAST-тук-тегами конструкции ДНК.
   1. Решают, какая сторона (N-или С-конец) белка приманки TAP тег должен быть слит с, на основе структуры / функции белка. См. обсуждение для более подробной информации.
   2. Субклонировани кодирующей области кДНК гена интереса в нескольких сайтах клонирования (MCS) векторов pUAST-NTAP или pUAST-CTAP генерировать N-или С-концевой-метками UAS-TAP трансгены, соответственно. См. рисунок 1 для подробными картами и используемых сайтов рестрикции и рамок считывания.
2. Создать БАС-тук-тегами трансгенных мух.
   1. Генерация трансгенных мух в соответствии со стандартными протоколами с использованием P-элемент опосредованного вставку ^11. Количество впрыска услуг являются коммерчески доступными.
   2. Cross нейронов драйвер GAL4 (т.е. BG380-GAL4) для каждого отдельного трансгенной линии и определить уровни экспрессии белкакаждой строки методом вестерн-блоттинга (с пероксидазой анти-антителом пероксидазы) и / или (с иммунным окрашиванием анти-антителом TAP). В общем, трансгенной линии с уровнем белка выражение, близкое к эндогенного белка рекомендуется для процедур TAP. См. обсуждение для более подробной информации.
   3. PerformGAL4/UAS-based спасательных эксперименты, чтобы подтвердить функциональность TAP-меченый трансгенов, если с потерей функции мутанты генов, представляющих интерес доступны. Выберите трансген, которые могут существенно спасти мутантные фенотипы для следующих экспериментов TAP.

2. Подготовка образцов для процедуры TAP

1. Создать лету запас, который несет как нейронный драйвер GAL4 (например BG380-Gal4) и выбранный TAP-меченый трансген в целях облегчения расширение образцов мухи. Соберите F1 потомство водителя GAL4 и УАС-трансген крестом в редких случаях, когда указанное сочетание вызывает выживания и роста недостаток.
2. Соберите образцы малого масштаба и оптимизации лизиса условие растворения TAP-меченый белок.
   1. Сделать серию лизиса буферов, используя комбинацию из неионогенных моющих средств NP-40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%) и Triton X-100 (0,05-0,5%). См. Таблицу 1 и обсуждение для получения дополнительной информации.
   2. На вершине слой CO2, используйте # 5 щипцы препарировать 20 взрослых головы от TAP трансгена, выражающей мух и собирать их в 1,5 мл трубки, чтобы проверить каждое условие лизис буфера.
   3. Добавить 100 мкл тестирование буфер для лизиса к трубе и гомогенизации головы поглаживая вверх и вниз с пластиковой пестиком, затем добавить еще 100 ул тестирования буфер.
   4. Вращайте головой лизата на 21 500 мкг в течение 10 мин (4 ° C), и отделить супернатант и осадок после центрифугирования. Добавьте 25 ул 2x SDS загрузки буфера к осадку и 10 мкл 4x SDS буфера для загрузки до 30 мкл супернатанта соответственно.
   5. Отварить два образца в течение 5 мин и анализировать их бокСтороны с помощью SDS-PAGE и последующего Вестерн-блот с PAP антитела. Определение растворимости отношением уровней TAP-белка в надосадочной жидкости против таблетки.
3. Подготовка образца в крупном масштабе
   1. Развернуть и собирать взрослых мух.
      1. Развернуть акции neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene в бутылках и флип бутылки каждые 3 дня до накопительных 250 бутылок используются для коллекции.
      2. Соберите 1-3 дней для взрослых летит в 50 мл конические пробирки, положить трубку в жидком азоте сразу глубокой заморозки мухи. Храните мух в -80 ° C морозильник. Следует отметить, что объем мух не должна превышать 2/3 от 50 мл пробирку.
   2. Сбор летать головы (выполнить этот шаг на вершине пудрой сухого льда).
      1. Выньте prechilled сита и ступку и пестик от -80 ° C морозильник и положить их на сухом льду, в идеале в большом ведерке со льдом. Стек два США Стандартный сита с № 25 по гое верхней и № 40 в нижней части.
      2. Возьмите замороженные мух, и бросить их в жидком азоте и мух в там в течение приблизительно 10 мин. Vortex трясите трубы энергично ломать головы, ноги и крылья из тел.
      3. Вылейте смесь в верхнее сито, а затем встряхнуть сита энергично, удерживая обе сита вместе. После просеивания, тела будет оставаться на верхнее сито, летать руководители будут сохранены на нижней сито, и ноги, крылья, и другой мусор упадет на сухом льду. Отделите одну сита и осторожно перенести лету головы холодной раствора.
   3. Гомогенизируют лету головы
      1. В верхней части сухого льда, шлифуют головки с ступке пестиком и к порошкообразных частиц, а затем перенести порошка в 15 мл стеклянный Даунса тканевую мельницу, которая была prechilled на льду.
      2. Измерьте веса мясорубку до и после образец глава выливали в него, а затем подсчитать, сколько с головкой SAMPле весит. В общей сложности 6-15 граммов мух головок будет достаточно для каждого отвода эксперимента регулировочного соответственно до уровней экспрессии белка. Добавить 15 мл ледяной буфере для гомогенизации (лизис буфера оптимизированы в шаге 2.2) в порошок, а затем ход с большим зазором пестиком, пока это не легко для пестиком, чтобы пойти вверх и вниз. Держите стекла дробилку на льду во все времена.
   4. Подготовка супернатант для TAP
      1. Передача гомогената в высокоскоростном центрифужную пробирку и спина в течение 20 мин при 50000 х г ~ (4 ° С). Передача супернатант в новую высокоскоростной центрифуге трубки и повторите центрифугирования еще раз.
      2. Передача супернатант в ультрацентрифужную пробирку и выполнить 40 мин ~ 250 000 XG спина для дальнейшего очистить супернатант. Верхний слой готов к процедурам очистки тандем сродства после ультрацентрифугированием.

3. TAP Очистка

В следующих разделах были получены из лаборатории ПТК Seraphin protocol ¹² (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )

1. Выполните IgG шарик аффинной очистки
   1. Подготовка IgG на сефарозе шарик в то время как образцы центрифугируют. Вымойте 400 мкл IgG 3x шарик в 15 мл трубки Сокол с 10 мл холодной IgG промывочного буфера. Для каждого мытья, рок трубку осторожно в течение 2 мин, а затем спин вниз бисером на 1000 мкг в течение еще 2 мин. В конце третьей промывки, удаления буфера и оставить только шарики в трубке.
   2. Тщательно передачи очищенный супернатант (~ 15 мл) в 15 мл пробирку, содержащую шарики IgG. Инкубируйте бисером и мозг лизата смесь при температуре 4 ° С на nutator в течение 2 часов.
   3. Настройка чистый и пустой микро колонки около 15 мл общий объем в холодной комнате. Загрузите шарик смесь IgG на стабильно заливки смеси в колонне; стараюсь не ловушка любойпузырьки воздуха внутри колонны. Разрешить шарики, чтобы обосноваться в столбце и буфером медленно стекать самотеком.
   4. Промывают колонку тщательно с 10 мл холодного промывочного буфера IgG в конце концов из лизата мозга текла через колонку урегулированы IgG. Повторите мыть 2 раза. Примечание: никогда не позволяйте шарик сухой в воздухе.
2. Выполните TEV расщепление
   1. После третьей промывки, промывки колонки снова 10 мл TEV буфера расщепления. Этот шаг готовит шарик IgG, что sequestrates приманки комплекс для TEV декольте.
   2. Непосредственно перед последней капли TEV буфера составляет около капать из, положить крышку в нижней части колонны, чтобы блокировать поток, добавьте 1,3 мл буфера, содержащего TEV 130 единиц TEV фермента на колонку, и затем надежно ограничить верхнюю столбец. Убедитесь, что колонка запечатан хорошо на обоих концах.
   3. Поворот колонку при 18 ° С в течение 2 часов, чтобы позволить фермент TEV в отщепления пептида в TEV сайт и отпустить белковый комплекс бееле оставив белка Доменное пептид, связанный с бисером в IgG сефарозе.
3. Выполните кальмодулином шарик аффинной очистки
   1. Подготовка шарики кальмодулина в то время как IgG гранулы инкубировали с ферментом TEV. Промыть 200 мкл кальмодулина шарики в 15 мл трубки 3x Falcon, каждый раз с 10 мл холодного буфера связывания кальмодулина. Для каждого мытья, аккуратно раскачивать трубку в течение 2 мин на nutator, а затем спин вниз бисером на 1000 мкг в течение 2 мин. В конце третьей промывки, вынуть все буфера и оставить только шарики в трубке.
   2. В конце инкубации TEV (шаг 3.2.3), вернуть колонку IgG назад в холодной комнате и установить его прямо вверх. Пусть шарики урегулировать в течение 10 мин.
   3. Снимите верхнюю крышку, а затем нижнюю крышку, а затем собрать мл TEV продукт расщепления 1,3 в 15 мл трубки Сокол. Дайте воде стечь буфер полностью. Добавить дополнительный буфер 200 мкл TEV в колонну вытолкнуть мертвый объем колонки, собирают енизким в той же пробирке.
   4. Добавить 4,5 мл кальмодулина обязательные буфер и 4,5 мкл 1 М CaCl ₂ в 1,5 мл TEV продукта расщепления собранной выше. CaCl ₂ служит для титрования ЭДТА в буфере ТэВ. Передача смеси 6 мл на пробирку, содержащую шарики кальмодулина и поворачивать трубу в 4 ° С на nutator в течение 1 часа.
   5. Установите другой чистый и пустой микро колонку с примерно 10 мл общего объема в холодном помещении. Загрузите шарик смеси кальмодулином в колонну и позволить ей стечь самотеком.
   6. Когда весь раствор текла через колонку урегулированы кальмодулина, промывки колонки два раза, каждый с 10 мл холодного буфера связывания кальмодулина. Примечание: не беспокоить бусинки кальмодулином и попытаться сохранить поверхность шариков как можно более плоскими во время стирки.
4. Элюции приманки комплекс из колонки кальмодулином.
   Сразу после мытья, элюируют колонку кальмодулином с пятью фракциями 200 мкл холодного Calmoduлин элюирования буфера. Для каждой фракции, осторожно добавить 200 мкл буфера для элюции в колонке и сбора элюата с заметно 1,5 мл пробирку Эппендорфа. Повторите эту 4x.
5. Анализ белкового комплекса в ДСН-ПААГ
   1. Возьмем небольшую аликвоту из каждого из пяти фракций (примерно 30 мкл) и добавляют SDS буфера для загрузки. Отварить образцы в течение 5 мин и загрузить образцы бок о бок с белковыми молекулярных маркеров в градиентом (4-15%) SDS-PAGE гель.
   2. После того, как образцы были полностью решены в геле, остановить и электрофореза гель окрашивают с любыми G-250 на основе чувствительных коллоидных методы окрашивания Кумасси, таких как "голубой" серебра окрашивания ^13. Окрашивание серебром является обязательным, но не является предпочтительным, поскольку он не полностью совместим с последующим масс-спектрометрического анализа. Хранить остальную часть элюата в -80 ° C морозильник для дальнейшего анализа, таких как масс-спектрометрии для раскрытия молекулярные личности очищенного белкового комплекса. Seэ обсуждение.

Результаты

Здесь мы показываем, наши усилия в выявлении Highwire-взаимодействующих белков в летучей мозга. Highwire (HIW) и его позвоночных и беспозвоночных гомологов огромные убиквитин лигазы, которые регулируют развитие и ремонт нервной системы ^14. Они имеют ряд высоко консервативных функциональны...

Обсуждение

Метод Тандем аффинной очистки (ТАР) предлагает двойной протокол очистки, который позволяет выделение и обогащение белковых комплексов через два независимых стадий очистки близость. Конструкция TAP тега не ограничивается тем, что представлено в данном протоколе, других белковых связыв?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.S.A. standard test sieve No. 25	Fisher Scientific	04-881-18
U.S.A. standard test sieve No. 40	Fisher Scientific	04-881-21
Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml	Kimble Chase	885300-0015
IgG sepharose beads	Pharmacia	17-0969-01
Econo-column 0.7 cm x 20 cm	Bio-Rad	737-4721
Econo-column 0.5 cm x 15 cm	Bio-Rad	737-4716
Calmodulin beads	Stratagene	214303
Coors Mortar and Pestle	CoorsTek	60311
AcTEV Protease	Invitrogen	12575-015
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Protease Inhibitor Mix	Sigma	P8340